DROBNOUSTROJE W OCHRONIE ŚRODOWISKA

Wykład 1; 7.10.2013 r.

Udział mikroorganizmów w rozkładzie związków organicznych

Obieg pierwiastków polega na ich przechodzeniu z form nieorganicznych lub nieożywionych organicznych do struktur kom i z powrotem do abiotycznej części ekosystemu.

Szybkość obiegu pierwiastka zależy od jego ilości w przyrodzie, stąd makroelementy (C, H, O, N, P) krążą szybciej niż mikroelementy (Mg, K, Na, Cl) czy pierwiastki śladowe (Co, Cr, Cu, Mo, Ni, Se, Sn, V, Zn, B).

Należy też wziąć pod uwagę funkcję poszczególnych pierwiastków.

Najważniejsze procesy biologiczne to:

٠ Wiązanie CO2 atmosferycznego przez autotrofy dzięki energii świetlej (fotoautotrofy) lub chemicznej (chemilitoautotrofy) - jest to gromadzenie energii w związkach chemicznych np. tłuszczach, olejach, węglowodanów, białkach.

٠ Asymilacja i mineralizacja materii organicznej przez heterotrofy (reducenci).

٠ Wiązanie azotu atmosferycznego przez nieliczne wyspecjalizowane gatunki bakterii i archeony.

Typy troficzne bakterii

• Fotolitoautotrofy (fotolitotrofy, fotoautotrofy)
źródłem energii dla tych drobnoustrojów jest promieniowanie słoneczne, dostarczycielem elektronów i węgla są związki nieorganiczne, nalezą tu glony, cyjanobakterie, bakterie zielone i purpurowe, wytwarzające w procesie fotosyntezy związki bogate w energię.

• Fotoorganoheterotrofy:
źródłem energii są promienie słoneczne, w warunkach beztlenowych wykorzystują związki organiczne.

• Chemolitoautotrofy (chemolitotrofy, chemoautotrofy)
energię, elektrony i węgiel czerpią z substancji nieorganicznych-…, należą tu bakterie nitryfikacyjne, siarkowe, wodorowe, żelazowe.

• Chemoorganoheterotrofy (chemoorganotrofy, chemoautotrofy):
jako źródło energii, elektronów i węgla wymagają związków organicznych; należą tu drożdże, pleśnie i liczne bakterie wykorzystywane w biotechnologii

• Mikrotrofy:
mikroorganizmy, które do budowy materiału komórkowego wykorzystują związki organiczne, a energię uzyskują z utleniania wodoru.

W przypadku protistów i bakterii zdolnych do przeprowadzania fotosyntezy część gatunków może korzystać zarówno z energii światła, gdy jest dostępne, jak i wykorzystywać związki organiczne jako źródło energii, gdy światło nie jest dostępne. Organizmy takie określa się jako miksotrofy. Energię pozyskują jednocześnie z utleniania związków organicznych jak i nieorganicznych.

Obieg tlenu

Tlen jest wydzielany do atmosfery w procesie fotolizy wody w trakcie tlenowej fotosyntezy.
Z bakterii w tym procesie udział biorą Cyanobacteria, dominujące w morzach i oceanach.

Część tlenu wykorzystywane jest w procesach oddychania fototrofów, nadmiar wykorzystują heterotrofy oddychające tlenowo i produkujące CO₂

CO₂+H₂OCH₂O+O₂ (fotosynteza tlenowa)

CH₂O+O₂CO₂+H₂O (oddychanie tlenowe)

Obieg węgla

Ma on charakter gazowy ze względu na CO₂ - główny rezerwuar w atmosferze (760 Gt), a na ziemi głównym rezerwuarem są oceny ( 40 000 Gt węgla, a ograniczony C to 2500 Gt).

W glebach znajduje się 1 500 Gt C, jako budulec organizmów żywych lub związki organiczne (650 Gt). Co roku uwalniany jest C do atmosfery jako CO₂ w ilości 6,5 Gt. Spore rezerwy węgla kontynentalnego znajdują się w wiecznej zmarzlinie (900 Gt)

Węgiel występuje w trzech stopniach utlenienia:

٠ CH₄ – najsilniej zredukowany

٠ (CH₂O)_n­ – ekwiwalent węglowodanów

٠ CO₂ i CO – najsilniej utleniany

Chemiczne przemiany obiegu węgla włączają takie procesy jak:

٠ Biosynteza materii organicznej węgla nieorganicznego przez autotrofy (fotosynteza i chemosynteza) w warunkach tlenowych i beztlenowych

٠ Utlenianie CO przez bakterie (CO+H₂OCO₂+2H⁺+2e^-)

٠ Biodegradacja materii organicznej (mineralizacja, dekompozycja, transformacja)

٠ W ekosystemach lądowych reducentami z domeny Bacteria są Actinobacteria (promieniowce).

٠ W mineralizacji biorą udział liczne bakterie beztlenowe powodujące kolejne etapy:

- hydrolizujące i fermentujące

- octogenne

- metanogenne

Obieg azotu

Przemiany miedzy rożnymi formami azotu w biosferze są prowadzone głownie przez mikroorganizmy.
Głównym rezerwuarem azotu jest N atmosferyczny.
Ulega on przemianie do jonów amonowych w procesie wiązania azotu cząsteczkowego z udziałem bakterii symbiotycznych i wolnożyjących (Bacteria, Archea) (tzw. diazotrofy).

Jony amonowe są utleniane do azotanów dwustopniowo przez dwie fizjologiczno-biochemiczne grupy bakterii chemolitotroficznych: nitrozobakterie i nitrobakterie.

Jony azotanowe mogą być redukowane do azotu cząsteczkowego na drodze denitryfikacji lub amonifikacji azotanów, lub też w reakcji anamoks jony amonowe są utleniane beztlenowo, azotyny redukowane są do azotu cząsteczkowego, a jony amonowe są jako akceptory elektronów.

Stopnie utlenienia azotu zmieniają się od -3 do +5; -3 (NH₄⁺, NH₃, NH₂-org.), (N_2­); +3 (NO₂^-); +5 (NO₃ ^-).

Obieg fosforu

Fosfor znajduje się w postaci np. apatytu, fosforytu w skalach i jest uwalniania z udziałem bakterii heterotroficznych i grzybów, do formy przyswajalnej - jony fosforanowe zamieniane w  fosforany organiczne.
Bakterie kumulujące fosfor: Bacillus sp., Pseudonocardia zijngensis, Paracoccus yeeii, Dechloromonas sp., Rhodocylus sp.

