Enzymy restrykcyjne

Restryktazy

(inaczej enzymy restrykcyjne , endonukleazy restrykcyjne) - to enzymy

izolowane z bakterii , zdolne do rozpoznawania specyficznych sekwencji w DNA
(z reguły są to sekwencje

palindromowe

) i do przecinania dwuniciowej cząsteczki

DNA w ściśle określonym miejscu , w obrębie lub okolicy sekwencji
rozpoznawanej. Otrzymywane fragmenty DNA nie są losowe a w każdym prążku
na żelu znajdują się cząsteczki DNA o identycznej sekwencji nukleotydowej. Z
reguły różne enzymy rozpoznają odmienne sekwencje DNA.

Istnieją jednak wyjątki - tzw.

izoschizomery

- enzymy izolowane z różnych

organizmów ale rozpoznające te same sekwencje oraz

heteroizoschizomery

-

enzymy rozpoznające te same sekwencje ale tnące w innym miejscu.

Typy enzymów:

Typ I

- wielopodjednostkowe kompleksy enzymatyczne zawieraj

ą

ce aktywno

ś

ci

metylazy i restryktazy. Przecinaj

ą

DNA z dala od rozpoznawanej sekwencji, w bli

ż

ej

nieokre

ś

lonym miejscu. Z tego powodu nie maj

ą

wi

ę

kszego zastosowania

praktycznego.

Typ II

- przecinaj

ą

DNA w zdefiniowanym miejscu, w obszarze rozpoznawanej

sekwencji lub w jej pobli

ż

u. Składaj

ą

si

ę

z pojedynczych polipeptydów. Rozpoznaj

ą

sekwencje symetryczne.

Typ IIs

- zbli

ż

one do typu II, przecinaj

ą

z jednej strony rozpoznawanej sekwencji, która

jest asymetryczna.

Typ III

- du

ż

e kompleksy, które wymagaj

ą

dwóch sekwencji rozpoznawanych w pobli

ż

u

siebie. Bez znaczenia praktycznego.

Typ IV

- zbli

ż

one do typu II. Zawieraj

ą

aktywno

ść

metylazy i restryktazy w tym samym

polipeptydzie. Przecinaj

ą

DNA w zdefiniowanym obszarze poza sekwencj

ą

rozpoznawania. Aktywno

ś

ci metylazy i restryktazy nie mog

ą

działa

ć

równocze

ś

nie.

Enzym "przeł

ą

cza" si

ę

w zale

ż

no

ś

ci od substratu.

Enzymy restrykcyjne klas I-III

Charakterystyka

Typ I

Typ II

Typ III

Aktywność

restrykcyjna i

modyfikacyjna

Pojedynczy enzym
wielofunkcyjny

Oddzielne
restryktazy i
metylazy

Oddzielne e nzymy ze
wspólna podjednostką

Struktura białkowa

endonukleazy

restrykcyjnej

Trzy różne
podjednostki

Prosta

Dwie różne
podjednostki

Wymagania do

restrykcji

ATP, Mg

2+

,

S-adenozylometionina

Mg

2+

ATP, Mg

2+

,

(S-adenozylometionina)

restrykcji

S-adenozylometionina

(S-adenozylometionina)

Charakterystyka

rozpoznawanej

sekwencji

EcoB: TGAN

8

TGCT

EcoK:AACN

6

GTGC

Symetria
rotacyjna
(palindromowa)
(nie dotyczy
IIs)

EcoP1: AGACC
EcoP15: CAGCAG

Miejsce trawienia Przypuszczalnie

przypadkowe, co
najmniej 1000 bp od
miejsca rozpoznawanej
sekwencji

W lub w
pobliżu miejsca
rozpoznawanej
sekwencji

24-26 bp po stronie 3’
od miejsca
rozpoznawanej
sekwencji

Przemieszczenie

DNA

Tak

Nie

Nie

Podział według rodzaju wytwarzanych końców:

tępe końce

- nici rozcięte naprzeciwko siebie - wszystkie nukleotydy są sparowane

z komplementarnymi nukleotydami na przeciwnym łańcuchu

lepkie końce

- 3` lub 5` ssDNA (jednoniciowe) ogony na obu końcach utworzone

lepkie końce

- 3` lub 5` ssDNA (jednoniciowe) ogony na obu końcach utworzone

przez niesymetryczne cięcie , komplementarne do podobnych tworzonych w
innych cząsteczkach DNA przez te same enzymy restrykcyjne niezależnie od
ź

ródła DNA , co pozwala na ligowanie DNA nawet bardzo różniących się

gatunków czyli formowanie chimerycznych molekuł.

