Woda (18,82)
Bufor stęż. 10 razy (już z jonami magnezu) (2,5)
Primery (1,3)
Mieszanina nukleotydów (0,65)
Matryca (1,5)
Polimeraza (0,23) – 1 jednostka na 1 reakcję
1 + 2 + 3 + 4 + 5 + 6 = 25 mikrolitrów
Ad. 2
10 – 100 r-ru, x – 25 r-ru x = 2,5 buforu reszta = 25 – 2,5 = 22,5
x : reszta = 2,5 : 22,5 = 1 : 9
Bufor: 1:9 rozcieńczenie 10 razy w całym r-rze 25 mikrolitrów
Ad. 3
Stężenie primerów 100 mikromolarne (mieszanina 2 primerów)
90 wody + 5 primera 1 + 5 primera 2 10 primera, więc rozcieńczony (nowe stężenie)
Ad. 6
Polimeraza – 1 jednostka na 1 reakcję
Stężenie 5 jednostek na 1 mikrolitr, więc 1/5 = 0,2 (troszkę więcej dodajemy)
2l r-ru buforu 50-razy rozcieńczonego 1960 wody i 40 buforu
Rozpuszczamy agarozę 2% w 200 ml r-ru
1 g subst : 100 ml r-ru 4 g agarozy i uzupełniamy do 200 ml
r-r 6-krotnie stężony – bufor obciążający 1:5
15 mieszaniny, więc 3 buforu (bo 3 : 15)
denaturacja wstępna 95 stopni, 10 minut
im dłuższa matryca tym wyższa temperatura
mitochondrium – 94 stopnie jądro – 95 stopni
denaturacja właściwa 95 stopni, 30 s
annealing 51 stopni, 30 s
temp < 4x GC + 2x AT (około o 5 stopni mniej)
elongacja 72 stopnie, 40 s
czas zależy od długości mamy 1300 i 700 nukleotydów
1 min 20 s dla najdłuższego produktu, ale mamy szybszą polimerazę, więc 40 s
elongacja końcowa 72 stopnie, 5 minut
2 i 3 i 4 powtarzają się
Robimy 42 cykle