Endonukleazy restrykcyjne

– molekularne nożyczki

1869 Odkrycie DNA (Miescher).

1944 Funkcja DNA: przechowywanie informacji genetycznej (Avery)

1953 Podwójna helisa - odkrycie struktury DNA (Crick, Watson)

1955 Arthur Kornberg wyizolował polimerazę DNA

1966 Odczytanie kodu genetycznego (Khorana, Nirenberg i in.)

1966 Weiss i Richardson wyizolowali ligazę DNA

1974 Początek inżynierii genetycznej: przeniesienie genu do bakterii

(Boyer i in.)

Odkrycie enzymów restrykcyjnych

1962 r.

Arber i Dussoix

– wyjaśnili zjawisko restrykcji – ograniczenia

rozwoju fagów w

E. coli.

Zidentyfikowali endonukleazę,

która trawiła niechroniony ( o innym wzorcu metylacji) DNA.

Metylacja charakterystyczna dla gospodarza bakteryjnego

chroniła DNA przed restrykcją (trawieniem)

1968 r.

Arber i Linn

oczyścili enzym

EcoB

i wykazali jego działanie in

vitro. Enzym ten trawił DNA

E.coli

K ale nie trawil

E.coli

B

.

1968 r.

Smith, Wilcox, Kelly

(John Hopkins Univeristy) wyizolowali

pierwszy enzym II klasy i określili charakterystykę miejsca

rozpoznania dla

Hind

II

1972 r. Enzym ten został użyty do sporządzenia

pierwszej mapy

restrykcyjnej wirusa SV40 prez D. Nathansa

1978 r.

Nagroda Nobla dla Arbera, Smitha i Wilcoxa

za odkrycie

enzymów restrykcyjnych

Transformation

Klonowanie genu ludzkiej insuliny i produkcja

zrekombinowanej insuliny w bakteriach

Enzymy restrykcyjne

to endonukleazy

–

przecinają szkielet cukier-fosforan w DNA

Podział enzymów restrykcyjnych na klasy I, II i III

Główna różnica dotyczy enzymów

II klasy

, gdzie system restrykcji jest

oddzielony od systemu metylacji

.

W klasie I i III te dwie aktywności są w obrębie jednego kompleksu
enzymatycznego, złożonego z dwóch lub trzech heterologicznych
podjednostek.

Enzymy poszczególnych klas różnią się także wymaganiami co do kofaktorów

Enzyme Organism from which derived

Target sequence
(cut at *) 5' -->3'

Ava I

Anabaena variabilis

C* C/T C G A/G G

Bam HI

Bacillus amyloliquefaciens

G* G A T C C

Bgl II

Bacillus globigii

A* G A T C T

Eco RI

Escherichia coli RY 13

G* A A T T C

Eco RII

Escherichia coli R245

* C C A/T G G

Hae III

Haemophilus aegyptius

G G * C C

Hha I

Haemophilus haemolyticus

G C G * C

Hind III

Haemophilus inflenzae Rd

A* A G C T T

Hpa I

Haemophilus parainflenzae

G T T * A A C

Kpn I

Klebsiella pneumoniae

G G T A C * C

Mbo I

Moraxella bovis

*G A T C

Mbo I

Moraxella bovis

*G A T C

Pst I

Providencia stuartii

C T G C A * G

Sma I

Serratia marcescens

C C C * G G G

SstI

Streptomyces stanford

G A G C T * C

Sal I

Streptomyces albus G

G * T C G A C

Taq I

Thermophilus aquaticus

T * C G A

Xma I

Xanthamonas malvacearum

C * C C G G G

Nazewnictwo
(Smith i
Nathans)

Nazewnictwo
enzymów
restrykcyjnych
opiera się na
literowych
skrótach, w
których
pierwsza litera
pochodzi od
rodzaju bakterii,
a druga i trzecia
od gatunku.
Następna litera
oznacza szczep
lub typ, a
kolejne enzymy
z danego typu
lub szczepu
otrzymują
liczby rzymskie.

Endonukleazy restrykcyjne II klasy

•Posiadają rozdzieloną aktywność restryktazy i metylazy, ich geny zwykle
sąsiadują w genomie

•Substratem jest dwuniciowe DNA -

dsDNA

(nieliczne enzymy mogą przecinać

określone sekwencje w jednoniciowym ssDNA).

•W większości przypadków enzymy przecinają obydwa pasma DNA w obrębie
krótkiej sekwencji (4 -12 nukleotydów), która nazywa się

miejscem rozpoznania

(recognition site).

•Większość miejsc rozpoznania jest

ścisłym palindromem

4, 5, 6, 7, 8 nt z

symetrią rotacyjną

.

