Reakcja PCR (polymerase chain reaction), łańcuchowa reakcja polimerazy, jest techniką, przy użyciu której możemy powielić dowolny fragment DNA o długości od kilku do kilkuset tysięcy nukleotydów. PCR został opracowany w połowie lat 80-tych (1983) przez Kary'ego Mullisa i współpracowników z kalifornijskiej firmy Cetus. Za to osiągniecie Mullis otrzymał Nagrodę Nobla (1993 r.).
Łańcuchowa reakcja polimerazy polega na przeprowadzeniu wielu cyklicznych reakcji syntezy nici DNA w tzw. termocyklerze. Tremocykler jest urządzeniem służącym do sterowania temperaturą. Probówki znajdujące się w termobloku raz są podgrzewane, a raz oziębiane. Zakres zmiany temperatury zależy m.in. od długości odcinka DNA, który planujemy powielić, od długości starterów oraz optimów temperaturowych enzymów (polimeraz). Sterowanie temperaturą możliwe jest dzięki wprowadzeniu do pamięci termocyklera określonego programu, zazwyczaj podanego w opisie metodyki, na podstawie której powielamy badany DNA. Okresowe zmiany temperatury wywołują różnego typu reakcje chemiczne, które zachodząc cyklicznie (np. 35 cykli), doprowadzają do powielenia, określonego przez primery (startery), fragmentu DNA. Tak otrzymany produkt poddajemy dalszej analizie.


Nowoczesny termocykler z panelem dotykowym (fot. Adam Kuzdraliński)

PCR znajduje wiele zastosowań. Wymienić tutaj należy: klonowanie genów, diagnostykę kliniczną, kryminalistykę, identyfikację osób zaginionych, paleontologię, ustalanie ojcostwa czy diagnostykę chorób dziedzicznych. Wykorzystujemy go często w sytuacji, kiedy dysponujemy niewielką ilością materiału badanego.

Przebieg reakcji PCR

Aby doszło do namnożenia fragmentu DNA musimy posiadać odpowiednie składowe reakcji, bez których doświadczenie nam się nie uda. Te elementy to:

- wyizolowana, o odpowiedniej czystości nić DNA (z tkanek, z krwi, z włosów itp.);
- środowisko reakcji (bufor, jony magnezowe oraz odpowiedniej czystości woda);
- primery (inaczej startery, czyli kilku do kilkunastu nukleotydowe sekwencje flankujące znany lub nieznany odcinek DNA);
- dNTP (wolne nukleotydy);
- termostabilna (nie ulegająca degradacji w wysokich temperaturach) polimeraza DNA
- opcjonalnie: substancje stabilizujące polimerazę (w gotowych zestawach, tzw. kitach, substancje stabilizujące znajdują się zazwyczaj w buforach dostarczanych razem z polimerazą).

Gdy dysponujemy wszystkimi elementami przystępujemy do pracy. Do probówek wprowadzamy, przy użyciu pipet oraz tipsów jednorazowego użytku, substancje o odpowiedniej objętości i stężeniu (rzędu mikrolitrów). Kolejność wprowadzania składników jest ważna. Zmiana kolejności dodawania składników może być przyczyną otrzymywania produktów niespecyficznych, a czasem obniżenia aktywności niektórych elementów mieszaniny. Stąd też, rozpoczynamy od wprowadzenia do probówek: wody, buforu, jonów magnezowych, wolnych nukleotydów (dNTP), primerów – często dwóch (jeden syntetyzujący od końca 3’ , a drugi od końca 5’), a następnie dodajemy wyizolowane, o odpowiedniej czystości DNA (mówimy tutaj o typowej reakcji PCR). Najczęściej na samym końcu dodajemy polimerazę. Ze względu na cenę, jest nią zazwyczaj izolowana z bakterii Thermus aquaticus - polimeraza Taq.
Przygotowując większą ilość prób do reakcji, możemy sporządzić mieszaninę o większej – wyliczonej wcześniej – objętości, składającą się z: wody, buforu, jonów magnezowych, primerów, wolnych nukleotydów oraz polimerazy DNA. Tak przygotowaną mieszaninę rozpipetowujemy do probówek przeznaczonych do PCR, następnie do każdej z nich wprowadzamy określoną ilość DNA. Należy pamiętać o dokładnym oznaczeniu probówek!