Bakterie uwalniające fosfor poprzez rozpuszczenie fosforanów wydzielając kwasy organiczne: Bacillus (B. brevis, B. cereus, B. cirulans, B. firmus, B. subtislis, B. licheniformis, B. megaterium, B. mescenterans), Pseudomonas (P. strata, P. cissicola, P. fluorescens, P. aeruginosa, P. pinophilium) zasiedlające ryzosferę roślin motylkowych, ryżu, palm kokosowych, soi, kukurydzy.

Grzyby rozpuszczające fosfor: Aspergillus niger, A. flavus, A. nidulam, A. carbonum, A. fumigatus, A. terreus, A. wentii, Penicillium digitalium, P. simplicissimum, P. aurantiogriseum, Sclerotium rolfsii, Paecilomyces fusisporus, oraz gatunki z rodzajów Cephalosporium, Alternaria, Fusarium, Rhizoctonia.

Inne bakterie wiążące fosfor: Escherichia freundii, Escherichia intermedia, Serratia phosphaticum, Achromobacter sp., Corynebacterium sp., Ervinia sp., Nicrococcus sp., Serratia sp., Anabaena sp., Nostoc sp., Xanthomonas sp.

Obieg siarki

Rezerwuarem siarki jest siarka elementarna, siarczki metali i gips (CaSO₄), siarczany w  wodach i ladach.

W obiegu uczestniczą 3 grupy troficzne:

٠ bakterie fototroficzne – zielone bakterie siarkowe (Chlorobi), purpurowe bakterie siarkowe (Chromatiaceae, Ectothiorhodaspirillaceae). Są to beztlenowce zasiedlające środowiska ekstremalne.

٠ chemolitotrofy – Thiobacillus, utleniają siarkowodór, siarczki i siarkę pierwiastkową (purpurowe)

٠ inne o nieustalonym statusie troficznym – bezbarwne bakterie siarkowe – Beggiatoa, Thiotrix.

Obieg żelaza

Żelazo występuje w postaci hematytu, magnetytu, syderyty, getytu, limonitu, pirytu i innych.
Bieg żelaza ma charakter osadowy z uwagi na brak form lotnych jest tez pierwiastkiem deficytowym w morzach i  ocenach.
Istnieje wiele bakterii  i archeonów (tzw. FRM) zdolnych do redukcji Fe (III)

Obecnie znanych jest ponad 100 gatunków zdolnych do redukcji Fe (III) w warunkach beztlenowych. Ponad połowa występuje w środowiskach psychro-mezofilnych (nie są psychrofilami, ale psychrotolerantami), pozostałe bytują w warunkach termofilnych i hipertermofilnych (gorące źródła, wody geotermalne, kominy hydrotermalne).

Wśród termofilnych poznano niedawno szczep 121, Geogemma barossi, rosnący w temperaturze 121^oC.

Hipertermofilne utleniają wodór w warunkach beztlenowych (chemolitoautotrofy), zaś mezofile utleniają wiele związków organicznych do CO₂ i H₂O.

Mikroorganizmy w obiegu żelaza – domena Bacteria (na kartce od Pawlikowskiej)

Mikroorganizmy w obiegu żelaza – domena Archea (na kartce od Pawlikowskiej)

Mikroorganizmy w obiegu żelaza

Najlepiej poznane są rodzaje Geobacter i Shewanella.

• Geobacter - wyizolowany z mułu rzeki Potomac; obecnie wykazano, że jest w osadach rzecznych i morskich oraz w glebie. Bakterie z tego gatunku wykorzystują kwasy organiczne (np. octowy, mrówkowy, mlekowy), alkohole (etanol), związki aromatyczne (fenol, toluen) i H₂ jako źródło węgla i energii.
• Schewanella - zawiera 44 gatunki bakterii, które są psychrofitami, psychrotolerantami i piezofilami, niektóre zaś są patogenami. Izolowano je np., z prób klinicznych, chłodni, produktów mięsnych, masła, pras olejowych, zbiorników słodkowodnych, ujść rzeki, bagien słonych, wody i osadów morskich, ryb, zwierząt morskich, lodu i śniegu morskiego. Są to względne beztlenowce, wykorzystują nieorganiczne akceptory elektronów, np. Fe³⁺, Mn⁴⁺, NO₂.

Wyróżnia się dwie grupy ekologiczne:

٠ gatunki psychrotolerancyjne i niehalofilne związane z produktami żywnościowymi i środowiskami takimi jak gleby, wody gruntowe, osady jeziorne i ścieki.

٠ gatunki psychrofilne, psychrotolerancyjne i halofilne.

Mikroorganizmy w obiegu żelaza – bakterie utleniające Fe²⁺

Utlenianie Fe²⁺ dostarcza minimalnych zasobów energetycznych, jednak istnieje pewna grupa bakterii, która ten proces prowadzi.
Głównie zachodzi w oceanach, gdzie tlen w osadach dennych jest w bardzo małym natężeniu i dodatkowo jest mało żelaza. Głównie dotyczy to okolic kominów geotermalnych.

Do takich bakterii należą: chemolitotroficzne bakterie styliskowe z rodzaju Galionella (G. ferrugihea, G. ferricapsiformans, G., corneola), Siderosydans (S. lithotrophicus, S. paludicola) i Ferotrophicum radicicola, oraz izobaty z wód gruntowych (ES-1, ES-2).

Drugą grupą bakterii uleniających Fe²⁺ są bakterie ługujące rudy żelaza.

Rozkład materii organicznej

Rozkład ten jest zależny od organizmów fotosyntetyzujących, czyli roślin wyższych, glonów i cyjanobakterii. Z uwagi na to, że na Ziemi przeważają środowiska z warunkami beztlenowymi, to za te procesy odpowiadają bakterie beztlenowe.
Warunki beztlenowe panują w wetlandach, osadach rzeki, osadach ujścia rzek, osadach morskich beztlenowym słupie wody, reaktorach beztlenowych, składowiskach odpadów organicznych oraz w przewodach pokarmowych zwierząt. Także w biofilmach spotyka się środowiska beztlenowe.

Bakterie prowadzące rozkład materii organicznej w warunkach beztlenowych to chemoorganotrofy. Jednak jeden rodzaj czy gatunek bakterii nie jest w stanie rozłożyć wszystkich związków, stąd mówimy o wspólnocie mikroorganizmów, która ma większy potencjał do degradacji różnorodnych związków.

