ENZYMY RESTRYKCYJNE

Wykaz skrótów stosowanych w tekście: ER = enzymy restrykcyjne.

1. Wprowadzenie

1. Historia. Czyli całkiem ciekawe, ale niekoniecznie potrzebne do życia.

Enzymy restrykcyjne, znane także jako endonukleazy restrykcyjne, są odpowiedzialne za bakteryjny fenomen zwany kontrolowaną przez gospodarza modyfikacją restrykcyjną albo też modyfikacją fenotypową (cud, Panie, cud nad Wisłą!). Bakteriofagi (fagi) to wirusy, które infekują bakterię i przejmują dowodzenie nad syntezą kwasów nukleinowych gospodarza, aby replikować własny genom. Po namnożeniu kilku setek kopii, gospodarz jest zabijany, a fagi potomne - uwolnione. We wczesnych latach 50. Luria i jego ziomki zaobserwowali, że fagom, które łatwo infekowały jeden szczep bakterii, nie udawało się zrobić łysinki w hodowli innego szczepu - fag był ograniczony :P Jednakowoż (Pierwsze however!) ograniczenie nie było całkowite! Fagi oczyszczone z kilku łysinek, które pojawiły się na owym drugim szczepie, nie miały problemów z infekowaniem go, natomiast zatraciły zdolność do wzrostu na „macierzystym” szczepie.

W 1962, Albert i Dussoix zaproponowali model molekularny, wyjaśniający ów fenomen. Miał on polegać na tym, że pewne szczepy bakterii zawierają endonukleazy, które mogą przecinać niechronione DNA, inne zaś szczepy posiadają system modyfikacji, odpowiedzialny za ochronę ich własnego DNA. DNA fagów miało być także modyfikowane przez aparat replikacyjny gospodarza. Niechronione DNA jest degradowane przez endonukleazy, co ogranicza infekcję niezmodyfikowanym fagiem. Pewna mała część fagów jest replikowana i zmodyfikowana przez nowego gospodarza zanim nastąpi degradacja endonukleolityczna. Owe zmodyfikowane genomy fagowe będą mogły teraz replikować i infekować gospodarza, który uprzednio był oporny, ale z kolei utracą zdolność replikacji w pierwotnym gospodarzu, jako, że modyfikacja wprowadzona przez drugiego gospodarza nie chroni DNA faga przed endonukleazami gospodarza pierwszego. (Trochę to zagmatwane, ale w sumie logiczne).

W1968, Arber i Linn wykazali aktywność endonukleazy „restrykcyjnej” enzymu EcoB; zaś Meselson i Yuan oczyścili podobny enzym z E. coli K. Te enzymy miały zdolność cięcia DNA innych szczepów, ale nie - szczepów z których się wywodziły. Enzymy cięły DNA w losowych pozycjach, często daleko od miejsca restrykcyjnego. W 1970, Smith, Wilcox i Kelly opisali oczyszczanie oraz miejsca: rozpoznawane i miejsce cięcia bardziej użytecznego enzymu restrykcyjnego, HindII. Ciął on to samo miejsce, które rozpoznawał i został użyty przez kumpla Smitha, Daniela Nathansa, do pocięcia kolistego genomu małpiego wirusa 40 na 11 specyficznych fragmentów i do wygenerowania pierwszej mapy restrykcyjnej.

2. Rodzaje systemów restrykcji/modyfikacji, czyli tym już warto się zainteresować.

Systemy enzymatyczne restrykcji/modyfikacji (czy też restrykcji/metylacji) zostały podzielone na trzy kategorie: I, II i III (genialne, nieprawdaż?). Podstawowe różnice między nimi polegają na tym, że enzymy typu II zawierają osobne systemy restrykcji i metylacji, gdy tymczasem typu I i III posiadają zdolność restrykcji i metylacji w jednym, dwu- lub trzypodjednostkowym enzymie. Enzymy typu I i III są mniej powszechne i mniej znane, ale interesujące. Systemy typu II dostarczają znanych enzymów, dostępnych w sprzedaży i najużyteczniejszych dla biologii molekularnej. Zarówno enzymy restrykcyjne, jak i metylacyjne wymagają koniecznie magnezu do działania, a w genomach bakteryjnych przylegają one do siebie (znaczy chyba ich geny) we wszystkich przypadkach, jakie dotąd poznano. ER typu II mają krótką, często palindromową sekwencję rozpoznawaną. W przypadku podgrupy enzymów typu II, tzw. ER IIs, owe sekwencje również są krótkie, ale rzadko kiedy palindromowe. W takiej sytuacji enzym tnie zawsze jedną (a zwykle także i drugą) nić downstream miejsca rozpoznawanego, zamiast ściśle w nim.

3. Nazewnictwo

Odkrycie dużej ilości systemów enzymatycznych restrykcji/modyfikacji doprowadziło do utworzenia jednolitego nazewnictwa, zaproponowanego przez Smitha i Nathansa. Pierwsza litera nazwy określa rodzaj, do którego należy organizm produkujący enzym, zaś kolejne dwie mówią o jego gatunku. Ten trzyliterowy skrót zapisuje się kursywą, np. Escherichia coli = Eco. O szczepie lub typie mówi kolejna literka, już nie pochyła, np. EcoR. Gdy dany szczep produkuje więcej, niż jeden enzym, identyfikuje się je za pomocą cyfr rzymskich, np. BglI i BglII.

4. Miejsca restrykcyjne

ER rozpoznają specyficzne miejsca o różnej długości i różnym składzie zasadowym. Typowe miejsce restrykcyjne (dla enzymów typu II) jest dokładnym palindromem złożonym z 4-8 pz, obdarzonym symetrią obrotową lub osiową (np. miejsce dla EcoR I to GAATTC). Palindrom może być przerwany serią do 9 niespecyficznych nukleotydów (np. miejsce dla SfiI: GGCCNNNNNGGCC, gdzie N = jakakolwiek zasada). Pewne ER rozpoznają takie miejsca, które dopuszczają dwuznaczność w palindromie, np. AccI rozpoznaje GTMKAC, gdzie M=A/C a K=G/T. Inne ER z kolei nie wymagają sekwencji palindromowej do rozpoznawania miejsca specyficznego (ER typu IIs) i zwykle tną DNA w miejscu o określoną liczbę zasad oddalonym od rozpoznawanego (np. MboII rozpoznaje 5'...GAAGA...3' a tnie DNA 8pz w kierunku 3'od tego miejsca na jednej nici i 7pz w kierunku 5' na drugiej nici). Wiele enzymów nie tknie DNA, które ma zmetylowaną jedną albo obie nici w miejscu restrykcyjnym, chociaż jest kilka takich, które właśnie wymagają metylacji, by ciąć DNA.

Ilość i rozmiar kawałków tworzonych przez ER zależy od częstotliwości występowania miejsca restrykcyjnego w ciętym DNA. Zakładając, że G+C stanowią 50% zawartości genomu, czterozasadowe miejsce restrykcyjne występowałoby przeciętnie raz na 256pz, zaś sześcionukleotydowe miejsce - raz na 4 096pz; a ośmionukleotydowe - raz na 65 536pz. Zatem ER rozpoznające 4pz miejsce restrykcyjne (jak HaeIII) tną DNA na wiele małych kawałków. Znajduje to zastosowanie w fingerprintingu DNA. Z kolei enzymy rozpoznające 8pz miejsca, tną DNA na większe kawałki - użyteczne w klonowaniu i mapowaniu genomów. ER które rozpoznają 6pz miejsca używa się do klonowania w specyficznych regionach plazmidu, w które wbudowano unikalne miejsca zwane polilinkerami.

5. Końce generowane przez ER

Cięcie enzymami restrykcyjnymi może dać różne rodzaje końców. Zwykle zakończone są one 5'-fosoforanem i 3'-OH; jednak NciI tworzy końce 3'-fosforanowe i 5'-hydroksylowe. ER rozpoznające sekwencje palindromowe zwykle tną w taki sposób, by zostawić 5' albo 3' jednoniciowe wystające kawałki, albo tępe końce bez wystających zasad. ER nie rozpoznające sekwencji palindromowych zwykle przecinają DNA określoną ilość pz od rozpoznawanego miejsca i zostawiają 5' lub 3' wystające końce.

Wystające końce 3' lub 5' pozostawione przez ER mogą być poddane annealingowi i ligacji, jeżeli ich jednoniciowe wystające fragmenty są komplementarne. Te końcówki mają zwykle 2 albo 4 zasady, ale mogą też mieć 1 czy 3 nukleotydy długości. Generalnie, dłuższe, bogate w GC wypustki ligują wydajniej. Zarówno 3' jak i 5' lepkie końce można przekształcić w tępe z użyciem różnych technik enzymatycznych. Końce utworzone przez enzymy rozpoznające niejednoznaczne miejsca mogą łączyć się tylko z dokładnie komplementarnymi końcami drugiej przeciwległej nici. Tak więc AccI rozpoznaje GT(A/C)(T/G)AC, ale tylko GTCGAC może łączyć się z końcem ClaI. Enzymy typu IIs, tnące downstream od rozpoznawanego miejsca (np. FokI) pozostawią lepkie końce o niejednoznacznie zdefiniowanej sekwencji, które także mogą stwarzać trudności przy ligacji.

