Enzymy restrykcyjne i

reakcja łańcuchowa

polimerazy (PCR)

-zastosowanie w

biotechnologii

Enzymy restrykcyjne i

reakcja łańcuchowa

polimerazy (PCR)

-zastosowanie w

biotechnologii

• rozcinają DNA na krótkie kawałki w miejscu

określonych sekwencji, w odróżnieniu od większości
metod enzymatycznych, fizycznych, chemicznych, w
wyniku których DNA jest przecinane w miejscach
dowolnych;

• naturalnie występują u bakterii i sinic, stanowiąc

element tzw. systemu "restrykcji-modyfikacji". System
ten chroni komórkę przed wnikaniem obcego DNA (np.
DNA bakteriofagów);

• występują tylko w tych komórkach, które mają enzym

towarzyszący, zdolny do metylowania DNA
gospodarza. Dzięki temu DNA gospodarza nie jest
rozkładany przez własne enzymy restrykcyjne,
natomiast trawiony jest obcy, niezmodyfikowany DNA.

Enzymy

restrykcyjne:

Enzymy

restrykcyjne:

Każdy enzym
restrykcyjny
rozpoznaje i
przecina w
dwuniciowym
DNA sekwencję o
długości 4-7 par
zasad. Takie
przecięcie DNA
dają w wyniku
tępe końce lub
końce
nakładające się,
czyli końce
lepkie, zależnie
od mechanizmu
cięcia, jakim
posługuje się
enzym.

Nazwy enzymów restrykcyjnych pochodzą od
nazwy bakterii, z której zostały wyizolowane.

Lepkie końce - krótkie odcinki
jednoniciowego DNA
komplementarne do siebie. Dzięki
komplementarności mogą się one
bardzo łatwo rozpoznać i ponownie
utworzyć fragment dwuniciowy, co
umożliwia ligowanie DNA
pochodzących nawet od bardzo
różniących się gatunków
Tępe końce - obie nici rozcięte są
naprzeciwko siebie, nukleotydy na
końcach są sparowane z
komplementarnymi nukleotydami
na przeciwnej nici

• Fragmenty restrykcyjne, które powstają po

przecięciu DNA enzymem restrykcyjnym,
rozdziela się za pomocą elektroforezy
żelowej. Do rozdziału większych fragmentów
DNA stosuje się żel agarozowy, a do małych
żel poliakrylamidowy.

• Wielkość fragmentów restrykcyjnych określa

się przez porównanie drogi migracji tych
fragmentów z drogą migracji fragmentów
wzorcowych. DNA po elektroforezie wykrywa
się w żelu przez wybarwienie go bromkiem
etydyny.

• Następnie, aby sprawdzić miejsce rozcięcia

cząsteczki DNA przedstawia się ją na mapie
restrykcyjnej. Polega to na określeniu miejsc
rozpoznawanych przez różne enzymy
restrykcyjne, a także odległości między nimi.

• Restryktazy przecinają najczęściej DNA w

obrębie sekwencji palindromowych, czyli
takich w których sekwencja jednej nici jest
taka sama jak sekwencja nici
komplementarnej, czytana w przeciwnym
kierunku.

Zastosowa

nie

Zastosowa

nie

1. Tworzenie

map

restrykcyjnych

1. Tworzenie

map

restrykcyjnych

2. Klonowanie

i obróbka DNA

2. Klonowanie

i obróbka DNA

3.Badanie polimor

fizmu miejsc

restrykcyjnych

(RFLP

)

3.Badanie polimor

fizmu miejsc

restrykcyjnych

(RFLP

)

• (PCR) (ang. Polymerase Chain Reaction) –

to enzymatyczna metoda wielokrotnego
kopiowania dwupasmowego DNA, które
może stanowić np. sekwencję określonego
genu.

• Technika ta została wynaleziona w 1983

roku przez Kary’ego Mullisa, za którą w
1993 roku otrzymał nagrodę Nobla.

Reakcja łańcuchowa

polimerazy:

Reakcja łańcuchowa

polimerazy:

• 1. Etap denaturacji

– próbka DNA zostaje podgrzana

w temperaturze 95°C przez 15 sekund w celu rozplecenia
podwójnej helisy. Pękają wiązania wodorowe tworząc dwa
pojedyncze łańcuchy.

• 2. Etap annealingu

– następuje asocjacja primerów z

matrycą przebiegająca w obniżonej temperaturze (54°C)

• 3. Etap elongacji

– polimeraza DNA wydłuża primery

(w temperaturze 72°C) w obu kierunkach i syntezuje dwa
pasma komplementarne do dwóch pasm oryginalnych.

• Każdy cykl podgrzania i replikacji powoduje podwojenie

liczby cząsteczek DNA i jest powtarzany wielokrotnie. Po 20
cyklach otrzymujemy ponad milion cząsteczek
identycznych.

Przebieg reakcji:

Przebieg reakcji:

Początkowo w reakcji
PCR używano
polimerazy z E. coli.
Polimeraza ta była
jednak niszczona
przez każdy cykl
denaturacji cieplnej.
Zastąpienie jej
termostabilną
polimerazą DNA z
Thermus aquaticus
pozwoliło ominąć
problem z
wrażliwością enzymu
na temperaturę i
zautomatyzować
metodę PCR.

1. wykrywanie

czynników

zakaźnych,

zwłaszcza letalnych

wirusów

1. wykrywanie

czynników

zakaźnych,

zwłaszcza letalnych

wirusów

2. prenatalna

diagnostyka

genetyczna

2. prenatalna

diagnostyka

genetyczna

3. wykrywanie

polimorfizmu alleli

3. wykrywanie

polimorfizmu alleli

4. precyzyjne

typowanie tkanek do

transplantacji

4. precyzyjne

typowanie tkanek do

transplantacji

5. badania nad

ewolucją, z

wykorzystaniem

archeologicznych

próbek DNA

5. badania nad

ewolucją, z

wykorzystaniem

archeologicznych

próbek DNA

6. analizy RNA po

skopiowaniu RNA i

ilościowy pomiar

mRNA metodą tzw.

RT-PCR

6. analizy RNA po

skopiowaniu RNA i

ilościowy pomiar

mRNA metodą tzw.

RT-PCR

Zastosow

anie

Zastosow

anie