Enzymy restrykcyjne jako molekularne narzędzia do przeprowadzania badań

          Odkrycie możliwości enzymów restrykcyjnych pozwoliło na nowa jakość badaniach genetyki molekularnej. Wszystkie enzymy to składowe systemu restrykcji-metylacji. Jego przeznaczeniem jest ochrona komórki bakteryjnej przed zainfekowaniem DNA pochodzenia egzogennego. Za przykład niech posłuży system restrykcji i metylacji EcoRI. Jest to system obrony organizmu komórki bakteryjnej przed obcym DNA. W komórce bakteryjnej występują oba enzymy, to jest; metylaza EcoRI, oraz endonukleaza restrykcyjna EcoRI.

          Enzymy restrykcyjne (ang. restriction enzymes) są enzymami izolowanymi z bakterii, zdolnymi do rozpoznawania specyficznych sekwencji w DNA i przecinania dwuniciowej cząsteczki DNA. Ważną cechą produktów powstałych w wyniku trawienia DNA enzymami restrykcyjnymi jest to, że otrzymywane fragmenty DNA można rozdzielić na żelach w procesie elektroforezy. W ten sposób otrzymujemy obraz prążków żelu. W poszczególnych prążkach znajdują się cząsteczki DNA o identycznej sekwencji nukleotydowej. Dzięki temu możliwe stało się rozwiniecie technik badawczych pozwalających na precyzyjną obróbkę DNA.
          Poznane dotychczas enzymy restrykcyjne podzielono na trzy główne grupy. Enzymu klasy I są najbardziej skomplikowane pod względem budowy. Cecha charakterystyczna jest to, że po rozpoznaniu specyficznej dla siebie sekwencji enzymy te dokonują hydrolizy w pewnej odległości od rozpoznanego miejsca. Może to być nawet 1000 pz. Najbardziej przydatne w badaniach biologii molekularnej enzymy klasy II są jednostkami stosunkowo prostymi w budowie i hydrolizują nić DNA w miejscu rozpoznanej przez siebie sekwencji. Enzymy restrykcyjne typu II wymagają jako substratu dwuniciowej cząsteczki DNA, zawierającej, co najmniej jedną sekwencję rozpoznawaną przez dany enzym, oraz jonów magnezu. DNA zostaje przecięte w obrębie lub w okolicy sekwencji rozpoznawanej. Enzymy klasy III po rozpoznaniu miejsca specyficznego dla siebie dokonują cięcia w odległości około 25 pz od rozpoznanej sekwencji.

          Większość enzymów restrykcyjnych typu II rozpoznaje, palindromowe czyli posiadające oś symetrii, sekwencje cztero- lub sześcionukleotydowe są to tzw. enzymy czwórkowe lub szóstkowe. Nacięcia w obu niciach mogą leżeć naprzeciwko siebie i wówczas powstają, tzw. "tępe końce" (ang. bunt ends), np. enzym HaeIII z Haemophilus aegypticus rozpoznaje i przecina poniższą sekwencję, w wyniku, czego powstają "tępe końce".

          Z kolei enzym EcoRI pochodzący ze szczepu E.coli RY13 rozpoznaje sześcionukleotydową sekwencję, przecinając obie nici DNA tak, że powstają tzw. "lepkie końce" (ang. sticky ends) w postaci jednoniciowych czteronukleotydowych końców 5'.

          Niektóre enzymy produkują "lepkie końce", 3' które najczęściej składają się z 2 do 4 nukleotydów. Natomiast "lepkie końce" 5' to odcinki najczęściej od 2 do 6 nukleotydów. Wszystkie enzymy restrykcyjne pozostawiają grupę fosforanową na końcu 5', a grupę hydroksylową na końcu 3'. "Lepkie końce" mają duże znaczenie przy klonowaniu genów. Sekwencje "lepkich końców" powstałych w wyniku działania tego samego enzymu są komplementarne. W obecności enzymu ligazy można takie cząsteczki ponownie połączyć ze sobą kowalencyjnie. Nazewnictwo enzymów restrykcyjnych opiera się na literowych skrótach, w których pierwsza litera pochodzi od rodzaju bakterii, a druga i trzecia od gatunku. Następna litera oznacza szczep lub typ, natomiast kolejne enzymy z danego typu lub szczepu otrzymują liczby rzymskie. Enzymy pochodzące z różnych szczepów, ale rozpoznające te same sekwencje DNA, nazywają się izoschizomerami. Sytuacje taką mamy w przypadku enzymów HpaI, HpaII, MspI i BsuF, wszystkie one rozpoznają i hydrolizują sekwencje CCGG.
          Zdarza się, że dwa enzymy wytwarzają takie same "lepkie końce", mino, że rozpoznają różne sekwencje DNA. Enzym BamHI produkuje końce GATCC rozpoznając sekwencję GGATCC, zaś enzym BglII, wytwarzający takie same "lepkie końce", rozpoznaje sekwencję AGATCT. Dzieki temu możliwe jest klonowanie DNA strawionego BamHI w wektorze strawionym BglII, ale mieć na uwadze trzeba, że nie każdy sklonowany odcinek DNA będzie mógł być wycinany enzymem BglII. Enzym Sau3AI rozpoznaje z kolei sekwencji NGATCN, czyli również może stworzyć lepkie końce GATCC.