6. Endonukleazy kodowane przez intron (???)

Geny mitochondrialnego, chloroplastowego, jądrowego DNA i bakteriofagów T zawierają introny, kodujące nukleazy. Te endonukleazy tworzą w specyficznych miejscach dwuniciowe przerwy, całkiem jak enzymy restrykcyjne, ale owe sekwencje nie są chronione przed cięciem przez enzym/podjednostkę metylującą (nie wiem, co to ma do rzeczy). Takie sekwencje raczej uważa się za zaangażowane w przemieszczanie intronu w takie allele genu, które go nie posiadają (proces zwany „zasiedlaniem” - homing). Takie endonukleazy otrzymuje się raczej z eukariotów, niż z prokariotów (chyba z twojej starej). Miejsca przez nie rozpoznawane są długie. Wzory trawienia genomowego DNA wskazują na to, że w wielu przypadkach rozpoznawane przez endonukleazy sekwencje mają długość 10-12nt. Jako, że omawiane enzymy tną DNA na duże fragmenty, są użyteczne do mapowania genomów i tworzenia bibliotek genomowych.

2. Rozważania o matrycach DNA

1. Forma DNA

DNA używane powszechnie jako substraty dla trawienia ER obejmują plazmidowe DNA bakteryjne, DNA genomowe i DNA bakteriofaga λ. Nienaruszone wektory plazmidowe są koliste i zwykle wielkości około 3-10kpz. DNA i klony faga λ są wielkości około 48kpz i są linearne. Genomowe DNA ma wysoką masę cząsteczkową, jest liniowe i jego trawienie rządzi się własnymi prawami.

Sekwencje flankujące miejsca rozpoznawane i cięte przez ER mogą wpływać na tempo cięcia przez pewne enzymy, jak NaeI, HpaII, SacII, NarI czy EcoRII. Ten niekorzystny efekt, charakterystyczny dla tzw. powolnych/opornych miejsc, może być zniwelowany przez dodanie 1mM spermidyny i/lub oligonukleotydów by zwiększyć prędkość trawienia.

Plazmidowe DNA

W porównaniu z DNA linearnym, plazmidy bakteryjne w stanie nienaruszonym często wymagają większej ilości enzymu restrykcyjnego do całkowitego pocięcia DNA, z powodu jego (DNA oczywiście) superskręconej, zamkniętej kowalencyjnie, kolistej formy. DNA λ ma formę liniową, co jest ogólnie przyjętym standardem mierzenia i wyrażania aktywności jednostkowej wielu ER. Charakterystyczna dla plazmidów oporność na cięcie restrykcyjne może sprawiać kłopoty, gdyż dodawanie zwiększonej ilości enzymu do reakcji trawienia nie zawsze wychodzi na dobre. „Star activity” (trawienie miejsc innych, niż sekwencja rozpoznawana) BamHI i KpnI jest dobrym przykładem niekorzystnego efektu wynikłego z przegięcia z dodawaniem enzymu.

Produkty PCR

Produkty PCR mogą być trawione w obrębie zamplifikowanej sekwencji, albo w regionach odpowiadających użytym starterom. Wewnętrzne trawienie produktów PCR jest zwykle prostą procedurą, dopóki bierze się pod rozwagę zawartość molową miejsc cięcia. Krótkie produkty PCR z wieloma miejscami restrykcyjnymi będą wymagały więcej enzymu, niż długie produkty z nielicznymi miejscami cięcia. Ustalając oczekiwany czas i potrzebne stężenie enzymu, należy porównać zawartość molową miejsc cięcia posiadanego przez nas substratu z tą użytą do zdefiniowania stężenia w ulotce produktu.

Udane trawienie produktów PCR w pobliżu końców często stwarza takie same problemy, jak trawienie substratów oligonukleotydowych. Niektóre enzymy wymagają różnych ilości flankującego miejsce rozpoznawane DNA. Na przykład, trawienie enzymem SalI może nie być kompletne, nawet, jeżeli miejsce trawienia znajduje się 20pz od końca DNA. Jeżeli primer oligonukleotydowy zaprojektuje się tak, że miejsce cięcia będzie za blisko końca DNA, to po amplifikacji może ono być cięte w małym stopniu lub nawet wcale. Jako, że trudno jest badać miejsca cięcia znajdujące się przy końcu DNA, stwarza to wyjątkowy problem (masło maślane). Enzymy korygujące mogą dodatkowo komplikować sytuację, ponieważ lubią one degradować końce obu primerów i amplimerów (czyżby produktów amplifikacji?) podczas PCRa.

Oligonukleotydy

Jeżeli każdy oligonukleotyd zawiera jedno miejsce restrykcyjne dla enzymu, ogromne stężenie molarne owych miejsc w jednostce masy musi być skontrastowane (??) obecnością jakiegoś bardziej typowego substratu, jak DNA faga λ, zazwyczaj używane do określania jednostek aktywności ER. Jako, że definicja jednostki ER nie jest oparta na substratach oligonukleotydowych, a nawet nie na substratach z porównywalną ilością miejsc restrykcyjnych na jednostkę masy, więcej, niż jedna podjednostka enzymu będzie wymagana na każdy μg ciętych syntetycznych oligonukleotydów, aby cięcie zaszło do końca. Aby wykonać kompletne trawienie restrykcyjne, potrzebny będzie dłuższy czas i/lub większa ilość enzymu. Należy przy tym unikać enzymów, które łatwo „przedawkować”, szczególnie, gdy trawienie zostawia się na całą noc, gdyż mogą one wpływać niekorzystnie na substrat. Oligonukleotydy mają to do siebie, że trudno jest (lub też w ogóle nie można) trawić ich pewnymi enzymami, które wymagają długich sekwencji flankujących DNA, jak SalI.

Genomowy DNA

Trawiąc genomowy DNA należy rozważyć pewne ważne problemy, nie występujące powszechnie, gdy używamy innego typu DNA. Niektóre z nich to: metylacja, skala trawienia, stężenie DNA i miejsc specyficznych dla enzymu, jakość enzymów i obecność inhibitorów. Genomowy DNA często zawiera więcej zanieczyszczeń, niż inne, jak np. plazmidy. Najlepsze wyniki otrzymuje się, gdy stosunek absorbancji A₂₆₀/A₂₈₀ wynosi około 1,8. Dodanie spermidyny w stężeniu 1mM może poprawić trawienie, gdy genomowy DNA jest lipnej jakości. Acetylowana albumina z surowicy bydlęcej (BSA) może być dodana zamiast lub wraz ze spermidyną, tak, aby jej stężenie końcowe wynosiło 0,1mg/ml. Trawienie genomowego DNA powinno być prowadzone w objętości 50-200μl na każde 10μg DNA. Warte uwagi jest to, że wszystkie enzymy zachowują się tak samo w niekorzystnych warunkach. Jeżeli jakiś enzym tnie DNA genomowe, a inny nie, nie można zwalać za to winy na enzym, póki nie przeprowadzi się badań z odpowiednimi kontrolami.

2. Czystość DNA

Oprócz formy DNA, jego czystość jest kolejnym czynnikiem, który należy wziąć pod uwagę. Zależnie od metody oczyszczania i od tego, jak się obchodzimy z DNA, może ono zawierać różne ilości zanieczyszczeń, które wpływają na trawienie ER i na analizę. Zanieczyszczenia te mogą obejmować inne typy DNA, nukleazy, sole i inhibitory ER. W rezultacie możemy w ogóle nie uzyskać trawienia, albo też może być ono niekompletne, DNA może zostać zdegradowane, enzymy - wykazywać aktywność niespecyficzną, a wyniki mogą mieć małą powtarzalność. Zanieczyszczenia są zwykle wprost zależne od ilości materiału, co oznacza, że hamowanie będzie wzrastało wraz z objętością DNA dodanego do reakcji. Nukleazy degradują DNA i są zanieczyszczeniem widocznym na elektroforegramie jako smuga, albo jako straty DNA w porównaniu z próbą kontrolną.

Typowe trawienie restrykcyjne jest zwykle prowadzone z użyciem 0,2-1μg DNA. Jeżeli używa się więcej DNA, objętość reakcji i warunki elektroforezy muszą być dopasowane do tej ilości. Użycie ponad 1-2μg DNA w reakcji o objętości 20μl może prowadzić do dziwnych wyników, szczególnie, gdy DNA jest nieczyste (egzorcyzmy wtedy trzeba przeprowadzić) albo rozpuszczone w buforze zawierającym EDTA.

Próbki DNA zwykle przechowuje się w buforze Tris-EDTA (TE), gdyż EDTA poprzez chelatowanie kationów dwuwartościowych inaktywuje większość nukleaz, które są często są oczyszczane wraz z DNA i wymagają owych jonów do aktywności. Jednak, ER często również wymagają kationów dwuwartościowych do działania i jeżeli dodamy za wiele EDTA, to mogą odmówić współpracy. Małe stężenia EDTA (poniżej 0,05mM) wprowadzone do reakcji wraz z buforem zawierającym DNA, nie wpływają na aktywność enzymatyczną. Rozdział 5 zawiera więcej informacji o zanieczyszczeniach nukleazowych plazmidowego DNA i mówi też, co możemy zrobić, aby uchronić się przed tym problemem.

Miniprep DNA (sami sobie odpowiedzcie, ja nie wiem)

Jest wiele rozmaitych metod ekstrakcji i oczyszczania DNA plazmidowego na małą skalę. Różne metody typu „miniprep” (wyizoluj DNA w domowej kuchni!) różnią się jakością i powtarzalnością. Zanieczyszczenia jak fenol, chloroform, białka, alkohol i RNA będą niekorzystnie wpływały na enzymy restrykcyjne. W niektórych przypadkach, dodatek spermidyny (do stężenia końcowego 1mM) albo BSA (do 0,1mg/ml) może poprawić trawienie DNA niskiej jakości. Zanieczyszczone DNA może także zostać oczyszczone przez dodatkowe ekstrakcje rozpuszczalnikami organicznymi i/lub zwykłą chamską precypitacją z użyciem octanu amonu (stężenie końcowe: 2,5M) i 2 objętościami 100% etanolu. Octan amonu jest świetnym wyborem, gdy precypitujemy DNA, gdyż ma dużą rozpuszczalność w etanolu i jest lotny, co ułatwia jego usunięcie podczas suszenia próżniowego próbek DNA.