Niekiedy palindrom może być przerwany przez serie 1-9 dowolnych nt
np. Sfi I GGCCNNNNNGGCC

Większość enzymów restrykcyjnych nie przecina zmetylowanego DNA na
jednym lub obu pasmach ich miejsca rozpoznania,

choć nieliczne wymagają

metylacji

•do aktywności in vitro bezwzględnie wymagają jonów magenzu

Długość sekwencji rozpoznawanej warunkuje
częstość trawienia DNA

np.: (zakładając że G+C = 50%)

enzymy z 8 nt sekwencją rozpoznania tną DNA co ok.. 65
kpz (slużą np. do konstrukcji bibliotek genomowych)

z 6 nt sekwencją rozpoznania tną DNA co 4096 bp (4

6

)

(wygodne do klonowania genów)

4 nt sekwencją rozpoznania trawioną DNA z częstością co
256 bp (4

4

) (tworzenie tzw. odcisków palca DNA –

fingerpinting)

Enzymy rzadkotnące

:

•Rozpoznają 7-8 nukleotydowe sekwencje np.:

SapI

5’- GCTCTTC -3’

Sgf1

5’- GCGATCGC -3’

•Enzymy, które rozpoznają sekwencje bogate w pary GC albo AT

SmaI

rozpoznaje 5’ – CCCGGG -3’, trawi co 78 kb;

NotI rozpoznaje

5’ –GCGGCCGC – 3’ , trawi co 10 MB

.

Niektóre enzymy pochodzące
z różnych bakterii rozpoznają
identyczne sekwencje, są to
tzw.

izoschizomery

i mogą

przecinać te sekwencje w
dokładnie taki sam sposób

Neoizoschizomery

– enzymy rozpoznające taką samą sekwencję, ale

przecinające ją w inny sposób.

Przykłady

:

SmaI

5’…CCC▼GGG…3’

XmaI

5’…C▼CCGGG…3’

SacI

5’…GAGCT▼C…3’

SstI

5’…GAGCT▼C…3’

EcoICRI

5’…GAG▼CTC…3’

Ecl136

5’…GAG▼CTC…3’

Lepkie końce

mogą być różnej długości (

zwykle są 2 lub 4 nt, ale

mogą być także 1 lub 3 nt

) i mogą mieć nadmierności typu 5’ lub 3’,

w zależności od użytego enzymu restrykcyjnego.

Mogą też tworzyć tępe końce

Trawienie enzymami restrykcyjnymi tworzy

wolne końce DNA

Większość enzymów trawi DNA generując końce z 5’- fosforanem lub
3’ –OH (wyjątek np.

Nci

I tworzy końce: 3’-fosforan i 5’-OH)

Jeśli lepkie końce są komplementarne,

ligaza

może je

łączyć

niezależnie od pochodzenia DNA,

tworząc formy rekombinacyjne.

Zastosowanie enzymów restrykcyjnych

1. Izolacja i identyfikacja genów
2. Rekombinowanie i klonowanie genów
3. Mapowanie fizyczne genomów
4. Diagnostyka (np. chorób) i identyfikacja (np.

ustalanie pokrewieństwa

Mapowanie restrykcyjne

Mapa restrykcyjna

zawiera dokładną lokalizację miejsc restrykcyjnych w

obrębie fragmentu (cząsteczki) DNA.

Najprostszą metodą jest trawienie próbek DNA pojedynczymi enzymami, a
następnie parami tych enzymów. Produkty trawienia są rozdzielane w żelu
agarozowym dla określenia wielkości fragmentów, a następnie odtwarza się
kolejność ułożenia enzymów danym fragmencie lub cząsteczce.

Pojedyncze trawienie zwykle mówi ile jest fragmentów restrykcyjnych w
badanym DNA, a podwójne trawienie mówi o kolejności i orientacji
fragmentów.

Warunkiem jest całkowite strawienie fragmentów.

Nakładanie się dwóch identycznych pod względem wielkości fragmentów jest
widoczne jako jaśniejsze świecenie.

Zastosowanie enzymów w diagnostyce

chorób genetycznych

Analiza polimorfizmu DNA

RFLP

–

restriction fragment length polymorphism.

Różnice w dłg.

fragmentów restrykcyjnych tworzonych po cięciu DNA restryktazami II
typu.
Wykrywa się głównie przez trawienie DNA amplifikowanego w reakcji
PCR i elektroforezę agarozową produktów reakcji (PCR-RLFP).

Polimorfizm restrykcyjny może być stosowany do oznaczania ojcostwa

Normalny gen globiny

Zmutowany gen globiny

___________________

___________________

____CTG

A

G_________ ______CTG

T

G_______

____GAC

T

C_________ _____ GAC

A

C_______

Trawienie enzymem Dde I

Elektroforeza agarozowa

Dwa

fragmenty o dłg:

Jeden

fragment o dłg. 376 bp

201 i 175 bp

Wykrywanie mutacji przy pomocy enzymów restrykcyjnych

np.: anemia sierpowata