ENZYMY

RESTRYKCYJNE

Czym są enzymy
restrykcyjne?



enzymy restrykcyjne - to enzymy z grupy
endonukleaz, zdolne do rozpoznawania
specyficznych sekwencji w DNA (z reguły są to
sekwencje palindromowe) i do przecinania
dwuniciowej cząsteczki DNA w ściśle określonym
miejscu , w obrębie lub w okolicy sekwencji
rozpoznawanej.



Otrzymywane fragmenty DNA nie są losowe a w

każdym prążku na żelu znajdują się cząsteczki

DNA o identycznej sekwencji nukleotydowej.



sekwencja palindromowa - sekwencja DNA, dla której

sekwencja komplementarna jest identyczna (przy

założeniu, że obie sekwencje czytamy z

uwzględnieniem polarności nici; zgodnie z przyjętym

obyczajem - od końca 5' do 3'):



5' A A T T 3'
3' T T A A 5‘

lub



5' A G G C C T 3'
3' T C C G G A 5'

Czym są sekwencje
palindromowe?

Skąd się biorą enzymy
restrykcyjne?



naturalnie występują u bakterii i sinic (z których są

następnie izolowane) stanowiąc element tzw. systemu

"restrykcji-modyfikacji". System ten chroni komórkę

przed wnikaniem obcego DNA (np. DNA

bakteriofagów).



DNA bakterii jest zabezpieczone przed atakami

własnych restryktaz przez metylację niektórych zasad.

Nomenklatura



Nazwy enzymów z reguły są tworzone od
pierwszej litery nazwy rodzajowej i dwóch
pierwszych liter nazwy gatunkowej, pisanymi
kursywą. Po nich może wystąpić kilka liter lub cyfr
arabskich oznaczających szczep bakterii. Nazwa
zakończona jest rzymską cyfrą oznaczającą, jako
który kolejny enzym został on wyizolowany z
danego szczepu., np.

Jak działają enzymy
restrykcyjne?



Enzymy restrykcyjne hydrolizują wiązania
fosfodiestrowe w dwuniciowym DNA, w miejscach
swoistych, zbudowanych najczęściej z 4-6 par
zasad. Produktami hydrolizy są krótkie, ale o różnej
długości fragmenty DNA o końcach nakładających
się, zwanych „lepkimi końcami”. Fragmenty DNA
(fragmenty restrykcyjne) posiadające tego typu
końce mogą się łatwo łączyć ze sobą.

Co to są lepkie końce?



lepkie końce - 3` lub 5` ssDNA (jednoniciowe)

ogony na obu końcach utworzone przez

niesymetryczne cięcie, komplementarne do

podobnych tworzonych w innych cząsteczkach

DNA przez te same enzymy restrykcyjne

niezależnie od źródła DNA, co pozwala na

łączenie DNA nawet bardzo różniących się

gatunków czyli formowanie chimerycznych

molekuł.

Lepkie końce ulegają
modyfikacji poprzez:



Lepkie końce z wystającą nicią 5` - fragment

Klenowa, polimerazy DNA1, oraz kompletu

nukleotydów, a powstające tępe końce ulegają

dalszej modyfikacji.



Lepkie końca z wystającą nicią 3` - ten jednoniciowy
fragment jest usuwany przy pomocy nukleazy S1 lub
polimerazyI E. Coli wykorzystując jej aktywność
egzonukleolityczną 3`(R) 5`



Znane są również enzymy restrykcyjne, w wyniku
działania, których powstają fragmenty DNA o tzw.
tępych końcach (nie nakładających się na
siebie)

Tępę końce ulegają

modyfikacji przez

dołączenie:



Cząsteczek adaptorowych – krótkie fragmenty DNA,
z jednej strony tępe, z drugiej posiadające
specjalnie przygotowane lepkie końca, właściwe dla
danej restryktazy.



Linkerów – zakończone tępo sekwencje łącznikowe,

zawierające miejsca cięcia dla określonych

restryktaz.



W komórce bakteryjnej oprócz restryktaz znajdują
się także enzymy metylujące, tzw. metylazy DNA
(chroniące przed działaniem własnych restryktaz),
które razem z restryktazami tworzą system
obrony przed obcym DNA.



Typowe działanie restryktazy na fragment
cząsteczki DNA

•

Reakcja uwzględniająca modyfikację DNA z

udziałem metylazy (zablokowanie miejsca
przyłączania restryktazy)

Przykłady:



EcoR I –pierwszy enzym wyizolowany z
bakterii Escherichia coli szczepu RY13



Hind III – trzeci enzym wyizolowany z
bakterii Haemophilus influenzae szczepu



BamH I - pierwszy enzym wyizolowany z
Bacillus amyloliquefaciens szczepu H.

Podział enzymów

restrykcyjnych

Klasa I - białka multimeryczne wymagające jako

kofaktorów ATP, S-adenylometioniny i Mg2+



działają zarówno jako restryktazy oraz
kodyfikacyjne metylazy



substrat to dwuniciowy DNA zawierający
zdefiniowaną sekwencję kilkunastu nukleotydów



enzym rozpoznaje sekwencje i w pewnej odległości
od niej nacina obie nici DNA, nie
uzyskuje się ściśle określonych fragmentów DNA

Klasa II - białka proste, występują w postaci

dimerów i tetramerów, in vitro aktywowane Mg2+



enzymy te znalazły największe zastosowanie w
biologii molekularnej



Odpowiadające im metylazy występują jako
oddzielne białka monomeryczne



cięcie obu nici zachodzi w obrębie tej
rozpoznanej sekwencji lub jej pobliżu (klasa IIS)



substratem jest dwuniciowy DNA zawierający
kilku nukleotydową sekwencje specyficznie
rozpoznawaną przez dany enzym



większość enzymów rozpoznaje palindromowe
sekwencje cztero-, sześcio-, lub
ośmionukleotydowe. W wyniku ich cięcia mogą
powstać dwa rodzaje końców, zarówno lepkie jak i
tępe

Klasa III - aktywowane przez jony Mg2+ i ATP,

czasem potrzebna jest S-adenylometionina.



bez znaczenia praktycznego

Podział według sekwencji
rozpoznawanej:



czwórkowe - rozpoznają sekwencję DNA złożoną z czterech
nukleotydów. Statystycznie w dowolnym DNA takich miejsc jest
dużo - co 256 pz. Restryktazy takie mogą strawić DNA na bardzo
małe kawałki.



szóstkowe - rozpoznają sekwencję DNA złożoną z sześciu

nukleotydów. Dowolne miejsce restrykcyjne złożone z sześciu

nukleotydów występuje statystycznie co około 4096 pz w DNA ,

w którym ilości poszczególnych nukleotydów są równe. Proporcje

te zmieniają się w zależności od organizmu , dlatego dobór

enzymu szóstkowego i warunki należy ustalić eksperymentalnie.



ósemkowe - stosowane niezbyt często. Tną DNA bardzo rzadko.

Możemy wyróżnić też:



IZOSCHIZOMERY - enzymy pochodzące z
różnych szczepów, ale rozpoznające te same
sekwencje DNA. Na przykład sekwencję CCGG
rozpoznają enzymy HpaII, HapII, MspI, BsnF.



Interesującą własnością powyższych jest to, że

pomimo tej samej specyficzności substratowej, z

reguły mają zupełnie odmienną sekwencję i

strukturę trzeciorzędową



NEOSCHIZOMERY - enzymy restrykcyjne

rozpoznające tę samą sekwencję DNA

przecinające DNA w odmiennych miejscach.