DNA zatopiony w agarozie

Próbki genomowego DNA do analizy na poziomie mega par zasad (bardzo duże fragmenty, wytworzone przez rzadko-tnące enzymy) są przygotowywane w postaci „korków” agarozowych, aby uchronić je przed mechanicznym połamaniem. Większość enzymów może ciąć DNA zatopione w agarozie, należy jedynie dodać ich więcej do reakcji i dać im więcej czasu.

Korki agarozowe należy przygotować do trawienia restrykcyjnego przez 1-2 godziny inkubacji w buforze TE, który jest kilkukrotnie zmieniany. Po zrównoważeniu (equilibration?..) w buforze TE, korki należy wsadzić do 1x stężonego buforu z enzymem restrykcyjnym i zostawić na 30-60 minut na lodzie. Następnie prowadzi się trawienie poprzez inkubację korka przez 3-6h w świeżym, 1x stężonym buforze zawierającym pożądaną ilość enzymu. Zalecenia do stosowania enzymów są zapewniane przez ulotkę Promegi, którą wkładają do wszystkich enzymów restrykcyjnych przeznaczonych do stosowania z genomowym DNA (GQ, Genome Qualified). Dobrym punktem wyjścia, jeżeli chodzi i stężenie enzymu, jest stosowanie 5-10 jednostek na μg DNA i unikanie enzymów, które łatwo przedawkować (wartość „przetrawienia” <20U).

Genomowe DNA z krwi

Antykoagulant, używany podczas pobierania krwi, może wpływać na zdolność ER do kompletnego trawienia DNA. Zaleca się używanie jako koagulantu EDTA, natomiast powinno się unikać stosowania heparyny. Stosunek A₂₆₀/A₂₈₀ genomowego DNA powinien wynosić minimum 1,8, co wskazuje na wydajne usunięcie białek. Opisano kilka procedur szybkiego oczyszczania DNA z krwi, które nie wymagają oddzielania białych krwinek od czerwonych. Te techniki dostarczają DNA, które dobrze się tnie, już przy użyciu małej ilości krwi, ale DNA otrzymany z większych ilości materiału może mieć gorszą jakość. Zatem dla większych próbek krwi zaleca się jednak oddzielenie krwinek różnych kolorów xP

III. Jakość enzymów restrykcyjnych

1. Ogólne rozważania

Substraty DNA trawione przez ER są analizowane pod kątem wzorów cięcia oraz wykorzystywane w klonowaniu, sekwencjonowaniu, znakowaniu lub hybrydyzacji. Ważnym jest, by te enzymy były pozbawione inhibitorów, a także wolne od aktywności zanieczyszczających, które mogłyby zakłócić interpretację wzorów cięcia, oraz wykorzystanie strawionych fragmentów DNA w dalszych reakcjach. Zanieczyszczająca aktywność endonukleazy może wpływać na liczbę, rozmiar i końce tworzonych fragmentów. Egzonukleazy mogą usuwać zasady zarówno z końców 5' jak i 3' ciętego DNA i redukować efektywność znakowania i ligacji w późniejszych reakcjach. Zanieczyszczenie fosfatazą także może zaburzyć wydajność łączenia fragmentów DNA podczas klonowania. Enzymy restrykcyjne Promega (nie ma to jak reklama...) są analizowane i oczyszczane pod kątem podobnych niechcianych aktywności.

Promega zapewnia użytkownikom informację o kontroli jakości każdego enzymu restrykcyjnego. Zrozumienie tych badań może pomóc badaczom w interpretacji danych zawartych w materiałach dostarczonych wraz z enzymem. Ma to pomóc w ominięciu typowych problemów. Trzy próby są przeprowadzane przez komercyjnych dostawców: aktywność, próba „przetrawienia”, oraz testy ligacji. Warunki (czas, temperatura, bufory substraty DNA) stosowane do testów mogą różnić się zależnie od dostawców enzymów, tak więc bezpośrednie porównanie produktów sprzedawców jest możliwe tylko wtedy gdy zostały zastosowane te same warunki. Należy zachować ostrożność podczas ekstrapolacji danych dostarczonych przez dostawcę na warunki, jakie mamy w danym eksperymencie. Dodatkowo do tych trzech typowych testów Promega prowadzi unikalne próby kontrolne dla pewnych grup enzymów restrykcyjnych: Blue/white cloning qualified, genome qualified oraz DNA typing qualified.

2. Testy kontroli jakości

Próba aktywności ER

Jedna jednostka aktywności ER jest definiowana jako ilość enzymu potrzebna do pocięcia 1ug substratu DNA w 60 minut w odpowiedniej temperaturze, buforze, w 50ul całkowitej objętości reakcji. Testy aktywności enzymów restrykcyjnych są przeprowadzane poprzez dodawanie różnych rozcieńczeń enzymu do odpowiednich buforów zawierających 1ug substratu DNA i 0.1mg/ml BSA. Po 60 minutowej inkubacji w odpowiedniej temperaturze, reakcja jest zatrzymywana poprzez dodanie 10ul „roztworu hamującego” (25% glicerol, 0.5% SDS, 50mM EDTA). Reakcje są potem sprawdzane poprzez elektroforezę w żelu agarozowym i wybarwianiu bromkiem etydyny + UV. Najbardziej rozcieńczony roztwór enzymu dający całkowicie strawiony produkt jest stosowany do wyliczenia aktywności w jednostkach na mikrolitr (U/ul).

Większość enzymów firmy Promega jest dostępna z aktywnością zawierającą się pomiędzy 8-12U/ul. Niektóre enzymy są bardziej rozcieńczone w związku z trudnościami produkcyjnymi związanymi z otrzymaniem bardziej stężonych roztworów. Inne enzymy są dostępne w wysokich stężeniach zawierających się pomiędzy 40 a 80U/ul. Te enzymy są często stosowane do trawienia większych ilości DNA lub DNA genomowego. Aktywność enzymów jest tak dopracowywana by spełniać specyfikacje ustalone przez departament jakości firmy Promega.

Ważną zmienną w jednostkach aktywności jest użyte DNA. Popularnymi substratami DNA są: fag lambda, adenowirus 2 (Ad2), małpi wirus 40 (SV40), bakteriofag T7 oraz różne plazmidowe DNA. Substraty wybierane do testów aktywności muszą dawać wyraźny sygnał diagnostyczny w postaci prążka oznaczającego niekompletne trawienie. Czasami DNA faga lambda cięte drugim enzymem jest używane jako substrat DNA do testów aktywności, by utworzyć częściowo strawione kawałki DNA, które na koniec rozdziela się i uwidacznia w żelu agarozowym.

Liczba miejsc (cięcia, chyba) na mikrogram DNA może się różnić zależnie od substratu. Na przykład, ApaI tnie DNA λ tylko raz, podczas gdy DNA adenowirusa 2 tnie dwanaście razy. Jeżeli jednostkowa aktywność ApaI zostałaby ustalona na podstawie cięcia DNA lambdy, użytkownik otrzymałby mniej enzymu w jednostce niż gdyby aktywność została ustalona na bazie Ad2. Enzymy mają różną szybkość cięcia w różnych miejscach, tak więc cięcie substratu zawierającego „wolniejsze” miejsca może potrwać dłużej, niż substratu bez „(po)wolnych” miejsc. I tak na przykład cięcie Ad2 wymaga ponad 5 jednostek SalI, pomimo tego, iż zawiera tylko jedno miejsce cięcia więcej niż lambda. Liniowe DNA takie jak np. lambdy, jest trawione efektywniej niż zamknięte koliste cząsteczki (np. plazmidowe), więc więcej jednostek na mikrogram może być wymagane do kompletnego trawienia.

Od Martina: Odpowiedzi na pytania w przypisach:5 - TAK; 6 - NIE. IMO, „wolniejsze” miejsca trawienia wymagają większego stężenia enzymu, żeby w miarę wydajnie się strawić, a nie że DNA stanie się kopalne zanim się trawienie skończy - logiczne. Ale to ostatnie zdanie faktycznie wygląda mi na byka, bo jak - wydajniejsze trawienie, to znaczy więcej enzymu trzeba dać? Z „więcej enzymu” to każdy głupi umie trawić wydajnie!

Próba przetrawienia (przedawkowania xP)

Promega używa tychże testów do jakościowego oznaczenia czystości enzymów, oraz do określenia stopnia zanieczyszczenia endo- i egzonukleazami. W tym teście coraz to większe ilości enzymu są dodawane do serii probówek zawierających substrat DNA. Po 16-godzinnej inkubacji w odpowiedniej temperaturze, maksymalna liczba jednostek dających ostry, czysty prążek podobny do tego po 1-godzinnej inkubacji jest wykrywana przez rozdział elektroforetyczny i barwienie bromkiem. Test ten określa także maksymalną liczbę jednostek enzymu która może być zastosowana bez skutków ubocznych w postaci aktywności star. Nie wszyscy dostawcy uwzględniają tą aktywność w swych specyfikacjach.

Sporadycznie zdarza się, że substrat przy próbie przetrawienia nie jest identyczny jak przy próbie aktywności. Substrat wybierany do testu aktywności musi jasno pokazywać obecność częściowo strawionego prążka diagnostycznego, natomiast substrat do próby przetrawienia zazwyczaj jest cięty do końca, co objawia się dodatkowymi prążkami, lub brakiem ostrości prążków spowodowanym zanieczyszczeniem endonukleazami.