Materia organiczna trafiająca do środowiska, czy to w postaci naturalnej czy jako ksenobiotyk (zanieczyszczenie), ulega biodegradacji.
Biodegradacja, jest to proces rozkładu materii organicznej, na składniki podstawowe. Inaczej proces ten nazywa sie dekompozycją lub utlenianiem materii organicznej z wydzieleniem energii.
Organizmy, które rozkładają tę materię z wydzieleniem energii to heterotrofy tzw. reducenci.

W warunkach beztlenowych produktami rozkładu materii organicznej są:

- tylko CO₂ gdy akceptorem elektronów są azotany, siarczany i/lub Fe(III) (bakterie denitryfikacyjne, bakterie redukujące siarczany, bakterie redukujące Fe(III))

- CO₂ i CH₄ przy braku egzogennych akceptorów elektronów (archeony metanogenne)

- octan – w przewodzie pokarmowym roślinożerców, ale w procesie zwanym metanogenezą hydrogenotroficzną powstaje metan (archeony metanogenne).

Klasyfikacja bakterii beztlenowych

W zależności od tolerowanej ilości tlenu w środowisku wyróżnia się:

- ścisłe beztlenowce - nie rosnące w obecności tlenu nawet w ilościach śladowych

- obligatoryjne beztlenowce - tolerują tlen w ilościach śladowych

- mikroaerofile - rosną w zmniejszonych stężeniach tlenu

- fakultatywne beztlenowce – zdolne do wzrostu przy normalnym stężeniu tlenu (jako końcowego akceptora elektronów) lub w warunkach beztlenowych (inny akceptor elektronów).

Trzeba pamiętać, że bakterie beztlenowe nie stanowią jednolitej grupy, ale można podzielić je na prowizoryczne 2 grupy:

- zawierające indywidualne typy jak Chlorobi, Chloroflexi, Chrysiogenetes, Coprothermobacteria, Defferibactere, Dictyogloml, Fibrobacteres, Fusobacteria, Spirochaetes, Synergistetes, Thermodesulfobacteria, Thermotogae.

- zawiera zarówno bakterie tlenowe jak i beztlenowe: Acidobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes, Firmicutes, Nitrospira, Proteobacteria.

Typowymi tlenowcami są: Chlamydiae, Cyanobacteria, Perrumicrobia, Planctomycetes.

Charakterystyka bakterii beztlenowych

• Chlorobi – beztlenowe zielone bakterie siarkowe, zawierające bakterio chlorofil (Bchl) typu c, d lub e.

Jedna rodzina Chlorobiaceae zawiera rodzaje: Chlorobium sp., Ancalochloris sp., Chloroherpeton sp., Chlorobaculum sp., Pelodictyon sp., Prostchecochloris sp.

Typowym gatunkiem jest Chlorobium tepidum rosnący w gorących źródłach (temperatura 40-50^oC, pH 4,5-6,0). Prowadzi on następujące reakcje:

2n H₂S+n CO₂2n S + n(CH₂) + n H₂O

n H₂S + 2n CO₂ + 2n H₂O n H₂SO₄ + n H₂SO₄ + 2n (CH₂O)

• Chloroflexi – ten typ zawiera 2 rzędy:

- niefotosyntetyzujące Herpetosiphonales, żyjące w gorących źródłach
- nitkowate trichomy fotosyntetyzujące Chloroflexales, zawierające Bchl a: Chloroflexus, Oscillochloris, Chloronema, Heliothrix, Roseiflexus.

Wśród fototropicznych Chloroflexi wyróżnia się 4 filotypy:

- termofile zasiedlające gorące źródła (70-72^oC) w Japonii i Irlandii – Chloroflexus

- mezofile słodkowodne (30-40^oC) - Oscillochloris, Chloronema

- morskie halofile – Heliothrix

- bez chlorosomów – Roseiflexus.

• Chrysiogenetes – zawiera jeden gatunek Chrysiogenes arsenatis izolowany z kopalni złota w Australii. Redukuje As(V) do As(IV), spalając m.in. octan.

• Defferibacteres – są to gram ujemne pałeczki, izolowane z pól naftowych Morza Północnego. Wykorzystują jony Fe(III), Mn(IV) i azotany jako akceptory elektronów, rozkładając proste kwasy organiczne i aminokwasy jako źródło C i energii. Przykładem jest Flexistipes sinusarabici – halofil Morza Czerwonego.

• Dictyogloml – zawiera jeden rodzaj z dwoma unikatowymi pod względem morfologicznym gatunkami (D. thermophilum, D. turgidum). Duża komórka centralna, otoczona jest przez asocjacje pojedynczych komórek połączonych ścianami komórkowymi. Występuje w gorących źródłach są zdolne do fermentacji węglowodanów (ksylany), z wytworzeniem wodoru.

• Fibrobacteres – występuje w przewodzie pokarmowym ssaków, prowadzą fermentację celulozy i skrobi do kwasu mrówkowego, octowego i bursztynowego.

• Fusobacteria – zawiera rodzaje Fusobacterium, Cetobacterium, Hyobacter, Leptotrichia, Propionigenium, Sebaldella, Sneathia, Streptobacillus. Prowadzą fermentację węglowodanów i/lub fermentację aminokwasów.

• Spirochaetes – znajdują się tu tlenowe i beztlenowe rodzaje: Spirochaeta, Treponema, Serpulina, Brachyspira, Leptonema, Borrelia, Leptospira. Wiele gatunków występuje w przewodzie pokarmowym termitów oraz karaluchów, trawiąc lignocelulozę, a także w przewodach morskich i słodkowodnych gatunków mięczaków. Gatunki niepatogenne są sacharolityczne i występują w osadach dennych i ściekach.

• Synergistetes – zawiera rodzaje: Aminiphilus, Aminobacterium, Aminomonas, Anaerobaculum, Cloacibacillas, Dethiosulfonivibrio, Jonquetella, Synergistes, Thermovigra, Thermanaerovibrio. Mają zdolność degradacji aminokwasów. Występują w różnych środowiskach beztlenowych, także w przewodzie pokarmowym ssaków, jak też w jamie ustnej człowieka.

• Thermotogae – zawiera rodzaje: Thermotoga, Fervidobacterium, Geotoga, Martinitoga, Petrotoga, Thermosipho. Izolowano je z morskich systemów hydrotermalnych oraz z pól naftowych kontynentalnych oraz z solfatar o niskim zasoleniu. Rosną w wysokich temperaturach 89-90^oC przy pH 7,0. Fermentują węglowodany w szlaku Embdena-Meyerhofa z wydzieleniem wodoru.