Podział według sekwencji rozpoznawanej:

czwórkowe

- rozpoznają sekwencję DNA złożoną z czterech nukleotydów.

Statystycznie w dowolnym DNA takich miejsc jest dużo - co 256 bp.
Restryktazy takie mogą strawić DNA na bardzo małe kawałki.

szóstkowe

- rozpoznają sekwencję DNA złożoną z sześciu nukleotydów.

Dowolne miejsce restrykcyjne złożone z sześciu nukleotydów występuje
statystycznie co około 4096 bp w DNA , w którym ilości poszczególnych
nukleotydów są równe. Proporcje te zmieniają się w zależności od organizmu ,
dlatego dobór enzymu szóstkowego i warunki należy ustalić

dlatego dobór enzymu szóstkowego i warunki należy ustalić
eksperymentalnie.

ósemkowe

- stosowane niezbyt często. Tną DNA bardzo rzadko.

Nomenklatura endonukleaz

Nazewnictwo opiera się na literowych skrótach, w których:

•pierwsza litera pochodzi od rodzaju bakterii ,
•druga i trzecia od gatunku,
•następna litera oznacza szczep lub typ,
•kolejne enzymy z danego szczepu lub typu otrzymują litery rzymskie

Przykłady nomenklatury:

-

NgoM IV - czwarty enzym wyizolowany z Neisseria gonorrhoeae szczepu MS11.

-

Uba 58 I - enzym wyizolowany z niezidentyfikowanej bakterii (Unidentified bacterium)

RFL58
-

BamH I - pierwszy enzym wyizolowany z Bacillus amyloliquefaciens szczepu H.

Restryktazy klasy II

Restryktazy klasy II

Zastosowanie enzymów restrykcyjnych:

Konstrukcja map restrykcyjnych

- Analizuj

ą

c na

ż

elach produkty trawienia danego DNA

ró

ż

nymi enzymami restrykcyjnymi , stosowanymi pojedynczo , w kombinacjach oraz w

ilo

ś

ciach wystarczaj

ą

cych lub niewystarczaj

ą

cych do pełnego strawienia preparatu , mo

ż

na

ustali

ć

wzajemne poło

ż

enie i odległo

ś

ci pomi

ę

dzy sekwencjami rozpoznawanymi przez te

enzymy. Mapa restrykcyjna to obraz cz

ą

steczki DNA , na którym zaznaczone s

ą

miejsca

rozpoznawane przez ró

ż

ne enzymy restrykcyjne z uwzgl

ę

dnieniem odległo

ś

ci mi

ę

dzy nimi

wyra

ż

onej w nukleotydach.

Klonowanie i obróbka DNA

- DNA poci

ę

ty enzymami restrykcyjnymi mo

ż

na poddawa

ć

ligacji z wektorem. W ten sposób tworzone s

ą

zrekombinowane plazmidy czyli plazmidy

zawieraj

ą

ce sklonowany DNA , który mo

ż

na pó

ź

niej poddawa

ć

ró

ż

nym manipulacjom przy

u

ż

yciu odpowiednich enzymów restrykcyjnych.

Badanie polimorfizmu miejsc restrykcyjnych

(RFLP).

RFLP

Ligazy DNA

katalizują formowanie

wiązań fosfodiestrowych pomiędzy
końcem hydroksylowym 3` a końcem
fosforowym 5` DNA. Pozwala to na
reperowanie jednoniciowych przerw w
dupleksie DNA , łączenie fragmentów
restrykcyjnych posiadających
homologiczne lepkie czy też nawet tępe
końce.