Test ligacji

Promega stosuje ten test by określić funkcjonalną czystość DNA po trawieniu ER. Substratowe DNA jest całkowicie trawione w czterokrotnym nadmiarze ER, w odpowiednim buforze, następnie łączone ligazą T4, a na koniec cięte jeszcze raz tym samym ER. Ligacja zachodzi tylko w przypadku wolnych końców 5' i 3'. Ilość ligacji i ponownych cięć jest wyznaczana i musi przekroczyć minimalną wartość określoną dla danego ER. Nieefektywna ligacja albo fail (porażka) przy ponownym cięciu po ligacji mogą oznaczać zanieczyszczenie fosfatazami lub nukleazami. Substraty użyte w ligacji, oraz temperatura i czas ligacji mogą się różnić zależnie od dostawcy enzymu. Niektóre enzymy produkują fragmenty DNA które ligują słabo w związku z pozostawionymi pojedynczymi zasadami na końcach fragmentów, lub tworzą nie zawsze identyczne końce których łączenie jest potem utrudnione. Tępe końce tworzone przez niektóre ER są generalnie ciężej łączone niż 4-nukleotydowe lepkie końce.

Blue/White Cloning Quality Assay

Enzymy zaangażowane w klonowanie mogą być zanieczyszczone egzonukleazami, fosfatazami i innymi ER. W/w test jest czułym wskaźnikiem zanieczyszczenia enzymu, które może zakłócać proces klonowania. W tym teście specyficzny wektor pGEM jest trawiony dwie godziny w 5-krotnym nadmiarze testowanego ER. Stosując nadmiar enzymu ma się pewność, że nawet minimalna ilość zanieczyszczeń zostanie wykryta. Testowy wektor musi mieć odpowiednie miejsce restrykcyjne, które musi być unikalne i zlokalizowane w rejonie LacZ regionu kodującego α-peptyd. Plazmid jest ponownie łączony, umieszczany w E. coli. Szczep posiewany jest na specjalnej pożywce X-gal/IPTG/ampicylina. Ponieważ nie jest wstawiane żadne obce DNA, wszystkie białe lub blade kolonie obrazują uszkodzone końce DNA. Liczba białych lub bladych kolonii bezpośrednio koreluje z zawartością zanieczyszczających składników zawartych w próbce z testowanym enzymem (kiedy wyniki są porównane z próbami kontrolnymi). Enzym przechodzi test pomyślnie gdy liczba kolonie białe stanowią <5% wszystkich kolonii dla enzymu generującego tępe końce i <2% dla końców lepkich. Wydajność transformacji ciętych i ligowanych plazmidów jest określana przy zapewnieniu nieobecności fosfataz.

„Genome Qualified” Endonukleazy Restrykcyjne

Promega jest pierwszą firmą która zapewnia nowy poziom jakości ER do rozpoznawania sekwencji, co sprawia, że są one szczególnie użyteczne do mapowania chromosomowego DNA. Enzymy GQ dają czyste, niezdegradowane wzory restrykcyjne prokariotycznego DNA chromosomowego na żelu agarozowym. Integralność dużych fragmentów jest określana przez barwienie bromkiem etydyny podczas PFGE.

3. Terminy przydatności, stabilność itd.

Wszystkie ER Promegi mają zaznaczoną datę przydatności do użycia, kiedy są wydawane użytkownikom. Zazwyczaj są to 24 miesiące lub 15 dla mniej stabilnych enzymów. Promega gwarantuje aktywność enzymów w okresie zaznaczonym na fiolce. Stabilność enzymów jest monitorowana co 3-12 miesięcy przez departament jakości Promega. Jedne enzymy są stabilne w 100% przez całe lata, a inne tracą aktywność z czasem. Takie czynniki, jak nieodpowiedni bufor do przechowywania, albo temperatura, czy też denaturacja, mogą przyłożyć się do niestabilności enzymu.

IV: Ogólne zastosowanie ER

1. Posługiwanie się ER i magazynowanie.

Dodatek komponentów podczas przygotowywania reakcji trawienia jest ważny w kilku aspektach. Zapewnienie sterylności wyposażenia jest kluczowe. Jeżeli reagenty lub sprzęt wejdą w kontakt np. z paluchami albo blatami stołów, mogą zostać zanieczyszczone nukleazami, inhibitorami lub mikrobami. Należy także unikać krzyżowego zanieczyszczania reagentów (np. tipsem), bo enzym straci czystość i na przyszłość już nic nam nie strawi.

ER jak większość białek mogą zostać zdenaturowane i zinaktywowane po ekspozycji w nieprzyjaznym środowisku. Powinny być przechowywane w -20st Celsjusza w nieszroniącej zamrażarce, poza krótkimi chwilami, kiedy będą używane - wtedy należy je trzymać na lodzie. ER jest zazwyczaj ostatnim dodawanym składnikiem, by nie dopuścić do narażenia go na wysokie stężenia soli. Kiedy robimy dużo podobnych trawień, przydatne może okazać się zrobienie „pre-mixów tuż przed samą reakcją”(czyli chyba najpierw zrobić hurtową mieszaninę wszystkich podstawowych składników, a potem podzielić ją na probówki). Tajemnicze „pre-mixy” zawierają zazwyczaj wodę, bufor, BSA (jeżeli jest to konieczne) i enzym lub DNA, zależy, który z tych elementów jest wspólny dla reakcji.

Przed dodaniem ER należy mieszaninę dodatkowo zworteksować (zmieszać). Stężone roztwory soli, jak i reagenty zawierające glicerol (bufor do przechowywania enzymu) mogą być trudne do zmieszania. Bufory i roztwory soli powinny być dokładnie i intensywnie wymieszane, natomiast te zawierające już ER powinny być mieszane delikatnie, by nie zniszczyć enzymu. Przed konkretną reakcją należy próbki zwirować, by wszystko było na dnie.

2. Bufory

4-CORE

Dwa bufory zazwyczaj towarzyszące enzymom Promega. Jeden z nich jest optymalnym buforem do reakcji, może on być z systemu 4CORE, albo z innej serii optymalnych buforów. Drugi natomiast to MULTI CORE do wielokrotnych trawień. Dołączany bufor zapewnia 100% aktywność enzymu i zapewnia odpowiednie środowisko reakcji trawienia restrykcyjnego.

MULTI CORE

Opisywany jako bufor uniwersalny, towarzyszy każdemu ER który wykazuje >25% aktywności. Multi-Core jest użyteczny do podwójnych a nawet wielokrotnych trawień, ponieważ generalnie zapewnia większą aktywność dla większej różnorodności kombinacji niż inne bufory. Jednakże czasem należy pójść na kompromis - dodać więcej enzymu lub wydłużyć czas reakcji. Jest to przydatne przy użyciu więcej niż jednego ER.

TURBO

Pewne endonukleazy restrykcyjne, które wykazywały miejscową specyficzność względem DNA, okazały się mieć "dwumiejscowy mechanizm" cięcia DNA. Te ER typu II to: NaeI, NarI, EcoRII, HpaII i SacII. W związku z tym dwumiejscowym mechanizmem często jest trudno uzyskać całkowite strawienie substratu. Ponieważ te enzymy są często stosowane w biologii molekularnej, metoda aktywacji enzymów prowadząca do kompletnego trawienia jest bardzo przydatna. Sromega stworzyła taką metodę komercyjnie dostępną, wykorzystującą dwuniciowe oligonukleotydy zawierające rozpoznawaną sekwencję. Regiony flankujące na oligonukleotydzie sprawiają, że miejsce trawienia jest kinetycznie bardziej dostępne. Dlatego te oligonukleotydy są w stanie aktywować ER do kompletnego strawienia DNA. Promega aktualnie zapewnia dwa ER z serii TURBO: Nae I i Nar I. Te enzymy zapewniają błyskawiczne cięcie miejsc poprzednio niemożliwych lub bardzo trudnych do przecięcia i nie interferują z innymi technikami biologii molekularnej.

Bufory te nie tylko posiadają zaletę w postaci umożliwienia kompletnego strawienia DNA, lecz także podnoszą aktywność ER. Dzięki temu mniej jednostek enzymu jest wymagane, jak również reakcja zachodzi szybciej. W przypadku NaeI, należy zaobserwować iż nadmiar ER może inhibować reakcję. Wszystkie eksperymenty w firmie Promega były przeprowadzane z 4U enzymu, buforem TURBO 1x, 0,1mg/ml BSA, i 1ug substratu DNA w półgodzinnej reakcji. Dzięki temu stężenie oligonukleotydów została zoptymalizowane do uzyskania kompletnego trawienia przy zastosowaniu ekstremalnie niskich stężeń enzymu. Przy dodatkowej reakcji jednostopniowego oczyszczania DNA, oligonukleotydy nie będą interferować z technikami znakowania końców DNA, losowego znakowania primerów, czy ligacji.

V. Przykłady wykorzystania enzymów restrykcyjnych

A. Pojedyncze trawienia

Wymagane materiały:

(skład roztworów jest w sekcji VII)

• Odpowiedni ER i bufor

• Woda pozbawiona nukleaz

• BSA, acetylowana, 1mg/ml

• Niebieski/pomarańczowy bufor do ładowania na żel; 6x

Próbki do trawienia i elektroforezy są normalnie przygotowywane w autoklawowanych probówkach. Końcowa objętość 20ul pozawala na łatwą pracę, dokładne pipetowanie i dostarcza materiału na jeden lub dwa żele. Poniżej przykład standardowej reakcji.

1. Należy przygotować następującą reakcję. Jest niezwykle ważnym, by dodawać wymienione składniki w podanej kolejności.

• Woda wolna od nukleaz 14ul

• Bufor 10x do ER 2ul

• Acetylowane BSA 2ul

• Próbka DNA(w wodzie lub buforze TE, 0.2-1.0ug)* 1ul

• Enzym restrykcyjny 1ul

• Końcowa objętość 20ul

* Stężenie i masa DNA użyte do każdej reakcji mogą się nieznacznie różnić. Zwykle różnice w objętości są kompensowane przez dodawaną wodę, tak, że końcowa objętość w przybliżeniu wynosi 20ul, co jest standardową objętością do trawienia. Jeżeli DNA jest dodawane w niewielkim nad- lub niedomiarze objętości kompensacja może być nieistotna.