• Thermodesulfobacteria – zawiera dwa rodzaje Thermodesulfobacterium i Thermodesulfatator. Pierwszy rodzaj to bakterie ściśle beztlenowe termofile (65-75^oC), redukujące siarczany, występujące w gorących źródłach, kominach hydrotermalnych, zbiornikach oleju napędowego. Drugi rodzaj występuje w kominach hydrotermalnych (55-80^oC), także redukujące siarczany.

• Acidobacteria – ten typ zawiera gatunki hodowlane np.:

- Acidobacterium capsulatum – występuje w glebach kwaśnych i mineralnych.

- Geothrix fermentas – beztlenowy chemorganotrof, wykorzystuje Fe(III) jako akceptor elektronów.

- Holophaga foetida – gatunek homoacetogenny.

- Solibacter usitatus – zdolny do degradacji di chlorobenzenu.

Znajduje się w tym typie wiele gatunków niehodowalnych, występujących w różnych środowiskach: gleby, osady, ścieki, systemy rozprowadzające wodę, bagna, kwaśne wody kopalniane, gorące źródła, kominy hydrotermalne, katakumby.

• Actinobacteria – nieliczne gatunki zdolne są do wzrostu beztlenowego prowadząc fermentację cukrów. Zebrane są w 4 rodziny:

- Actinomycetaceae (Actinomyces, Arcanobacterium, Actinobaculum, Mobiluncus)

- Bifidobacteriaceae (Bifidobacterium, Gardnerella, Parascardovia, Scardovia)

- Propionibacteriaceae (Propionibacterium, Probionimicrobium) – patogenny, komensale przewodu pokarmowego

- Cariobacteriaceae (Atopodium, Slackia, Coriobacterium, Collinsella) – patogeny.

•Bacteroidetes – (Flavobacterium-Cytophaga-Bacteroides). Ten typ tworzą 4 rodziny:

-Bacteroidaceae (Bacteroides, Acetomicrobium, Acetothermus, Acetofilamentum, Anaerophaga, Anaerorhabdus, Megamonas)

- Rikenellaceae (Rikenella, Alistipes, Marinilabilia)

- Porphyromonadaceae (Porphyromonas, Dysgomonas, Tonerella)

- Prevotollaceae (Prevotella)

Są to pałeczki, występują we środowiskach mezofilnych i termofilnych, fermentują węglowodany do kwasów C1-C4.

• Firmicutes – tutaj wyróżnia się dwie główne grupy:

- fakultatywne beztlenowce, jak bakterie mlekowe (Lactobacillaceae, Aerococcaceae, Carnabacteriaceae, Enterococcaceae, Leuconostocaceae, Streptococcaceae)

- beztlenowce, jak klasa Clostridia i Erysipelotrichia.

Są szeroko rozpowszechnione w środowisku i odpowiadają za degradację polimerycznej materii organicznej (celuloza, lignoceluloza, pektyny, białka, aminokwasy).

• Nitrospira – typ ten zawiera Thermodesulfovibrio, zdolny do redukcji siarczanów, wykorzystuje do wzrostu mleczan i pirogronian, utleniając je do octanu.

• Proteobacteria – Gramujemne pałeczki. Wiele z nich to fototrofy – purpurowe bakterie bezsiarkowe (Rhodospirillales), zawierające Bchl a lub b oraz purpurowe bakterie siarkowe (Chromatiaceae), zawierające barwniki brązowe, czerwone, różowe czy beżowe. Mogą rosnąc fotoorganoheterotroficznie, ale także jako fotolitoautotrofy wykorzystujące wodór, siarczki lub żelazo jako donory elektronów. Procesy fermentacji prowadzą w ciemności.

٠ α-Proteobacteria:

- Rhodospirillaceae - Rhodospirillum, Phacospirillum, Rhodocista, Rhodospira, Rhodovibrio, Skermanella, Thalossospira

- Rhodobactraceae – Rhodobacter, Rhodobacea, Rhodothalassium, Rhodovulum

- Bradyrhizobiaceae – Rhodoblastus, Rhodopseudomonas

- Hyphomicrobiaceae – Blastochloris, Rhodomicrobium, Rhodoplanes

٠ β-Proteobacteria – należą tu fototrofy zawierające Bchl a oraz karotenoidy, nie tworzą jednej linii filogenetycznej. Rosną fotoheterotroficznie. W ciemności w warunkach beztlenowych prowadzą fermentację, w tlenowych zachowują się jak heterotrofy. Do fototrofów tlenowych należą rodzaje:

- Rhodocyclus

- Rhodoferax

- Rubrivivac

Do beztlenowych heterotrofów należą rodzaje:

- Azoarcus

- Thauera

- Dechloromonas

- Formivibrio

- Hydrogenophila

- Oxalobacter

٠ γ-Proteobacteria – należą tu purpurowe siarkowe beztlenowce zebrane w dwie rodziny.

- Chromatiaceae z rodzajami: Chromatium, Allochromatium, Amoebobacter, Halochromatium, Halothiobacillus, Isochromatium, Lamprobacter, Lamprocystic, Marichromatium, Pfennigia, Phacospirillum, Rhadbochloridium, Thermochromatium, Thioalkalicoccus, Thiobaca, Thiococcus, Thiodietyon, Thiocystis, Thioflavicoccus, Thiohalocapsa, Thiolamprovum, Thiopedia, Thiorhodococcus, Thriohodovibrio, Thiospirillum.

- Ectothiorhodospirillaceae z rodzajami: Ectothiorhodospira, Alkalimicola, Alkalispirillum, Halorhodospira, Thriorhodospira.

Gatunki z rodziny Chromatiaceae wykorzystują zredukowane związki siarki utleniając je do siarczanów, mogą też odkładać siarkę pierwiastkową wewnątrz komórki. Gatunki z rodziny Ectothiorhodospirillaceae wydzielają siarkę pierwiastkową na zewnątrz komórki.

Także do tej grupy bakterii należą beztlenowe heterotrofy zebrane w kolejne 2 rodziny:

- Succinivibrionaceae – Succinivibrio, Rumnibacter, Anaerobiospirillum, Succinomonas – prowadzące fermentację weglowodanów do octanu i bursztynianu, zasiedlają przewody pokarmowe ssaków domowych

- Enterobacteriaceae

٠ δ- Proteobacteria – tu znajdują się beztlenowe bakterie redukujące siarczany oraz rodzina Geobacteraceae, zdolna do redukcji Fe(III).

Degradacja materii organicznej

Roślinna materia organiczna składa się z:

- łatwo degradowalnych składników (aminokwasy, cukry, białka, kwasy tłuszczowe, kwasy nukleinowe) (8-56% suchej masy).
- kompleksów węglowodanowych, umiarkowanie degradowalne np. celuloz, hemiceluloza (20-80% suchej masy)

- substancje trudno degradowalne jak np ligniny i woski (6-34% suchej masy).