Gdy w probówkach znajdą się już wszystkie składniki mieszaniny reakcyjnej, przenosimy je do termocyklera, uruchamiamy określony program (wprowadzony wcześniej do pamięci urządzenia) i czekamy do zakończenia reakcji (np. 2,5 godziny). Po zakończeniu procesu, z termobloku wyjmujemy probówki. Reakcję możemy pozostawić w urządzeniu na noc, pamiętajmy jednak o ustawieniu termocyklera tak, aby po zakończonym PCR utrzymywał próbki w temperaturze 4 stopni C. W przypadku modyfikacji PCR, metody PCR-RFLP, do każdej z prób dodajemy enzym restrykcyjny (np. AluI, HaeIII, EcoRI lub inne), którego zadaniem będzie pocięcie – otrzymanych np. w wyniku łańcuchowej reakcji polimerazy – fragmentów, na odcinki różnej długości.

Cięcie następuje w miejscach restrykcyjnych, rozpoznawanych przez enzym, stąd też gdy brak będzie takich miejsc – brak będzie produktów reakcji, a po elektroforezie na żelu zauważymy jedynie pojedyncze prążki, bez rozdziału na frakcje różniące się długością.

Po okresie inkubacji z enzymem (najczęściej w temperaturze 36 stopni C) przenosimy badany DNA na żel agarozowy lub poliakryloamidowy i poddajemy rozdziałowi elektroforetycznemu. Rozdziału dokonujemy w obecności bromku etydyny, który świeci pod wpływem promieni UV.

Zdolność bromku etydyny zarówno do wnikania pomiędzy zasady azotowe DNA jak i emitowanie promieniowania pod wpływem UV, pozwoliło wykorzystać go jako znacznik do wizualizacji efektów reakcji PCR.

Otrzymane w postaci świecących prążków wyniki archiwizujemy, a następnie poddajemy dalszej analizie, statystycznej bądź też innej.


Bromek etydyny świeci w świetle UV (fot. Adam Kuzdraliński)

Przebieg reakcji PCR

W wysokiej temperaturze (zwykle około 95°C) dochodzi do denaturacji podwójnej nici DNA (rozdzielenia się na dwie) . Jest to wynik pękania wiązań wodorowych pomiędzy zasadami azotowymi (purynami i pirymidynami). W temperaturze niższej, ściśle określonej dla danej pary starterów (najczęściej przedział pomiędzy 45-65°C), następuje ich asocjacja do matrycy. Podwyższenie temperatury do około 72°C powoduje przyłączenie się polimerazy DNA do miejsca asocjacji starterów z matrycą DNA. Powstały kompleks rozpoczyna syntezę nici komplementarnej do matrycy. Po zakończeniu pierwszego cyklu reakcji następuje kolejny, czyli: denaturacja, przyłączanie starterów oraz synteza nici DNA. Po ostatnim cyklu, w temperaturze 72 stopni C, przez okres zazwyczaj 5 minut następuje końcowe wydłużanie.

Warunki reakcji PCR

25 µl - całkowita objętość próby
w tym:
- 100 ng (zazwyczaj 1 µl) DNA;
- 15 pmol każdego z primerów;
- 100 µM dNTP;
- 1.5 mM MgCl2
- 0.6 U Taq DNA polimerazy, w standardowym buforze do PCR

Przykładowe warunki temperaturowe łańcuchowej reakcji polimerazy:

- 94 stopni C przez 5 min - wstępna denaturacja
- 94 stopni C przez 40 s - denaturacja nici
- 60 stopni C przez 40 s - przyłączanie starterów do nici DNA
- 72 stopni C przez 40 s - przyłączenie polimerazy do dupleksu primer-matryca i synteza łańcucha
- (35 cykli)
- ostatnie wydłużanie w 72 stopni C przez 5 minut.