2. Delikatnie zamieszać przez pipetowanie, zamknąć probówkę i wirować przez chwilę przy 12000xg by wszystko było na dnie probówki.

3. Inkubować w temperaturze optymalnej dla enzymu przez 1-4 godziny.

4. Dodać 4ul niebieskiego/pomarańczowego buforu obciążającego (6x) i następnie przeprowadzić elektroforezę. Jeżeli jest taka potrzeba, próbki mogą być przechowywane w -20°C, aż będą potrzebne.

Trawienie DNA faga lambda powinno być poprzedzone ogrzaniem mieszaniny do 65°C przez 10 minut, aby rozdzielić „lepkie” końce.

B. Trawienia wielokrotne

Materiały

• Odpowiedni ER i bufor do niego

• Woda wolna od nukleaz

• Acetylowane BSA, 10mg/ml

• Niebieski/pomarańczowy bufor obciążający

Jeżeli wszystkie enzymy wymagają tego samego buforu to sprawa jest prosta.

Jeżeli jednak mają różne wymagania to istnieje kilka możliwości:

1. Należy porównać karty kompatybilności buforów, porównać aktywności i wybrać najlepszy. Jeżeli jeden z enzymów będzie w wybranym buforze wykazywał aktywność mniejszą niż 75% należy wydłużyć czas inkubacji. Należy jednak pamiętać o aktywności star i nie przeginać z czasem.

2. Należy wybrać izoschizomer albo neoschizomer z bardziej kompatybilnymi wymaganiami dla buforu.

3. Należy przeprowadzić każde trawienie sekwencyjnie, używając optymalnych buforów. Po pierwszym trawieniu przeprowadzić precypitację albo oczyszczenie DNA.

4. Należy dodawać składniki do drugiego trawienia po inaktywacji pierwszego enzymu. Np. użyć najpierw buforu o mniejszej zawartości soli i odpowiedniego enzymu, później dezaktywować tenże enzym; następnie dodać tyle soli by uzyskać stężenie wymagane dla drugiego enzymu i po uzyskaniu owego stężenia dodać drugi enzym.

Przykład (teraz będzie hardkor…D:)

W poniższym przykładzie zastosowano enzymy EcoRI oraz KpnI do jednoczesnego trawienia 1ug superskręconego plazmidowego DNA.

1. Określenie optymalnych buforów:

EcoRI: Bufor reakcyjny H

KpnI: Bufor reakcyjny J

Należy określić aktywność tych enzymów w buforze MULTI-CORE:

EcoRI: 100%

KpnI: 75-100%

Bazując na tych informacjach, wybór buforu MULTI-CORE byłby dobrą opcją.

Należy określić aktywność każdego enzymu restrykcyjnego w jednym z buforów 4-CORE. W przypadku EcoRI i KpnI żaden z serii buforów 4-CORE nie jest optymalny, jednakże mogą istnieć bufory 4-CORE kompatybilne do tych enzymów.

KpnI jest w 100% aktywny w buforze reakcyjnym A, ale EcoRI w tym buforze jest aktywny tylko w 25-50%; EcoRI nie jest aktywny w 100% w żadnym innym buforze.

Jeżeli koszty nie są ważne, to można zastosować większą ilość enzymu EcoRI, by zniwelować niższą aktywność; nie należy jednak przekraczać 2 godzin czasu inkubacji, by nie dopuścić do aktywności star.

Opierając się na analizie, bufory MULTI-CORE są nadal najlepszą opcją.

Izoschizomer lub neoschizomer może zostać użyty zamiast jednego z enzymów.

Acc65 jest neoschizomerem KpnI i jest 100% aktywny w buforach MULTI-CORE. Ma także zaletę w postaci niedopuszczania do aktywności star, podczas kiedy KpnI jest bardzo podatny na aktywność star podczas całonocnych inkubacji.

Należy określić ilość jednostek enzymu niezbędną do strawienia 1ug plazmidowego DNA.

EcoRI: 2 jednostki

KpnI: 2 jednostki

Acc65: 1 jednostka

Uwaga: te informacje dotyczą próbki DNA oczyszczonego przez Promegę; jednakże wiele trawień jest przeprowadzanych przy użyciu zanieczyszczonego DNA uzyskanego po lizie alkalicznej. W takich przypadkach zaleca się użycie 5-10U enzymu na mikrogram DNA.

EcoRI: 10 jednostek

KpnI: 10 jednostek

Acc65: 5 jednostek

Kontrola	Procedura	Cel
Nietrawione DNA	Odjąć porcję DNA bezpośrednio z probówki z próbką i załadować na żel; nie traktować tego żadnym czynnikiem oprócz buforu, (czyli bez ER)	Pokazuje integralność DNA badanego. Nacięte, liniowe i superskręcone formy plazmidowego DNA występują normalnie w nietrawionych próbkach.
Kontrola bez enzymu	Przygotować „próbne” trawienie równolegle z normalnym trawieniem tylko, że bez enzymu. Wszystko jest takie samo jak w normalnej reakcji tylko enzym jest zastępowany wodą lub glicerolem.	Wykrywa zmiany, które mogą zajść niezależnie od enzymu restrykcyjnego, np. powodowane przez zanieczyszczenia.
Kontrola aktywności enzymu	Przeprowadzić kontrolne trawienie używając DNA faga lambda w sposób identyczny jak w ulotce. Jeżeli są dwie probówki z enzymem, przeprowadzić kontrolę dla każdej z nich.	Potwierdza czy enzym jest aktywny.
Kontrola DNA substratowego i Głowna kontrola trawienia	Nastawić równoległe reakcje: Przeprowadzić eksperymentalne trawienie. Jeśli zawiedzie, powtórzyć. Przeprowadzić trawienie dokładnie jak jest podane w teście aktywności enzymu używając eksperymentalnego DNA zamiast kontrolnego Przeprowadzić eksperymentalne trawienie, stosując zamiast eksperymentalnego DNA, dostępnym komercyjnie np. niemetylowanym DNA faga lambda	Porównuje aktywność enzymu w warunkach eksperymentalnych z warunkami standardowymi i standardowym DNA. Testuje możliwe problemy z substratowym DNA (zanieczyszczone, zmetylowane itp.) Wykazuje możliwą obecność inhibitorów.

2. Z powyższych informacji wynika, że dwie reakcje są możliwe do przeprowadzenia podczas trawienia mini próbek DNA. Należy przeprowadzać te reakcje w małej objętości. Stężenie glicerolu nie powinno przekraczać 5%.

Reakcja I

• Woda bez nukleaz 12ul

• MULTI-CORE bufor 10x 2ul

• DNA plazmidowe (0.5ug/ul) 2ul

• BSA Acetylowane (1mg/ml) 2ul

• EcoRI (10U/ul) 1ul

• KpnI (10U/ul) 1ul

• Końcowa objętość 20ul

Reakcja II

• Woda wolna od nukleaz 12.5ul

• MULTI-CORE bufor, 10x 2ul

• Plazmidowe DNA (0.5 ug/ul) 2ul

• Acetylowane BSA (1mg/ml) 2ul

• EcoRI 1ul

• Acc65 0.5ul

• Końcowa objętość 20ul

3. Inkubować w 37°C przez 1-4 godziny.

4. Dodać 4ul niebieskiego/pomarańczowego buforu obciążającego i przystąpić do elektroforezy. Jeżeli zachodzi taka potrzeba, próbki mogą być przechowywane w -20°C.

Trawienie DNA faga lambda powinno być poprzedzone ogrzaniem mieszaniny do 65°C przez 10 minut, aby rozdzielić „lepkie” końce.

C. Elektroforeza w żelu agarozowym

Materiały:

• agaroza

• TAE albo TBE 1x

• Aparat do elektroforezy

• Mikrofala albo nagrzany talerz

• Bromek etydyny

• Iluminator UV i pstrykadło fotograficzne

Nie muszę chyba pisać ze bromek jest kancerogenny, prawda? (Oh, taaak?... *wypluwa niebieskawy kawałek żelu*)

Wyniki trawienia restrykcyjnego mogą być analizowane poprzez rozdział w żelu agarozowym i późniejsze barwienie bromkiem i wizualizację przy pomocy UV.

OK., dalej było „Jak zrobić elektroforezę, przewodnik dla małp i ludzi dotkniętych niedorozwojem”

Więc pozwoliłem sobie odpuścić.

Jedyne, co może się z tego przydać to:

• Stężenie bromku do barwienia to 0.5ug/ml i barwi się przez pół godziny w temp. pokojowej

• Można zabarwić żel przed barwieniem dodając 0.5ug/ml i pamiętać, że to może zakłócać proces migracji DNA

STRONA 10

VI. DODATKOWE INFORMACJE O ENZYMACH RESTRYKCYJNYCH

A. Bufory

10x stężony bufor reakcyjny dostarczany z każdym enzymem restrykcyjnym jest zoptymalizowany, by dawać 100% aktywności enzymatycznej. W wielu przypadkach, dobra aktywność jest także otrzymywana przy użyciu jednego z 10× buforów Promega 4-CORE. Tabela 2 może być użyta do wyboru najlepszego buforu do trawienia wieloma ER. Aktywność enzymatyczna jest wyrażana jako procent aktywności otrzymywanej z buforem zoptymalizowanym dla każdego enzymu.

STRONA 15 (tekst nad tabelką)

C. Izoschizomery, neoschizomery i pasujące końce.

Enzym jest izoschizomerem innego enzymu, kiedy one oba mają takie samo miejsce rozpoznawane oraz miejsce cięcia. Enzym jest neoschizomerem innego enzymu, jeśli oba mają takie samo miejsce rozpoznawania ale inne miejsce cięcia. Izoschizomery posiadają przewagę nad większością enzymów, na którą składa się mniejsza aktywność „star” (niespecyficzna), mniejszy koszt i czułość lub nieczułość na metylację.