Dodać należy, że ligniny nie są rozkładane w warunkach beztlenowych, a w warunkach tlenowych rozkładają je nieliczne gatunki bakterii.

Proces rozkładu ligniny, celulozy, hemicelulozy prowadzą głównie grzyby. Takim modelowym jest Phanerochaetec chrysosporium (Basidiomycota). Rozkłada on ligninę tlenowo w obecności glukozy (kometabolizm).

Procesy uczestniczące w rozkładzie materii organicznej

- hydroliza

- acydogeneza

- acetogeneza

- metanogeneza

• Hydroliza - rozkład cząsteczek polimerycznych, przy udziale hydrolaz do monomerów, np. cukrów prostych, aminokwasów czy kwasów organicznych.

• Acydogeneza – procesy fermentacyjne, gdzie z monomerów powstają kwas mlekowy, propionowy, masłowy, etanol, propanol, butanol, aceton oraz CO₂ i wodór.

Wyróżnia się fermentację glikoli tyczną i neiglikolityczną.

٠ Fermentacja glikolityczna gdzie z węglowodanów powstają:

- etanol (f. alkoholowa)

- kwas mlekowy (f. homomlekowa)

- etanol i kwas mlekowy (f. heteromlekowa)

- etanol, octan, wodór, CO₂, bursztynian, mleczan, szczawiooctan (f. typu coli)

- kwas masłowy, octowy i wodór (f. alkoholowa)

- butanol, 2-propanol, octan, aceton, etanol i wodór (f. masłowa)

- etanol, mleczan, octan, mrówczan, bursztynian, 2,3-butanodiol (f. homomlekowa)

٠ Fermentacja nieglikolityczna:

- fermentacja propionowa- Propionibacterium spp, Clostridium propionicum, Selenomonas spp., Micromonospora spp. Bakterie występują w żwaczu i jelicie przeżuwaczy, fermentują heksozy i prowadzą przemiany kwasu mlekowego i pirogronowego do kwasu propionowego. Nie występują w glebie i wodzie.

- fermentacja aminokwasu przez różne gatunki beztlenowców, prowadzące do powstania kwasów tłuszczowych, CO₂, amoniaku.

- fermentacja metanolu prowadzona przez archeony metanogeneza, które produkuję etan w warunkach atmosferycznych (z CO₂ i H₂) lub heterotroficznych (powstaje także CO₂).

• Acetogeneza - produktami końcowymi są kwasy octowy i mrówkowy oraz CO₂ i H_2.

Kwas octowy powstaje na drodze:

- utleniania związków organicznych (np. heksozy do octanu)

- wiązania CO₂ reduktywnym cyklu acetylo-CoA, z wytwarzaniem octanu przez połączenie 2 cząsteczek CO₂

- reaktywnej karboksylacji bursztynylo-CoA do 2-ketoglutaranu z udziałem bakterii mających enzymy reduktywnego cyklu kwasów trikarboksylowych (TCC).

Znanych jest ponad 100 gatunków bakterii acetogennych, zebranych w 22 rodzajach w różnych środowiskach: gleby, osady denne, przewód pokarmowy wielu zwierząt (w tym człowiek i termity). Najliczniej reprezentowane są rodzaje: Acetobacterium, Clostridium, Moraxella sp.

Do tej grupy zalicza się też bakterie redukujące siarczany, wykorzystujące mleczan i propionian Desulfovibrio, Desulfofola, Desulforegula, Desulfotalea, Desulfocapsa, Desulfocella, Desulforhopalus, Desulfofustis, Desulfosporosinus, Thermodesulfovibrio, Thermodesulfobacterium.

• Metanogeneza - zachodzi w warunkach beztlenowych przy ograniczonej ilości azotanów, siarczanów lub utlenionego żelaza i manganu. Czyli w bogatych w związki organiczne osadach, bagnach, zatopionych gruntach rolnych (pola ryżowe), oczyszczalniach ścieków, a także w przewodzie pokarmowym zwierząt.

Jako źródło energii prowadzony jest przez archeony metanogenno, z typu Euryarchaeota.

Istnieją 3 kategorie metanogenów, wykorzystujących 3 grupy substratów:
- hydrogenotrofy utleniające H₂ i redukujące CO₂ tworząc metan (fakultatywne chemolitotrofy)

- grupa wykorzystująca związki metylowe: metanol, metylaminy, dimetylosiarczki (obligatoryjne metylotrofy)

- grupa najmniej liczna wykorzystująca octan (obligatoryjne acetotrofy).

Dodatkowo wyróżnia się hydrogenometylotrofy redukujące metanol wodorem oraz metanogeny alkohotroficzne tworzące metan w środowisku z CO₂ i alkoholami jako donorami elektronów.

Wykład 2; 14.10.2013 r.

Charakterystyka organizmów uczestniczących w degradacji ścieków w kontekście metod oczyszczania ścieków

Ścieki

Definicja – są to wody zużyte na potrzeby bytowo-gospodarcze, przemysłowe i inne.

Znajdują się w nich różne zanieczyszczenia w tym toksyczne, substancje rozpuszczalne i nierozpuszczalne.

Podział ścieków

Ze względu na skład chemiczny i pochodzenie ścieki dzielimy na 5 podstawowych grup:

- ścieki bytowo-gospodarcze

- ścieki przemysłowe

- ścieki rolnicze

- wody opadowe

- wody podgrzane

Dodatkowo wyróżnia się ścieki komunalne, które są mieszaniną ścieków bytowo-gospodarczych i przemysłowych oraz wód opadowych.

• Ścieki bytowo-gospodarcze

Powstają w gospodarstwach domowych. Są mętne o szarożółtym zabarwieniu, alkaliczne. Zawierają zanieczyszczenia organiczne (60%) i nieorganiczne (40%) w postaci zawiesin i rozpuszczalnej.

• Ścieki przemysłowe

- to wody zużyte procesach technologicznych i od tego zależy ich skład (nieorganiczny lub organiczny)

- wiele zawiera substancje toksyczne i/lub metale ciężkie

- najbardziej niebezpieczne dla organizmów żywych są ścieki z koksowni, przemysłu petrochemicznego, garbarni, rzeźni, celulozowni

- niektóre rodzaje (z rzeźni, garbarni) mogą zawierać patogeny.

