Ogólne zasady

pobierania i

przygotowywania

próbek do

mikrobiologicznych

metod badawczych

Wykład 17

!!! Według danych epidemiologicznych 1:10

osób rocznie przechodzi zatrucie

pokarmowe

Przyczyny wzrostu częstotliwości zatruć (1) :

•

okoliczności związane z pojawieniem się
nowych czynników zakaźnych takich jak np.:
Listeria monocytogenes; Campylobacter
jejeuni; Escherichia coli 0157:H7

•

zmiany adaptacyjne w znanych patogenach,
prowadzące do powstania szczepów
lekoopornych

•

zmiany demograficzne związane ze starzeniem
się populacji oraz wzrostem populacji o
obniżonej odporności na zakażenia

Przyczyny wzrostu częstotliwości zatruć (2) :

•

zmiany w przemyśle i technologii produkcji
oraz dystrybucji żywności

•

zmiany nawyków żywieniowych:

– spożywanie coraz większej liczby posiłków poza

domem

– powrotem do żywności naturalnej (przetworzonej

w minimalnym stopniu/ gotowej do spożycia)

Spada zainteresowanie konsumentów
żywnością stosunków trwałą

taką jak: susze/

konserwy/ koncentraty na korzyść żywności
przetworzonej w niewielkim stopniu, często
o wysokim stopniu mikrobiologicznego
zagrożenia

Przyczyny wzrostu częstotliwości zatruć (3) :

Nacisk na naturalność prowadzi do:

•

unikania konserwantów

•

obniżenia zawartości soli kuchennej i cukru

•

stosowanie minimalnej dawki cieplnej

•

unikanie temperatur zamrażalniczych

(skutecznie hamujących rozwój drobnoustrojów,
jednakże uszkadzających strukturę produktu)

======================================================================
==============================

!!! Żywność jest doskonałym

środowiskiem do rozwoju

mikroorganizmów

•

Ilość i rodzaj mikroorganizmów w
żywności zależy od warunków jej
pozyskiwania/ przetwarzania/
magazynowania/ dystrybucji

•

Zależnie od ww. czynników w żywności
występują/ mogą się namnażać/ mogą
być przenoszone przez żywność

różne

grupy mikroorganizmów:

•

BAKTERIE

•

DROŻDŻE

•

PLEŚNIE

•

WIRUSY

Źródła zanieczyszczeń, które rzutują na

stan mikrobiologiczny gotowych

artykułów żywnościowych:

•

Surowce pochodzenia roślinnego i
zwierzęcego

(warzywa/ owoce/ mięso różnych zwierząt/

mleko)

•

Woda

•

Stan higieniczny produkcji

(aparatura/ inne

urządzenia)

•

Personel

W trakcie przetwarzania surowca i procesu

technologicznego następuje redukcja lub

wzrost mikroorganizmów w produkcie:

•

Celem przetwórstwa jest taki dobór warunków
przetwarzania, aby znieść lub zahamować
wzrost i aktywność drobnoustrojów
saprofitycznych i chorobotwórczych
- obecność nadmiernej liczby drobnoustrojów
saprofitycznych może prowadzić do zepsucia
produktu

(efekt: zmiana smaku/ zapachu/ konsystencji/

barwy)

- występowanie mikroflory chorobotwórczej
dyskwalifikuje środki spożywcze ze względu na
bezpośrednie zagrożenie zdrowia konsumenta

Drobnoustroje, które mogą znajdować się w

poszczególnych rodzajach żywności i być przyczyną

zatruć pokarmowych :

•

Mięso surowe lub niedogotowane - Salmonella,

Campylobacter

•

Ryby surowe lub niedogotowane - Vibrio, wirusy

•

Żywność gotowana, wtórnie zanieczyszczona w czasie
przygotowań - Staphyloccocus aureus, Salmonella,
Shigella

•

Żywność gotowana, wtórnie zanieczyszczona przez
kontakt z surowcami - odzwierzęce Salmonella,
Campylobacter

•

Żywność gotowana, przechowywana bez chłodzenia -
Clostridium perfringens, Bacillus cereus

•

Żywność gotowana, długo przechowywana w niskiej
temperaturze - Listeria monocytogenes, Yersinia
enterocol.