Powszechnie stosowane izoschizomery są umieszczone w TABELI 6. Neoschizomery (oznaczone gwiazdką) mogą być używane do tworzenia lepkich lub tępych końców do procesu klonowania, zależnie od tego, na jakie mamy akurat ochotę.

Niektóre enzymy restrykcyjne produkują zgodne końce, nawet, jeśli ich rozpoznawana sekwencja nie jest identyczna. To zapewnia alternatywną strategię klonowania, kiedy nie można użyć odpowiednich izoschizomerów lub neoschizomerów. TABELA 7zawiera listę enzymów które dają zgodne końce dla ligacji, pogrupowane zgodnie z rodzajem żądanych końców.

TABELKA 6

TABELA 7

STRONA 19 (tekst nad tabelką)

D. Czułość metylacji.

Kiedy pomimo wykonania trawienia obserwujemy mały stopień cięcia, albo wcale go nie obserwujemy, należy coś mądrego wymyślić, do wpisania w sprawozdanie. Możliwe, że to metylacja (lub jej brak, w przypadku Dpn I ) DNA jest problemem. Wrażliwość enzymów restrykcyjnych Promega na metylację DNA jest streszczona w TABELI 8. Jeśli zdecydujemy się na użycie enzymu wrażliwego na metylację, to powinniśmy sprawdzić charakterystykę genetyczna bakterii lub systemu ekspresji, z którego został oczyszczony DNA, albowiem mogą one wykazywać zakłócający typ metylacji.

Co możemy zrobić, aby uratować sytuację, to przenieść DNA do innego systemu ekspresji lub gospodarza bakteryjnego. Można też poszukać takiego izoschizomeru, który nie jest inhibowany przez ten typ metylacji. TABELA 9 dostarcza informacji o parach izoschizomerów, które wykazują inną czułość dla metylacji.

TABELKA 8

Enzymy modyfikujące

1. Wstęp

Enzymy modyfikujące kwasy nukleinowe stanowią podstawę wielu technik w biologii molekularnej. Enzymy te stosuje się do syntetyzowania, degradacji, łączenia czy usuwania części kwasów nukleinowych w sposób kontrolowany i ustalony. Prawdopodobnie najpowszechniej używa się ich w klonowaniu. Rys. 1 podsumowuje aktywności enzymów modyfikujących używanych w tym celu.

W tym rozdziale opisanych jest wiele szeroko stosowanych enzymów, razem z ich cechami, z naciskiem na ich praktyczne wykorzystanie w laboratoriach. Podczas gdy wiele enzymów może przeprowadzać takie same reakcje, jakiś konkretny może być z jakiegoś powodu lepszy od innych - te są opisane szczegółowo.

2. Polimerazy DNA

Polimerazy DNA zależne od DNA syntetyzują DNA w trakcie replikacji i naprawy. Mają 2 substraty: jednym jest koniec związanego z matrycą startera, zawierający wolną grupę 3'-hydroksylową (OH), drugim - 5'-trifosforan deoksynukleotydowy (dNTP). Mostek fosfodiestrowy tworzy się poprzez atak nukleofilowy grupy 3'-OH końca startera na grupę α-fosforanową dNTP i eliminację terminalnego pirofosforanu (PP_i):

(dNMP)_n + dNTP <--------------------------------------> (dNMP)_n+1 + PP_i

Polimerazy DNA do działania wymagają startera z wolną grupą 3'-OH, inaczej synteza nowego łańcucha DNA nie może zostać zainicjowana. Nowo dodany monomer ma wolną grupę 3'-OH, zatem może służyć jako koniec starterowi w kolejnym etapie polimeryzacji. Wydłużanie łańcucha w trakcie polimeryzacji odbywa się w kierunku 5'->3'; polimeryzacja może być albo rozdzielcza (?), albo procesywna. Nieprocesywna lub rozdzielcza polimeraza oddysocjowuje od matrycy po dodaniu każdego kolejnego nukleotydu, podczas gdy procesywna pozostaje przyłączona do matrycy.

Wysoka procesywność niektórych polimeraz zależy od dodatkowych czynników. Trzeba wziąć to pod uwagę, kiedy używa się tych enzymów in vitro, jako że komercyjne preparaty mogą nie zawierać potrzebnych kofaktorów. Nie można też zapominać o odwrotnej reakcji, pirofosforolizie. Wysoki poziom PP_i faworyzuje reakcję odwrotną, w wyniku której zostają uwolnione dNTP. W żywych komórkach równowaga reakcji jest przesunięta w kierunku zużywania dNTP dzięki enzymowi - pirofosfatazie, która hydrolizuje PP_i do nieorganicznego fosforanu.

Liczba nukleotydów dodanych przez polimerazę DNA zanim oddysocjuje ona od startera-matrycy jest często określana jako procesywność. Mimo że wskaźnik ten można zmierzyć, nie jest jasne, jak ważna jest procesywność w zastosowaniach biologii molekularnej, z tego względu, że w większości technik stosuje się teoretycznie wysycające stężenia enzymu.

Innymi czynnikami są szybkość obrotu i dokładność enzymu. Szybkość obrotu to liczba nukleotydów polimeryzowanych w ciągu minuty przez cząsteczkę polimerazy DNA. Nie powinno się tego mylić z procesywnością; w szybkości obrotu nie bierze się pod uwagę, czy polimeraza jest rozdzielcza, czy procesywna. Dokładność określa zdolność enzymu do wiernej replikacji cząsteczki DNA.

Niektóre polimerazy DNA mogą pełnić funkcje inne niż polimeryzacja. Polimeraza może mieć aktywność 3'->5' egzonukleazy, 5->3' egzonukleazy, zdolność do wykorzystywania RNA zamiast DNA jako substratu (odwrotna transkrypcja), zdolność do dodawania nukleotydów bez matrycy. Aktywność 3'-egzonukleazy jest związana ze sprawdzaniem błędów - usuwany jest niekomplementarny nukleotyd, po czym polimeraza kontynuuje swoją pracę. Reakcje korygowania i polimeryzacji konkurują między sobą. Ogólnie rzecz biorąc, polimeraza DNA z aktywnością 3'-egzonukleazy będzie wykazywała większą dokładność niż bez tej aktywności, co może wpływać na wybór enzymu w niektórych badaniach. Tak zwana aktywność 5'-egzonukleazy bierze udział w naprawie przez wycięcie (excision repair). W rzeczywistości jest to aktywność endonukleazy zależnej od pojedynczej nici, zatem nazwa zwyczajowa jest nieadekwatna. Podczas gdy aktywność ta jest potrzebna np. w nick-translacji, nie powinna znaleźć się w sekwencjonowaniu. Dodatkowo, niektóre polimerazy DNA mają aktywność odwrotnej transkryptazy (replikacja DNA na matrycy RNA), która jest zwykle aktywowana poprzez zmianę kationu w reakcji (np. Mn²⁺ zamiast Mg²⁺).

Polimerazy DNA bez 3'-egzonukleazy mogą dodawać niezależny od matrycy nukleotyd na końcu 3' - zachowują się wówczas jak terminalna transferaza. Jednakże, inaczej niż w przypadku terminalnej transferazy, dodawany jest tylko jeden nukleotyd. Istnieje preferencja w stosunku do dodawanego nukleotydu - dATP, jednak jest ona wrażliwa na sekwencję w pobliżu końca 3'. W klonowaniu fragmentów niosących nukleotyd dodany przez polimerazy bez aktywności korektorskiej stosuje się dwie strategie. W pierwszej „wygładza” się lub „naostrza” końce fragmentu DNA, np. z użyciem polimerazy DNA z aktywnością korektorską. W drugiej stosuje się odpowiedni wektor, który „wyrównuje” dodany nukleotyd, np. T-wektor.

(W tekście jest napisane „(...)an appropriate vector that compensates for the added nucleotide(...)”. “To compensate7 for” znaczy mniej więcej “wynagradzać szkody”, pewnie chodzi o to, że wektor naprawia to, co zepsuła polimeraza… Ciekawe, jak D:)

Najpopularniejszymi polimerazami DNA używanymi in vitro są te izolowane z bakterii i bakteriofagów; można podzielić je na dwie grupy, ze względu na stabilność temperaturową, np. zdolność enzymu do wytrzymania wydłużonej ekspozycji na podwyższoną temperaturę. Optimum temperaturowe termostabilnych polimeraz DNA wynosi zwykle 74°C, jednak enzymy mogą wytrzymać powtarzane podwyższenia temperatur wyższych niż ich optimum. Optymalna temperatura dla mezofilnych polimeraz DNA jest o wiele niższa niż dla termostabilnych (zazwyczaj 37-42°C).

1. Mezofilne Polimerazy DNA

Polimeraza DNA I

Właściwości

Polimeraza DNA zależna od DNA; 3'-egzonukleaza dla dsDNA lub ssDNA; 5'-egzonukleaza dla dsDNA lub hybrydów RNA/DNA.

Zastosowanie

Wypełnianie wystających końców 5' dla znakowania lub klonowania; usuwanie wystających końców 3'; nick-translacja; znakowanie wystających końców 3' w reakcji zastąpienia.

Wymagania

Mg²⁺; starter z 3'-OH (do polimeryzacji); brak dNTPs faworyzuje aktywność 3'-egzonukleazy.

Inhibitory/Inaktywacja

Inaktywacja w 68°C przez 10 minut; aktywność 3'-egzonukleazy inhibowana w obecności dNMPs.

10X bufor reakcyjny

500 mM Tris-HCl, pH 7.2, 100 mM MgSO₄, 1 mM DTT.