• Ścieki rolnicze

- różnią się od typu produkcji rolnej

- najbardziej niebezpieczna jest gnojowica

• Wody opadowe

- zawierają duże ilości zanieczyszczeń organicznych i nieorganicznych

• Wody podgrzane

- powstają w procesach technologicznych

• Ścieki komunalne

- mieszanina ścieków bytowo-gospodarczych, przemysłowych i wód opadowych.

Metody oczyszczania ścieków

• Metody mechaniczne

- wyłapywanie zawiesin oraz elementów stałych przez kraty o różnym prześwicie, sita i piaskowniki
- usuwane są tłuszcze i łatwo opadające zawiesiny (tzw. osad pierwotny)

• Metody chemiczne (głównie ścieki przemysłowe)

- neutralizacja ścieków – wyrównanie pH do neutralnego, przez dodanie odpowiedniego związku (zależy od pH wyjściowego), dla kwaśnych ścieków jest to Ca(OH)₂ lub NaOH, a dla alkalicznych H₂SO₄

- koagulacja zawiesin koloidalnych

- ekstrakcja niektórych zanieczyszczeń

- dezynfekcja ścieków (chlorem lub ozonem).

• Metody biologiczne:

Wykorzystuje się fizjologiczną aktywność wyselekcjonowanych zespołów mikroorganizmów, czasem także glony i rośliny wyższe. Dzieli się je na metody naturalne i sztuczne.
٠ metody naturalne przypominające procesy samooczyszczenia

- pola irygowane – po nawiezieniu ścieków na pole, na powierzchni gleby tworzy sie błona biologiczna, złożona z różnorodnych mikroorganizmów, które degradują i mineralizują związki organiczne i zawiesiny w ściekach. W ten sposób można oczyszczać ścieki na glebach piaszczystych lub piaszczysto-glinianych
-stawy biologiczne (ściekowe, stabilizujące, utleniające) – zbiorniki ziemne o niewielkiej głębokości, przez które przepływają ścieki i w których zachodzą kolejne etapy biologicznego oczyszczania przez mikroorganizmy

٠ metody sztuczne to hodowle ściśle wyselekcjonowanych mikroorganizmów, prowadzone w bioreaktorach, mogące tworzyć błonę biologiczną (złoża biologiczne) lub kłaczki osadu czynnego (metoda osadu czynnego). Procesy oczyszczania zachodzą zarówno w fazie tlenowej jak i beztlenowej.

Osad czynny

Jest to metoda powszechnie stosowana do biologicznego oczyszczania. Hoduje się zespoły mikroorganizmów w napowietrzanych reaktorach przez które ścieki przepływają.

Głównie bakterie, tworzą po pewnym czasie tzw. kłaczki osadu czynnego. Oprócz bakterii rozwijają się także pierwotniaki, wrotki, nicienie, larwy owadów czy pajęczaki. Ogólna liczba bakterii w osadzie waha się od 1,6x10⁹/ml do 2,3x10¹²/ml.

Kłaczki osadu czynnego zbudowane są z różnorodnych mikroorganizmów, głównie z bakterii, pozakomórkowych substancji polimerycznych i cząsteczek organicznych i nieorganicznych. Frakcja mikroorganizmów stanowi od 5 do 20% całości kłaczków. Decydują też one o jego strukturze i wytrzymałości na zniszczenia fizyczne. Np. kłaczki zbudowane z bakterii należących do β-, γ- i δ-Proteobacteria oraz Actinobacteria nie są podatne na zniszczenia, zaś te zbudowane z α-Proteobacteria i Firmicutes szybciej się rozpadają.

Mikroorganizmy występujące w ściekach

Zespoły mikroorganizmów w ściekach odpowiadające za usuwanie związków organicznych i pierwiastków biogennych ze ścieków. Od takich zespołów zależy efektywność biologiczna oczyszczania ścieków. Trzeba pamiętać, że jedynie 10-15% wszystkich mikroorganizmów wchodzących w skład zespołu mikroorganizmów, to organizmy hodowlane. Dopiero metody molekularne, w tym rybonukleinowe, sekwencjonowanie i włączenie sond genowych FISH pozwoliła na poznanie pełniejszej puli mikroorganizmów biorących udział w oczyszczaniu ścieków. Takie badania, prowadzące do poznania jak najpełniejszej puli mikroorganizmów, są potrzebne do zrozumienia zależności ekologicznych zachodzących w tym środowisku.

W klasycznym osadzie czynnym występuje wiele grup fizjologicznych bakterii, także bakterie bezwzględnie beztlenowe redukujące żelazo, siarczany czy archeony metanogenne.

Udział procentowy grup fizjologicznych bakterii i archeonów w osadzie czynnym

Grupa fizjologiczna:

Bakterie wykrywane metodą FISH – udział 80%

Tlenowe bakterie heterotroficzne- 74%
Bakterie redukujące azotany- 71%
Mikroorganizmy akumulujące fosfor 4%
Mikroorganizmy kumulujące glikogen ?
Bakterie redukujące Fe3+ 4%
Bakterie redukujące siarczany 3-4%
Archeony metanogenne 0-1%
Bakterie utleniające amon (nitrozobakterie) 2-3%
Bakterie utleniające azotyny (nitrobakterie) 2-3%
Bakterie żelaziste (utleniające Fe2+) 0-1%

W przebadanych do tej pory ściekach przemysłowych i komunalnych, zidentyfikowano przy wykorzystaniu różnorodnych technik molekularnych, zespół mikroorganizmów osadu czynnego.

Stwierdzono, że dominują w tym zespole bakterie z β-Proteobacterie: Zooglea ramigera, Azoarcus sensu lato, także Alcaligenes latus, Brachymonas denitrificans oraz e mniejszej ilości α-Proteobacteria, typ Nitrospira, typ P;anctomycetes i typ Chloroflexi.

Największe znaczenie mają bakterie nitkowate.

Bakterie nitkowate

Bakterie te obniżają sedymentację kłaczków sedymentację kłaczków osadu czynnego lub powodują pienienie się osadu. Namnażają się obficie gdy w bioreaktorze jest małe stężenie tlenu, ale są wystarczające ilości źródła pokarmu dla mikroorganizmów, pH<6,5 i występują miejsca beztlenowe.

Bakterie tradycyjne (morfologia) wyodrębniły 7 grup bakterii nitkowatych:

- gram ujemne tworzące pochewki np. Sphaerotilus natans, Haliscomenobacter hydrosis

- gram dodatnie tworzące pochewki

- wielokomórkowe podobne do cyanobacterii np. Nostocoida limicola

- cienkie skręcone bakterie np. Microthrix parvicella

- proste wielokomórkowe gram ujemne bakterie

- nitkowate poruszające się ruchem ślizgowym np. Beggiatoa

- dodatkowe typy np. Nocardia

Microthrix parvicella odpowiada za utylizację lipidów zbudowanych z długich kwasów tłuszczowych w warunkach beztlenowych. Odpowiada też za pęcznienie osadu czynnego.