•

Żywność gotowana, długo przechowywana w warunkach
beztlenowych - Clostridium botulinium

•

Żywność niedosterylizowana - Clostridium botulinium

•

Produkty fermentowane o nieprawidłowej przerwanej
fermentacji - Staphyloccocus aureus

!!! Produkcja żywności bezpiecznej dla

zdrowia wymaga ścisłego przestrzegania:

•

parametrów procesu technologicznego

•

wysokiej higieny produkcji

•

wnikliwej kontroli mikrobiologicznej

-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Nadzór nad obrotem żywności w Polsce, a w

szczególności nad jej jakością zdrowotną

opiera się na działaniu dwu podstawowych

systemów kontroli:

•

Systemie kontroli wewnętrznej:

– zależnej od producenta
– prowadzonej w zakładzie
– opartej na systemie normy ISO 9000

– opartej na ocenie zagrożeń wynikających z

krytycznych punktów kontroli (HACCP)

•

Systemie kontroli zewnętrznej:

– system niezależny od producenta

W zakresie zewnętrznego systemu kontroli

ustawowy nadzór nad jakością zdrowotną

żywności w Polsce sprawują:

•

Państwowa Inspekcja Sanitarna

- podległa

Ministrowi Zdrowia - w osobie Głównego
Inspektora Sanitarnego (

działająca na terenie kraju

poprzez Stacje Sanitarno - Epidemiologiczną

)

•

Weterynaryjna Inspekcja Sanitarna

-

podległa Ministerstwu Rolnictwa i Rozwoju
Wsi

Organa Inspekcji Sanitarnej pobierają

próby w ramach:

•

bieżącej kontroli stanu sanitarno-
higienicznego obiektów

•

podejrzenia o niewłaściwą jakość
zdrowotną oraz nieprawidłową deklarację
lub oznakowanie produktu

•

w związku z interwencją konsumenta

•

w celu oceny prawidłowości przebiegów
procesów produkcyjnych

•

w celu oceny jakości zdrowotnej partii
towarów z importu oraz partii towarów
przeznaczonych na eksport

Akty prawne stanowiące podstawę poboru

prób do badań laboratoryjnych

(1)

:

•

Ustawa z dnia 11 maja 2001 r. o warunkach
zdrowotnych żywności i żywienia

(z późniejszymi

zmianami)

– Rozporządzenie Ministra Zdrowia w sprawie

pobierania i przechowywania próbek żywności
przez zakłady żywienia zbiorowego

– Rozporządzenie Ministra Zdrowia

(13 styczeń 2003

r.)

w sprawie maksymalnych poziomów

zanieczyszczeń chemicznych i biologicznych, które
mogą znajdować się w żywności, dozwolonych
substancjach dodatkowych i pomagających w
przetwarzaniu albo na powierzchni żywności -

określa wymogi mikrobiologiczne

, jakie

powinny spełniać produkty żywnościowe

Akty prawne stanowiące podstawę

poboru prób do badań

laboratoryjnych

(2)

:

•

Ustawa z dnia 24 kwietnia 1997 r. o
zwalczaniu chorób zakaźnych zwierząt
rzeźnych i mięsa oraz Inspekcji
Weterynaryjnej

(z późniejszymi zmianami)

– Rozporządzenie Ministra Rolnictwa i

Rozwoju Wsi w sprawie badań kontrolnych
pozostałości chemicznych, biologicznych,
leków i skażeń promieniotwórczych u
zwierząt żywych, w tkankach lub narządach
zwierząt po uboju i w produktach
spożywczych pochodzenia zwierzęcego

Akty prawne stanowiące podstawę

poboru prób do badań laboratoryjnych

(3)

:

•

Ustawa z dnia 21 grudnia 2000 r. o jakości
handlowej artykułów rolno-spożywczych

(z

późniejszymi zmianami)

– Rozporządzenie Ministra Rolnictwa i Rozwoju

Wsi w sprawie szczegółowych warunków
pobierania artykułów rolno-spożywczych

– Rozporządzenie Ministra Rolnictwa i Rozwoju

Wsi w sprawie szczegółowych wymagań
jakości handlowej tusz wieprzowych

– Rozporządzenie Ministra Rolnictwa i Rozwoju

Wsi w sprawie metod analiz niektórych
przetworów z wieprzowiny

Wymogi mikrobiologiczne, jakie powinny

spełniać produkty żywnościowe:

•

Wyszczególniono środki spożywcze i rodzaje
drobnoustrojów, które mogą w tych
środkach występować i które należy badać

•

Poziom zanieczyszczeń mikrobiologicznych
określono za pomocą dwóch wartości

M

i

m

– M

- oznacza akceptowaną wartość progową,

powyżej której wyniki są dyskwalifikowane

– m

- oznacza wartość równą lub poniżej której

wszystkie wyniki uznawane są za zadawalające

– Określono liczbę próbek (

n

), które należy badać

w danej partii a także liczbę próbek (

c

) z partii

dających wynik pomiędzy

M

i

m

Dyrektywy Unii Europejskiej oraz dokument

Kodeksu Żywnościowego FAO/WHO określają

parametry jakości mikrobiologicznej:

Wyniki badań mikrobiologicznych należy

oceniać następująco:

– stosując trzy kategorie wartości, tzn.:

• do wartości m włącznie
• pomiędzy m i M
• powyżej wartości M

– stosując jedną kategorię wartości zapisaną w

tabelach jako m, od których nie ma odstępstwa,
niezależnie od liczby badanych próbek

– stwierdzenie nieobecności w stosunku do bakterii

z rodzaju Salmonella jest wynikiem
zadawalającym

!!! Zdrowie konsumenta chronione jest

specjalnymi przepisami tzw. NORMAMI

•

Normalizacją metod badawczych, sposobów
pobierania próbek zajmują się zarówno
międzynarodowe jak i regionalne
organizacje normalizacyjne

•

Polski Komitet Normalizacyjny czynnie
uczestniczy w pracach Komitetu
Technicznego

•

PKN na bieżąco wprowadza do zbioru
Polskich Norm normy ISO i EN dotyczące
mikrobiologii żywności i pasz oraz metod
badania skuteczności działania chemicznych
środków dezynfekcyjnych i antyseptycznych

Celem analizy mikrobiologicznej żywności jest:

– ustalenie poziomu ogólnej liczby drobnoustrojów

saprofitycznych

– ocena stanu sanitarnego żywności za pomocą

wskaźnikowych bakterii z grupy coli i Escherichia
coli

– badanie obecności bakterii chorobotwórczych w

celu orzeczenia, czy badana żywność nie zagraża
zdrowiu konsumenta

Analizę mikrobiologiczną poprzedza:

– pobranie próby i opis cech zewnętrznych i

organoleptycznych

– przygotowanie próby do analizy mikrobiologicznej
– ocena mikroflory na podstawie preparatu

mikroskopowego

!!! Podstawowym dokumentem dla wszystkich

laboratoriów badających środki spożywcze

jest norma ISO 7218:1996, wprowadzona do

zbioru Polskich Norm jako PN-ISO

7218:1998 ze zmianą A1:

Mikrobiologia

żywności i pasz - Ogólne zasady badań

mikrobiologicznych

•

Norma podaje ogólne instrukcje
przeprowadzenia badań mikrobiologicznych w
celu zapewnienia jakości badań oraz
ujednolicenia pracy i wdrożenia zasad GLP

(Dobrej Praktyki Laboratoryjnej)

we wszystkich

laboratoriach badania żywności i pasz

•

Norma ta może być wykorzystywana w całości
lub część do akredytacji laboratorium

Pobieranie próbek

(1)

:

•

Pobieranie próbek nie jest częścią ogólnych
zasad mikrobiologicznych

•

Zagadnienia te precyzują odpowiednie
normy odnoszące się do poszczególnych
grup produktów spożywczych

•

Jeżeli laboratorium nie stosuje
znormalizowanych metod pobierania próbek,
to powinna zostać w laboratorium
opracowana i udokumentowana

(opisana)

własna procedura pobierania próbek,
zawierająca tzw.

strategie pobierania

(miejsce/ czas/ liczba/ dobór obiektów/
interpretacja wyników/ itp. )

Pobieranie próbek

(2)

:

•

Parametry techniczne pobierania próbek

(rodzaj

próbnika/ trwałość/ odzysk z matrycy)

powinny być

określone w procesie walidacji danej metody
analitycznej

Cel pobierania i przygotowywania próbek do

badań mikrobiologicznych:

•

otrzymanie reprezentatywnej próbki, której
właściwości mikrobiologiczne będą odpowiadały
właściwościom badanego półproduktu lub
produktu

•

próbki powinny być pobierane losowo w sposób,
który uniemożliwia ich wtórne zanieczyszczenie

(losowy dobór próbek pozwala unikać błędów systematycznych/

zastosowanie rachunku prawdopodobieństwa pozwala oszacować

błąd przypadkowy)

Pobieranie próbek

(3)

:

•

Wszystkie czynności związane z
pobieraniem próbek powinny być wykonane
przez osobę przeszkoloną w zakresie
pobierania próbek do oceny
mikrobiologicznej

•

Przyrządy do pobierania muszą być czyste/
suche/ jałowe

•

Pobieranie próbek powinno być dokonywane
w sposób jałowy (zabezpieczający próbki
przed przypadkowym zanieczyszczeniem
mikrobiologicznym pod wpływem warunków
zewnętrznych)

Pobieranie próbek

(4)

:

Transport próbek do laboratorium:

•

powinien odbywać się w ściśle określonych
warunkach zabezpieczających produkt przed:

– zanieczyszczeniem
– zmianami rodzajów i liczby drobnoustrojów zanim

próbka zostanie poddana badaniu

Istotne jest zachowanie odpowiedniej

temperatury przechowywania produktów:

•

produkty stałe - temperatura pokojowa

•

produkty świeże i chłodzone: 0-4

o

C

•

produkty pasteryzowane i podobne: 0-4

o

C

•

produkty mrożone i nisko mrożone: -18

o

C

Pobieranie próbek

(5)

:

•

Dokumentacja przyjętych próbek

prowadzona w sposób, aby można było

skontrolować cały przebieg analizy

Protokół z pobrania powinien uwzględniać (A) :

•

nazwę i adres jednostki zlecającej badania

•

cel pobrania próbek:

• a) czy na podstawie badania ocenia się partię wyrobu
• b) czy pobiera się próbki, ponieważ partia wyrobu

wydaje się podejrzana

• c) czy znając dostawcę chce się wyrywkowo

potwierdzić deklarowaną jakość

• d) czy pobiera się próbki w trakcie procesu

produkcyjnego celem nadzorowania stanu higieny dla

osiągnięcia i realizowania dobrej praktyki produkcyjnej

Protokół z pobrania powinien uwzględniać (B) :

•

identyfikator próbki

(próbek)

nadany przez

próbkobiorcę lub numer serii wyrobu

•

datę i miejsce pobrania

•

istotne okoliczności pobrania

(z podaniem możliwych

czynników zakłócających późniejsze badanie laboratoryjne)

•

badane czynniki/ składniki próbki

•

nazwisko i podpis osoby pobierającej próbkę,
oraz nazwiska osób współuczestniczących w
pobieraniu próbek,

np. ze strony klienta

•

sposób transportu i przechowywania w
laboratorium

•

datę (godzinę) przyjęcia próbki do
laboratorium

Protokół z pobrania powinien uwzględniać (C) :

•

stan próbki w chwili przyjęcia do
laboratorium

(np. uszkodzenia/ w normie)

•

nazwisko i podpis pracownika przyjmującego
próbkę i wykonującego analizę

•

datę wykonania analizy i metodę badania

•

identyfikator raportu z badań

==================================================================

=======================

Zabezpieczenie próbki oczekującej na

wykonanie badań zabezpieczające przed

zmianą liczby drobnoustrojów:

•

szczególną uwagę należy zwrócić na
temperaturę przechowywania

(j.w.

) i

ostateczny termin badania

•

produkty trwałe: najwcześniej jak to jest
możliwe i przed upływem terminu trwałości

•

produkty świeże i chłodzone: w ciągu 24
godzin od przyjęcia próby do badania
- jeżeli nie można uniknąć dłuższego
przechowywania, próbkę należy zamrozić
jak najszybciej w temperaturze poniżej
-18

o

C, i zaznaczyć to w sprawozdaniu z

badań, ponieważ w pewnych produktach
zamrażanie może zmienić skład mikroflory

•

produkty pasteryzowane i podobne:
najszybciej jak to jest możliwe i przed
upływem terminu trwałości

Przygotowywanie próbek

(1)

:

!!!Ogólne zasady przygotowywania zawiesiny

wyjściowej i rozcieńczeń dziesięciokrotnych

zostały ujęte w normie PN-EN ISO 6887-

1:2000:

Mikrobiologia żywności i pasz -

Przygotowywanie próbek, zawiesiny wyjściowej i

rozcieńczeń dziesięciokrotnych do badań

mikrobiologicznych - Ogólne zasady

przygotowywania zawiesiny wyjściowej i

rozcieńczeń dziesięciokrotnych

•

Większość produktów wymaga, przed
wykonaniem posiewów odpowiedniego
rozcieńczenia, a produkty stałe dodatkowo
rozdrobnienia

(odważanie/ dodanie rozcieńczalnika

(właściwy + jałowy)/ mieszanie/ homogenizacja)

Przygotowywanie próbek

(2)

:

•

Wszystkie czynności wstępne przed wysiewem
powinny być wykonane w warunkach
aseptycznych, zapobiegających zanieczyszczeniu
produktu poprzez sprzęt i otoczenie

Ocena w preparacie mikroskopowym:

•

Do obserwacji mikroskopowych

(w zależności od rodzaju

produktu)

sporządza się:

– preparaty odciskowe barwione (np. ryby/ wędliny)

bezpośrednio z produktu lub z osadu po odwirowaniu
próby (napoje)