Źródło

Rekombinowany szczep E. Coli

Większy fragment polimerazy DNA I (fragment Klenowa)

Właściwości

Polimeraza DNA zależna od DNA; 3'-egzonukleaza dla ds lub ssDNA; „wypieranie” nici.

Zastosowanie

Wypełnianie wystających końców 5' dla znakowania lub klonowania; sekwencjonowanie DNA metodą dideoksy; nick-translacja; miejscowo-specyficzna, ukierunkowana na oligonukleotydy mutageneza (oligo-directed site-specific mutagenesis); mutageneza związana ze złym wstawieniem [nt]; synteza drugiej nici cDNA; usuwanie wystających końców 3'; znakowanie wystających końców 3' w reakcji zastąpienia.

Wymagania

Mg²⁺; starter z 3'-OH (do polimeryzacji); brak dNTPs faworyzuje aktywność 3'-egzonukleazy.

Inhibitory/Inaktywacja

Inaktywacja w 75°C przez 10 minut; inhibicja przez 2',2'-ryboepoksydo 5'-trifosforan adenozyny.

10X bufor reakcyjny

500 mM Tris-HCl, pH 7.2, 100 mM MgSO₄, 1 mM DTT.

Źródło

Rekombinowany szczep E. Coli

Fragment Klenowa bez egzonukleazy

Właściwości

Polimeraza DNA zależna od DNA; „wypieranie” nici.

Zastosowanie

Losowe znakowanie starterów; wypełnianie wystających końców 5' dla znakowania i klonowania; sekwencjonowanie DNA; synteza drugiej nici cDNA; miejscowo-specyficzna, ukierunkowana na oligonukleotydy mutageneza (oligo-directed site-specific mutagenesis);

Wymagania

Mg²⁺; starter z 3'-OH.

Inhibitory/Inaktywacja

Inaktywacja w 75°C przez 10 minut; inhibicja przez 2',2'-ryboepoksydo 5'-trifosforan adenozyny.

10X bufor reakcyjny

500 mM Tris-HCl, pH 7.2, 100 mM MgSO₄, 1 mM DTT.

Źródło

Rekombinowany szczep E coli.

Polimeraza DNA T4

Właściwości

Polimeraza DNA zależna od DNA; 3'-egzonukleaza.

Zastosowanie

Wypełnianie wystających końców 5' dla znakowania i klonowania; usuwanie wystających końców 3' (preferowane, ponieważ aktywność 3'-egzonukleazy jest silniejsza od Klenowa); zagnieżdżone delecje (nested deletions); miejscowo-specyficzna, ukierunkowana na oligonukleotydy mutageneza (oligo-directed site-specific mutagenesis; preferowanie, ponieważ brakuje aktywności wypierania nici i wysokiej dokładności); znakowanie wystających końców 3' w reakcji zastąpienia (preferowane, ponieważ aktywność 3'-egzonukleazy jest silniejsza od Klenowa).

Wymagania

Mg²⁺; starter z 3'-OH (polimeryzacja); brak dNTP faworyzuje aktywność egzonukleazy.

Inhibitory/Inaktywacja

Inaktywacja w 75°C przez 10 minut; inhibicja przez grupy blokujące -SH.

Warunki reakcji

55mM Tris-octan, pH 7.9, 66 mM octan potasu, 10 mM octan magnezu, 0.5 mM DTT

Źródło

Rekombinowany szczep E coli.

Polimeraza DNA T7

Właściwości

Polimeraza DNA zależna od DNA; 3'-egzonukleaza.

Zastosowanie

Wydłużanie startera; wypełnianie wystających końców 5' dla znakowania i klonowania; usuwanie wystających końców 3'; znakowanie wystających końców 3' w reakcji zastąpienia; miejscowo-specyficzna, ukierunkowana na oligonukleotydy mutageneza (oligo-directed site-specific mutagenesis); zmodyfikowana (bez egzonukleazy) forma jest stosowana w sekwencjonowaniu DNA.

Wymagania

Mg²⁺; starter z 3'-OH (polimeryzacja); tioredoksyna (thioredoxin) E. coli (zwiększa procesywność).

Inhibitory/Inaktywacja

Inaktywacja w 70°C przez 10 minut.

Warunki reakcji

10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 2 mM DTT, 1 mM ATP.

Źródło

Rekombinowany szczep E coli.

Terminalna transferaza deoksynukleotydylowa

Właściwości

Polimeraza DNA niezależna od matrycy, dodaje mononukleotydy do wolnego końca 3'-OH ssDNA, dsDNA i RNA

Zastosowanie

Dodawanie ogonów homopolimerowych; może być dodany pojedynczy nt, taki jak ddNTP lub trifosforan kordicepinu (???, cordycepin triphosphate).

Wymagania

Co²⁺ do addycji puryn, Mg²⁺ do pirymidyn; Co²⁺ pozwala na dodawanie ogonów z jakiegokolwiek końca 3' i jest konieczny do znakowania RNA.

5X bufor reakcyjny

500 mM bufor kakodylanowy, pH 6.8, 5 mM CoCl₂, 0.5 mM DTT.

Źródło

Grasica cielęca.

2. Termostabilne polimerazy DNA

Polimeraza Taq

Właściwości

Termostabilna polimeraza DNA zależna od DNA; 5'-egzonukleaza.

Zastosowanie

PCR; sekwencjonowanie DNA.

Wymagania

Mg²⁺; starter z 3'-OH.

Inhibitory/Inaktywacja

EDTA

Warunki reakcji

50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 9.0 (w 25°C), 0.1% Triton®X-100. Dodać dNTP do ostatecznego stężenia 200 μM; do każdej amplifikacji optymalizować st. MgCl₂.

Źródło

Thermus aquaticus YT-1

Polimeraza Taq do sekwencjonowania

Właściwości

Termostabilna polimeraza DNA zależna od DNA.

Zastosowanie

Cykliczne sekwencjonowanie DNA.

Wymagania

Mg²⁺; starter z 3'-OH.

Warunki reakcji

50mM Tris-HCl, pH 9.0 (w 25°C), 50 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 200 μM każdego dNTP.

Źródło

Thermus aquaticus YT-1.

Polimeraza TfI

Właściwości

Termostabilna polimeraza DNA zależna od DNA; 5'-egzonukleaza; aktywność odwrotnej transkryptazy.

Zastosowanie

PCR; RT-PCR.

Wymagania

Mg²⁺; starter z 3'-OH; Mn²⁺ do odwrotnej transkrypcji.

Inhibitory/Inaktywacja

Inaktywacja w 75°C przez 10 minut; inhibicja przez grupy blokujące -SH.

Warunki reakcji

50 mM Tris-HCl, pH 9.0 (w 25°C), 50 mM NaCl; dodać dNTP do ostatecznego stężenia 200 μM. Do każdej amplifikacji optymalizować stężenie MgSO₄.

Źródło

Thermus flavus

Polimeraza Tth

Właściwości

Termostabilna polimeraza DNA zależna od DNA; 5'-egzonukleaza; aktywność odwrotnej transkryptazy.

Zastosowanie

PCR; RT-PCR.

Wymagania

Mg²⁺; starter z 3'-OH; Mn²⁺ do odwrotnej transkrypcji.

Inhibitory/Inaktywacja

Inaktywacja w 75°C przez 10 minut; inhibicja przez grupy blokujące -SH.

Warunki reakcji

Polimeryzacja: 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 9.0 (w 25°C), 0.1% Triton®X-100; dodać dNTP do stężenia 200 μM. Do każdej amplifikacji optymalizować st. MgCl₂. Odwrotna transkrypcja: 10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 90 mM KCl. Do każdej amplifikacji optymalizować st. MnCl₂.

Źródło

Thermus thermophilus HB-8

Polimeraza Tli

Właściwości

Termostabilna polimeraza DNA zależna od DNA; 3'-egzonukleaza; wypieranie nici.

Zastosowanie

PCR o dużej dokładności; korekcja; termostabilna polimeraza do długiego PCR.

Wymagania

Mg²⁺; starter z 3'-OH.

Inhibitory/Inaktywacja

dUTP

Warunki reakcji

50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 9.0 (w 25°C), 0.1% Triton®X-100; dodać dNTP do stężenia 200 μM. Do każdej amplifikacji optymalizować st. MgCl₂.

Źródło

Thermococcus litoralis

Polimeraza Pfu

Właściwości

Termostabilna polimeraza DNA zależna od DNA; 3'-egzonukleaza; dostępna wersja bez aktywności egzonukleazowej.

Zastosowanie

PCR o dużej dokładności; korekcja; termostabilna polimeraza do długiego PCR.

Wymagania

Mg²⁺; starter z 3'-OH.

Inhibitory/Inaktywacja

dUTP

Warunki reakcji

20 mM Tris-HCl, pH 8.2, 10 mM KCl, 6mM (NH₄)₂SO₄, 2 mM MgCl₂, 0.1% Triton®X-100, 10 μg/ml BSA. dodać dNTP do stężenia 200 μM.

Źródło

Pyrococcus furiosus

3. Odwrotne transkryptazy

Odkrycie odwrotnej transkryptazy, inaczej polimerazy DNA zależnej od RNA, i ich roli w infekcji retrowirusowej zmieniło centralny dogmat biologii molekularnej (DNARNAbiałko). Odkrycia te wyjawiły, że odwrotne transkryptazy, znajdywane w wirionie, katalizują syntezę prowirusowego DNA z genomu RNA wiriony na początku infekcji. Podstawowe zastosowanie in vitro enzymy te znalazły w tworzeniu bibliotek cDNA, gdzie używa się ich do kopiowania RNA w pierwszą nić cDNA do klonowania. Podobnie, odwrotne transkryptazy są stosowane w RT-PCR do generowania matrycy DNA dla termostabilnych polimeraz DNA. Stosuje się je także w mapowaniu końców 5' mRNA i sekwencjonowaniu RNA.