          Reakcje hydrolizy enzymami restrykcyjnymi polegają na odpowiedniej inkubacji analizowanego DNA i wybranych enzymów. Do pojedynczej reakcji trawienia używa się zwykle 0,2 - 1 ug DNA w roztworze o objętości 20 ul lub mniejszej. Ilość enzymu w mieszaninie reakcyjnej nie powinna być większa niż 10%. Ilości te określa się według różnych wytycznych. Na przykład przy zanieczyszczonym preparacie DNA stosuje się większą ilość enzymów restrykcyjnych dochodząc do 20 jednostek enzymu na 1 ug DNA. Jednostka enzymu restrykcyjnego to taka jego ilość, która trawi kompletnie, 1 ug DNA faga l (ok. 50 kd) w czasie 1 godziny w 37^oC. Inkubację preparatów DNA z enzymami restrykcyjnymi prowadzi się w temperaturze 37^oC w czasie 1 godziny lub dłużej. Przerwanie reakcji, co zwykle nie jest konieczne można przeprowadzić przez termiczną inaktywację enzymu w warunkach 15 minut w temperaturze 65^oC lub dodając, EDTA pH 8.0 do końcowego stężenia 10 mM zachodzi wtedy chelatacja jonów magnezu. Szczegółowym źródłem informacji o enzymach restrykcyjnych oraz o ich termostabilności i wymaganiach, co do warunków reakcji są katalogi firm produkujących odpowiednie używane enzymy.
          Jeśli już otrzymaliśmy fragmenty DNA z tępymi lub lepkimi końcami to możemy również na tym etapie dzięki odpowiednim enzymom końce te modyfikować. Z tępego końca możemy zrobić lepki poprzez dołączenie dzięki enzymowi ligazie odcinków zwanych adapterami. Są to krótkie fragmenty DNA, które zakończone są z jednej strony tępo natomiast z drugiej posiadają lepki koniec. Wcześniej metylujemy genomowy odcinek DNA chroniąc go przed enzymami restrykcyjnymi, które wprowadzimy w kolejnych etapach a których celem będzie wytworzenie funkcjonującego lepkiego końca na fragmencie DNA dołączonym jako adapter. Jeżeli lepki koniec mający cofniętą nić 3` chcemy zamienić na koniec tępy to możemy to zrobić dzięki innemu enzymowi. Będzie to fragment Klenowa polimerazy DNA E.coli. Będzie tu jeszcze niezbędny komplet nukleotydów, z których enzym ten, dosyntetyzuje odcinki brakujące. Jeżeli w lepkim końcu cofnięta jest nić 5` to można go stępić wycinając wysunięty jednoniciowy odcinek DNA. Do tego procesu użyć można nukleazy S1 bądź też polimerazy I E.coli wykorzystując jej aktywność egzonukleolityczną 3` ->5`. Poniżej przedstawimy kilkanaście enzymów w tym oprócz restrykcyjnych kilka innych mających zastosowanie w biologii molekularnej.

Zastosowania :

• Konstrukcja map restrykcyjnych. Analizując na żelach produkty trawienia danego DNA różnymi enzymami restrykcyjnymi , stosowanymi pojedynczo , w kombinacjach oraz w ilościach wystarczających lub niewystarczających do pełnego strawienia preparatu , można ustalić wzajemne położenie i odległości pomiędzy sekwencjami rozpoznawanymi przez te enzymy. Mapa restrykcyjna to obraz cząsteczki DNA , na którym zaznaczone są miejsca rozpoznawane przez różne enzymy restrykcyjne z uwzględnieniem odległości między nimi wyrażonej w nukleotydach.

• Klonowanie i obróbka DNA. DNA pocięty enzymami restrykcyjnymi można poddawać ligacji z wektorem. W ten sposób tworzone są zrekombinowane plazmidy czyli plazmidy zawierające sklonowany DNA , który można później poddawać różnym manipulacjom przy użyciu odpowiednich enzymów restrykcyjnych.

• Badanie polimorfizmu miejsc restrykcyjnych (RFLP).