Thiothrix sp. zdolny jest do utylizacji octanu i/lub CO₂. W warunkach beztlenowych mogą gromadzić granularną siarkę w środowisku z tiosiarczanem i octanem.

Bakterie nitkowate występujące w osadzie czynnym – przykłady (tabela na kartkach)

Mikroorganizmy odpowiedzialne za usuwanie fosforu

Fosfor odpowiada za eutrofizację wód, a usuwanie go hamuje ten proces, co jest zjawiskiem pożądanym w oczyszczaniu ścieków. Można go usuwać przez precypitację solami żelaza lub aluminium i usuwać z osadem.

Jednak alternatywna droga z wykorzystaniem mikroorganizmów jest najczęściej wykorzystywana w oczyszczalniach. Jest to proces cykliczny, polega na naprzemiennej hodowli osadu czynnego, w warunkach tlenowych i beztlenowych. W warunkach beztlenowych bakterie heterotroficzne kumulujące polifosforany pobierają rozpuszczone związki organiczne i przekształcają je tworząc polihydroksy-ß-maślan.

Bakterie usuwające fosfor – przykłady (izolowane klony)(tabela na kartkach)

Bakterie usuwające fosfor – przykłady (na kartkach)

Bakterie nitryfikacyjne

W ściekach zarówno rolniczych jak i przemysłowych, występują 2 grupy fizjologiczno biochemiczne bakterii nitryfikacyjnych, które prowadzą rozkład związków azotu dwuetapowo:
1. Nitrozobakterie- przekształcają jony amonowe do azotanów
2. Nitrobakterie- utleniające azotany do azotynów.

Przykładem nitrozobakterii izolowanych ze ścieków są Nitrosomonas europea, Nitromonas mobili-gatunek samolubny, także rodzaje Nitrospira, Nitrosolobus, Nitrosovibrio.

Przykładem nitrobakterii są: Nitrospira, Nitrobacter. Nadmienić należy, że różnią się one strategią życia: Nitrospira rozwija się w ściakach o stosunkowo małym stężeniu azotu i tlenu, a Nitrobacter w podwyższonych stężeniach obydwu pierwiastków.

Bakterie denitryfikacyjne

Prowadzą one proces redukcji azotanów do azotu cząsteczkowego i podtlenku azotu. W osadzie czynnym powszechnie występują bakterie z rodzajów: Allcaligenes, Pseudomonas, Bacillus, Paracoccus.

W ściekach przemysłowych w zależności od rodzaju związku organicznego oraz akceptora elektronów, odbywa się selekcja bakterii denitryfikacyjnych np. metanol selekcjonuje bakterie z rodzaju Paracoccus i Hyphomicrobium, a fenol – Azoarcus.

Metody konwencjonalne

Hodowle glonów- głównie zielenice (Chlorella, Stichorococcus, Scendesmus, a dla zasolonych ścieków Spirulla), hodowle prowadzi się w postaci zawiesiny (jednokomórkowce) lub błony biologicznej (glony nitkowate). Stosuje się je do mineralizacji niewielkich ilości azotanów.

Metoda nitryfikacji i denitryfikacji z wykorzystaniem nitrozobakterii i nitrobakterii. Efektywność tego procesu zależy m.in. od ilości biomasy, źródła węgla organicznego, typu urządzenia hodowlanego czy formy azotu wchodzącego w przemiany.

Nowe biotechnologie

-SHARON-Biologiczne przekształcenie azotu amonowego w pojedynczym bioreaktorze z napowietrzaniem, w temp. 35 st. C i ph 7. Odczyn pH jest bardzo istotnym czynnikiem hamującym aktywność nitrobakterii. Utlenianie amonu prowadzi do zakwaszenia (powstaje kwas azotowy).

- ANNAMOX-czyli utlenianie amonu w warunkach beztlenowych, w obecności NO2. Reakcję tę przeprowadzają bakterie z rodzajów: Brocadia i Kuenenia (wyizolowane z systemów oczyszczających ścieki) i Scalindea (wyizolowany z Morza Czarnego). Wykazują wysoką aktywność w środowisku o ph 6,4-8,3, w temp. 20-43 st. C dla szczepów mezofilnych i 6 st. C dla morskich. Najbardziej aktywne są bakterie Kueuenia stuttgartiensis.

- SHARON-ANNAMOX – stosunkowo nowa technologia, stosowana jako drugi stopień oczyszczania ścieków.

- CANON - prowadzony przez chemolitoautotrofy, w pojedynczym bioreaktorze gdzie powstaje biofilm z tych bakterii, zarówno tlenowe jak i beztlenowe, głównie należą do rzędu Planctomycetes (Brocardia, Kuenenia).

Najbardziej aktywne są bakterie Kuenenia stuttgarttens…

Związki organiczne rozkładane są na drodze fermentacji i następującej po niej metanogenezy, do mieszaniny metanu i dwutlenku węgla, czyli biogazu.
udział tu biorą archeony metanogenne.

Proces ten jest wieloetapowy:

- hydroliza związków wielocząsteczkowych do monomerów (enzymy hydrolityczne)

- kwasogeneza – fermentacja monomerów do alkoholi i kwasów organicznych (mrówkowego, octowego, masłowego, propionowego) z wydzieleniem CO2 i wodoru

- octanogeneza – powstaje kwas octowy

Proces beztlenowy jest wydajniejszy niż tlenowy, warunkiem jest utrzymanie temperatury powyżej 20^oC czas trwania jest od kilku do 40 dni.

W warunkach sztucznych metan jest wytwarzany w temperaturze 20-45^oC lub 45-60^oC.

Zastosowanie beztlenowego oczyszczania ścieków:

-utylizacja opadowego osadu czynnego
- utylizacja ścieków przemysłu rolno-spożywczego
- utylizacja odpadów z hodowli zwierząt
-utylizacja ścieków bytowych w małych, górskich miejscowościach

UASB – bioreaktory beztlenowe z warstwą osadu i przepływem wznoszącym. Najbardziej efektywne w granulach osadu czynnego znajduje się Clostridium sp., Bacteroides sp., Desulfovibrio sp. W warstwie pośredniej znajdują się bakterie homooctowe – Clostridium acetium, Acetobacterium woodii. W warstwie wewnętrznej występują metanogeny Methanosaeta sp.