Odwrotne transkryptazy potrzebują do syntezy startera, tak jak inne polimerazy DNA. In vitro, starterami mogą być oligo(dT), które hybrydyzują do ogonów poli(A)+ eukariotycznych mRNA; losowe heksametry, które inicjują syntezę wewnątrz matrycy RNA; starter o specyficznej sekwencji, który hybrydyzuje do znanej sekwencji wewnątrz matrycy RNA. Polimeryzacja od startera przebiega tak samo jak w przypadku innych polimeraz DNA. Dwie powszechnie używane odwrotne transkryptazy, AMV i MMLV, przeprowadzają taką samą reakcję, ale mają inne temperatury optymalne (AMV - 42°C; MMLV - 37°C). AMV jest enzymem z wyboru dla matryc z wieloma strukturami drugorzędowymi.

Niektóre odwrotne transkryptazy posiadają wewnętrzną/wrodzoną? aktywność 3'- i/lub 5'-egzorybonukleazy (RNaza H), podobną do aktywności egzonukleazowych kojarzonych z niektórymi polimerazami DNA zależnymi od DNA. Aktywności te stosuje się zwykle do degradowania matrycy RNA po syntezie pierwszej nici cDNA. Brak aktywności 5'-egzorybonukleazy (RNazy H) może pomóc w produkcji dłuższych cDNA.

Niektóre polimerazy DNA zależne od DNA także posiadają aktywność odwrotnej transkryptazy, która w pewnych warunkach może być faworyzowana. Na przykład, polimeraza Tth wykazuje aktywność odwrotnej transkryptazy kiedy w reakcji Mg²⁺ zostaną zastąpione przez Mn²⁺.

Odwrotna transkryptaza AMV

Właściwości

Polimeraza DNA zależna od RNA; 5'-egzorybonukleaza (RNaza H); 3' egzorybonukleaza.

Zastosowanie

Synteza pierwszej nici cDNA, szczególnie na matrycach RNA z dużą ilością struktur drugorzędowych; RT-PCR; degradacja RNA w hybrydach RNA/DNA; sekwencjonowanie RNA; wydłużanie startera; mapowanie transkryptu.

Wymagania

Mg²⁺ lub Mn²⁺; starter; 42°C

5X bufor reakcyjny

250 mM Tris-HCl, pH 8.3, 250 mM KCl, 50 mM MgCl₂, 50 mM DTT, 2.5 mM spermidyna.

Źródło

Wirus ptasiej białaczki (avian myeloblastosis virus)

Odwrotna transkryptaza M-MLV

Właściwości

Polimeraza DNA zależna od RNA; 5'-egzorybonukleaza (RNaza H); 3' egzorybonukleaza.

Zastosowanie

Synteza pierwszej nici cDNA; RT-PCR; degradacja RNA w hybrydach RNA/DNA; sekwencjonowanie RNA; mapowanie transkryptu.

Wymagania

Mg²⁺; starter; 37°C

5X bufor reakcyjny

250 mM Tris-HCl, pH 8.3, 375 mM KCl, 15 mM MgCl₂, 50 mM DTT.

Źródło

Rekombinowany szczep E. coli z genem odwrotnej transkryptazy wirusa mysiej białaczki Moloneya.

Odwrotna transkryptaza M-MLV H minus

Właściwości

Polimeraza DNA zależna od RNA; 3' egzorybonukleaza.

Zastosowanie

Synteza pierwszej nici cDNA; RT-PCR; degradacja RNA w hybrydach RNA/DNA; sekwencjonowanie RNA.

Wymagania

Mg²⁺; starter; 37°C

5X bufor reakcyjny

250 mM Tris-HCl, pH 8.3, 375 mM KCl, 15 mM MgCl₂, 50 mM DTT.

Źródło

Rekombinowany szczep E. coli z genem odwrotnej transkryptazy wirusa mysiej białaczki Moloneya. (Nie na sprzedaż w USA! D:)

3. Polimerazy RNA

Polimerazy RNA bakteriofagów T7, T3 i SP6 są polimerazami RNA zależnymi od DNA składającymi się z jednej podjednostki, wykazują one ogromną specyficzność w kierunku swoich sekwencji promotorowych. Na przykład bakteriofagi T3 i T7 są ze sobą blisko spokrewnione, ale polimeraza RNA T3 nie wykorzysta promotora T7 i vice versa.

Z trzech najczęściej używanych enzymów tej grupy, najlepiej poznana została polimeraza RNA T7. Transkrybuje ona fagowe geny klasy II i III, nazwane tak od czasu ich ekspresji w trakcie cyklu wzrostowego faga. Promotory klasy III wydają się być silniejsze in vitro i in vivo od klasy II i są często używane w transkrypcyjnych wektorach in vitro.

Polimerazy RNA fagów wymagją matrycy DNA z odpowiednim promotorem fagowym, ale w syntezie nie potrzeba startera tak jak w polimerazach DNA. Transkrypty in vitro mogą być tworzone z kolistej matrycy plazmidowej, ale powstaną produkty o różnej długości. Są dwa sposoby na wytworzenie dyskretnych transkryptów RNA bez sekwencji wektorowych. W pierwszym, transkrypcja może być terminowana dzięki obecności sekwencji terminatorowej specyficznej dla fagowej polimerazy RNA, aczkolwiek może się zdarzyć, że polimeraza przejdzie dalej. Drugi, popularniejszy sposób to generowanie „szybko wychodzących” transkryptów (run-off transcripts) z matrycy zlinearyzowanej przez trawienie enzymem restrykcyjnym. W drugiej procedurze może powstać problem, gdy użyty zostanie enzym generujący wystające końce 3'. W takim przypadku powstaną transkrypty komplementarne do nici przeciwnej i sekwencji wektora. Aby tego uniknąć, wystające końce 3' należy przekształcić w tępe końce.

Ze względu na specyficzność polimeraz względem promotora, transkrybowany będzie tylko DNA poniżej specyficznej fagowej sekwencji paromotorowej. Wysoce specyficzne, jednoniciowe RNA produkowane in vitro tą metodą można stosować w różnorakich badaniach. W obecności znakowanych rNTP można produkować sondy RNA. Takie sondy pozwalają na tworzenie mocniejszych hybrydów (RNA:RNA>RNA:DNA>DNA:DNA) w blottingu i hybrydyzacji in situ.

Polimeraza RNA SP6

Właściwości

Polimeraza RNA zależna od DNA.

Zastosowanie

Produkcja znakowanych sond RNA; produkcja transkryptów RNA do badań in vitro, w tym translacja in vitro; test ochrony [przed??] RNazą i przetwarzanie substratów.

Wymagania

DTT lub β-merkaptoetanol; Mg²⁺; specyficzna sekwencja promotorowa; specyficzne sekwencje terminatorowe, gdy potrzebne są „dyskretne” transkrypty (discrete-length transcripts), a sekwencja nie jest w postaci liniowej. Stymulacja spermidyną lub BSA.

5X bufor reakcyjny

200 mM Tris-HCl, pH 7.9, 30 mM MgCl₂, 10 mM spermidyna, 50 mM NaCl.

Źródło

Rekombinowany szczep E. coli

Polimeraza RNA T7

Właściwości

Polimeraza RNA zależna od DNA.

Zastosowanie

Produkcja znakowanych sond RNA; produkcja transkryptów RNA do badań in vitro, w tym translacja in vitro; test ochrony [przed??] RNazą i przetwarzanie substratów.

Wymagania

DTT lub β-merkaptoetanol; Mg²⁺; specyficzna sekwencja promotorowa; specyficzne sekwencje terminatorowe, gdy potrzebne są „dyskretne” transkrypty (discrete-length transcripts), a sekwencja nie jest w postaci liniowej. Stymulacja spermidyną lub BSA.

5X bufor reakcyjny

200 mM Tris-HCl, pH 7.9, 30 mM MgCl₂, 10 mM spermidyna, 50 mM NaCl.

Źródło

Rekombinowany szczep E. coli

Polimeraza RNA T3

Właściwości

Polimeraza RNA zależna od DNA.

Zastosowanie

Produkcja znakowanych sond RNA; produkcja transkryptów RNA do badań in vitro, w tym translacja in vitro; test ochrony [przed??] RNazą i przetwarzanie substratów.

Wymagania

DTT lub β-merkaptoetanol; Mg²⁺; specyficzna sekwencja promotorowa; specyficzne sekwencje terminatorowe, gdy potrzebne są „dyskretne” transkrypty (discrete-length transcripts), a sekwencja nie jest w postaci liniowej. Stymulacja spermidyną lub BSA.

5X bufor reakcyjny

200 mM Tris-HCl, pH 7.9, 30 mM MgCl₂, 10 mM spermidyna, 50 mM NaCl.

Źródło

Rekombinowany szczep E. coli

drabinki, polimorfizm miejsc restrykcyjnych, tak mi się wydaje

ARGH D:

„overdigest”, mojem zdaniem (Martina znaczy się), to jest dodanie za dużej ilości enzymu.

Tutaj wszystko jest ODPOWIEDNIE, jak gdzieś tego nie napisałem to i tak jest odpowiednie…..

Czy jest na sali sens?!?

Ponawiam pytanie D:

Aktywność star - własność enzymów restrykcyjnych polegająca na obniżeniu lub zaniku specyficzności ich działania, objawiająca się cięciem DNA w miejscach innych niż restrykcyjne

Nie pytajcie mnie o co kaman…..

Od Martina: Poprawiłam to kalekie zdanie. Ma już pozory zrozumiałości? I ocenzurowałam komentarze xP

Ale wazelina :O

Albo agentow Polbanku.

Polimeraza DNA

Kation dwuwartościowy

---