Gdyby wydajność reakcji PCR była stuprocentowa, po n cyklach reakcji z jednej cząsteczki można by uzyskać 2 do n-tej potęgi cząsteczek DNA. W praktyce wydajność reakcji PCR jest nieco mniejsza. Nie zmienia to jednak faktu, że PCR pozwala na geometryczne zwielokrotnienie pożądanego odcinka łańcucha DNA oraz to, że metoda ta jest bardzo czuła.

Przydatne informacje związane z reakcją PCR

- Jony magnezowe występują przeważnie w postaci chlorków lub siarczanów.

- Woda wykorzystywana do reakcji PCR powinna być świeżo destylowana, dejonizowana, filtrowana przez filtr 0,22 μm i autoklawowana.

- Nukleotydy chelatują jony magnezowe, dlatego też dodaje się nadmiar jonów magnezowych.

- BSA, siarczan amonu, Triton, DTT, stabilizują polimerazę, modyfikują oddziaływanie matryca-primer.

- Ze względu na degenerację kodu genetycznego, przygotowywane na bazie sekwencji aminokwasowej primery powinny składać się ze wszystkich możliwych kombinacji kodonów dla danego aminokwasu.

- Stopień zdegenerowania jest iloczynem możliwej liczby kodonów dla wybranej sekwencji aminokwasowej.

- Temperatura topnienia jest to temperatura dysocjacji dupleksu primer-matryca.

- Gorący start służy ograniczeniu hybrydyzacji niespecyficznej. Polega na dodaniu ostatniego odczynnika, najczęściej polimerazy, po uprzednim podgrzaniu próbki.

- Wartość temperatury topnienia rośnie wraz z ze wzrostem zawartości cytozyny i guaniny w łańcuchu. Jest to spowodowane tym, iż pomiędzy tymi zasadami występuje po trzy wiązania wodorowe, natomiast pomiędzy adenina i tymina tylko dwa.

- Przy projektowaniu primerów należy zwrócić uwagę na to, by nie miały sekwencji palindromu. W przeciwnym wypadku może dojść do hybrydyzacji w obrębie pojedynczego startera.

- Polimeraza Taq - enzym ten popełnia dużo błędów, dlatego też nie poleca się go do klonowania oraz tworzenia konstrukcji genowych. Charakteryzuje go brak aktywności egzonukleolitycznej 3’-5’ – jednego z mechanizmów korekcji błędów.

- Najmniej błędów możemy spodziewać się stosując polimerazę Pfu (pochodzi z Pyroccus furiosus), enzym ten wykazuje aktywność egzonukleolityczną.

- Aktywność egzonukleolityczna zmniejsza szybkość i wydajność reakcji PCR, dlatego też często stosuje się mieszaniny polimeraz np. Taq + Pfu.

- Polimeraza Taq nie generuje tępych końców. Na końcach zsyntetyzowanego DNA pozostawia dwie adenozyny.

- Reakcja PCR wykazuje wysoką czułość. Nawet pojedynczy egzemplarz poszukiwanej sekwencji powinien zostać amplifikowany. W praktyce czułość ta jest jednak niższa co spowodowane jest obecnością inhibitorów polimerazy DNA, które pochodzą z tkanek.

- W reakcji PCR używamy nadmiaru primerów, po to aby zapobiec renaturacji matrycowego DNA.

- W zależności od tego, jakiej długości odcinki DNA będziemy rozdzielać, dobieramy odpowiednie stężenie żelu agarozowego:

Stężenie agarozy [%]		Długośc rozdzielanego DNA [pz]
0,3		5000 - 60 000
0,6		1000 - 20 000
0,7		800 - 10 000
0,9		500 - 700
1,2		400 - 600
1,5		200 - 300
2,0		100 - 200