– preparaty po homogenizacji

(w preparatach trwałych określa się łącznie komórki żywe i

martwe)

Wykrywanie i oznaczanie

drobnoustrojów

(1)

:

•

W celu jak najszybszej i pełnej identyfikacji
drobnoustrojów konieczne jest stałe
doskonalenie metod ich wykrywania i
ilościowego oznaczania

(stale udoskonala się i

opracowuje nowe metody badawcze)

•

!!! Metody badawcze podlegają
normalizacji

•

Ujednolicenie metod badawczych
umożliwiających wykrycie, identyfikacje i
oznaczenie liczby drobnoustrojów w
określonej ilości próbki środka spożywczego
znajdują się w szczegółowych normach

Wykrywanie i oznaczanie

drobnoustrojów

(2)

:

Opis metody wykonania

(zawarty w odpowiedniej normie):

•

określoną ilość produktu lub jego rozcieńczenia
miesza się z 9-krotną objętością (ml) płynnej
wybiórczej lub selektywnej pożywki płynnej

•

inkubuje się w odpowiedniej temperaturze -
hodowlę płynną przesiewa na podłoże różnicujące
pożywki agarowej

(tak aby otrzymać pojedyncze kolonie)

•

do dalszej identyfikacji wybiera się kilka kolonii

(na ogół 5)

•

zaleca się: stosowanie bulionów odżywczych celem regeneracji
uszkodzonych kolonii/ kilku różnych pożywek wybiórczych lub
selektywnych - płynnych i stałych

Wykrywanie i oznaczanie

drobnoustrojów

(3)

:

•

W zależności od obecności lub nieobecności
poszukiwanych drobnoustrojów

wynik

podaje

się jako : obecne lub nieobecne w
analizowanej ilości

(mililitrach - produkt płynny)

lub (gramach - inne produkty)

!!! Uzyskane wyniki nie można uogólniać na
inne wyższe ilości produktu

•

Tradycyjne, klasyczne metody identyfikacji i
określenia ilości drobnoustrojów oparte są na
metodach:

– bezpośrednich - mikroskopowych
– pośrednich - hodowlanych

Wykrywanie i oznaczanie

drobnoustrojów

(4)

:

•

Tradycyjne metody są pracochłonne i
czasochłonne, gdyż wynik oznaczenia
uzyskiwany jest po ok. tyg.

•

Współcześnie, coraz częściej stosuje się metody,
które pozwalają na skrócenie czasu badania

(czas

analizy nie powinien przekraczać 24 godzin/ preferuje się
metody, w których wynik uzyskuje się po 2-3 godzinach)

Szybkie metody (I) :

– immunologiczne
– molekularne (np. PCR)
– bioluminescencja
– wykrywanie ATP, itp.

Szybkie metody (II) :

Wprowadzenie do rutynowej kontroli

szybkiej metody badań mikrobiologicznych

jest uzależnione od kilku parametrów:

– możliwości uzyskania szybkiego wyniku

(najlepiej

po 30 minutach do 2 godzin)

– wysokiej czułości

(możliwości wykrycia niewielkiej

ilości mikroorganizmów lub ich toksyn)

– poniesienia możliwie niskich kosztów
– możliwości dokonania obiektywnego odczytu

wyniku

(za pomocą odpowiedniej aparatury)

– łatwość procedur

(mała pracochłonności)

– możliwość zautomatyzowania badań
– możliwość eliminacji wyników fałszywie (+) i (-)

Szybkie metody (III) :

•

Zastosowanie nowych metod wymaga
przeprowadzenia wielu badań w celu
lepszego i pełniejszego wykorzystania ich
w mikrobiologii

•

Metody te przeważnie nie są uznawane
urzędowo i są tylko częściowo
znormalizowane

•

W przyszłości szybkie metody
najprawdopodobniej będą stanowić
podstawę szybkiej identyfikacji
czynników etiologicznych zatruć
pokarmowych

Obecne zagrożenia mikrobiologiczne w

produkcji i przechowywaniu żywności to

między innymi :

•

Powstawanie nowego rodzaju żywności

•

Rozpowszechnienie produktów spożywczych z

innych stref klimatycznych

•

Zmiany metabolizmu samych drobnoustrojów

===================================================================================

====================

!!! Konieczne jest

(w celu ochrony zdrowia konsumenta i

zapewnienia bezpieczeństwa żywności)

opracowanie

wspólnych norm w zakresie:

•

specyficznych zasad pobierania próbek i
przygotowywania rozcieńczeń do badań produktów
mięsnych, rybnych i mleczarskich

•

horyzontalnych metod wykrywania i identyfikacji
drobnoustrojów

•