Drobnoustroje biorące udział w beztlenowym oczyszczaniu ścieków – tabelka (na kartce)

Udział mikroorganizmów w biodegradacji ksenobiotyków

Ksenobiotyki – definicja

Nie jest to termin precyzyjny. Są to substancje chemiczne, wprowadzone do środowiska głównie za sprawą działalności człowieka, obce dla organizmów żywych. Skażenia środowiska np. pestycydy.

Najbardziej niebezpieczne są hormonomimetyki (modulatory hormonalne) np. organiczne związki cyny, pestycydy chloro organiczne, fenole (penta- i nony fenole), związki ftalowe, ołów, rtęć, kadm.

Czasami sam ksenobiotyk jest obojętny dla organizmu żywego, ale w trakcie jego przemian tworzą się substancje toksyczne dla organizmu żywego.

Oporność ksenobiotyków na degradację

Rozkład w warunkach naturalnych jest powolny gdyż:

-są to związki wytworzone przez człowieka niedawno i większość drobnousastrojów nie jest w stanie ich przekształcić.

- są to często substancje toksyczne, zakłócające procesy fizjologiczne drobnoustrojów

- większość rozpuszcza się w wodzie co utrudnia transport do wnętrza komórki.

Jednak wiele drobnoustrojów zdolnych jest do rozkładu ksenobiotyków, co zawdzięcza swoim zdolnościom adaptacyjnym.

Wiele bakterii, drożdży i grzybów strzępkowych wytwarza BIOEMULGATORY. Czyli związki powierzchniowo-czynne, emulgujące hydrofobowe substraty, co ułatwia pobieranie ksenobiotyku przez drobnoustroje.

Tutaj mamy do czynienia z kometabolizmem, czyli równoczesnym wykorzystywaniem związków łatwo przyswajalnych i transportowaniu ksenobitoyków do mniej toksycznych pochodnych (np. reakcje hydrokksylacji, dehalogenacji, redukcji, demetylacji).

Do najczęściej wymienianych bakterii należą: Pseudomonas sp., Flavobacterium sp., Bacillus sp., Arthrobacter sp., Streptomyces sp. a do grzybów: Aspergillus sp., Mucor sp., Cunninghamella sp., Verticillium sp.

Rozkład ksenobiotyków

Rozkład ten jest w dużej mierze uzależniony jest od cytochromu P-450, który jest składnikiem enzymów oksydo-redukcyjnym (hemoproteina). Bierze on udział w metabolizmie związków alifatycznych, alkalicznych i aromatycznych.

SH+NAD(P)H +H+ +O2-> SOH + NAD(P) + H2O
Gdzie SH- substrat, SOH- produkt.
Wprowadzenie grupy hydroksylowej zwiększa rozpuszczalność substratu w wodzie, ułatwia to jego usuwanie i zmniejsza toksyczność ksenobiotyku.

Enzymy zawierające cytochrom P-450 przekształcają wiele hydrofobowych związków (np. steroidy) a z toksycznych: węglowodory alifatyczne, aromatyczne, pestycydy, barwniki, związki cynoorganiczne.

Rozkład wybranych ksenobiotyków

Węglowodory ropy naftowej

Ropa naftowa to mieszanina węglowodorów:

- węglowodory alifatyczne (alkany, alkeny i alkiny): węglowodory prosto łańcuchowe, węglowodory rozgałęzione, związki cykliczne

- aromatycznych: związki jednopierścieniowe np. benzen, toluen), związki poliaromatyczne (np. naftalen, fenatren, piren)

- związków polarnych: związki zawierające heteroatomy jak azot, siarka i tlen.

Reakcje zachodzące w trakcie biodeterioracji to:

-acetylowanie
-alkilowanie
-dealkilowanie
-dehalogenacja
-hydroliza estrów
-hydroliza amidów

- hydroksylacja pierścienia aromatycznego

- rozerwanie pierścienia

- kondensacja i tworzenie koniugatów

Działalność drobnoustrojów przejawia się w postaci utleniania cząsteczki węglowodoru, rozerwaniem wiązania C-C, atakiem na grupy funkcyjne np. metal.

Drobnoustroje degradujące węglowodory ropy naftowej – bakterie i grzyby (na kartce)

Węglowodory ropy naftowej (na kartce)

Uszeregowanie węglowodorów po względem degradacji (od najłatwiej do najtrudniej rozkładanych)

-liniowe alkany C₁₈-C₂₅

- węglowodory gazowe C₂-C₄

- alkany C₅-C₉

- alkany rozgałęzione do C₁₂

- alkeny C₂-C₁₁

- rozgałęzione alkeny

- węglowodory mono i poliaromatyczne

- cykloalkany

Węglowodory alifatyczne – alkany

Drobnoustroje zdolne do rozkładu tych związków to:

Bakterie: Acterobacter sp., Acinetobacter sp., Nocardia sp., Pseudomonas sp., Rhodococcuss sp., Mycobacterium sp., Sphinghomonas sp., Xanthobacter sp.,

Grzyby: Candida sp., Pichia sp., Torulopsis sp., Cladosporium sp., Aspergillus.

n-alkany ulegają hydroksylacji przy końcowym atomie węgla, po czym następuje utlenianie alkoholi do aldehydów, a kolejnym etapem jest powstawanie kwasów tłuszczowych, rozkładanych w czasie β-oksydacji.

Alkany – utleniające metany

Monooksygenaza metanowa katalizuje powstanie metanolu, utlenianego następnie do formaldehydu (przez dehydrogenazę metanolową), a następnie do kwasu mrówkowego (dehydrogenaza formaldehydowa). Może on zostać przekształcony przez dehydrogenazę mrówczanową do CO2.

W tym procesie biorą udział bakterie metylotroficzne.

Etan, propan i butan mogą być utleniane przez szczepy Pseudomonas methanica w obecności metanu.

Alkany (na kartce)

Rozkład alkanów warunkach anoksji

Jest on słabiej poznany. Potrzebne są alternatywne akceptory elektronów, jak CO₂, sulfoniany, azotany i jony żelaza. Bakterie redukujące sulfoniany δ-proteobacteria. Zdolne są do degradacji alkanów. Bakterie denitryfikacyjne z ß- i γ-proteobacteria. W przypadku metanu zidentyfikowano w dennych osadach morskich konsorcja złożone z archea i bakterii redukujących sulfoniany spokrewnione z rzędem Methanosarcinales i typem Desulfosarcina.

Szczep BuS5 (Desulfosarcina/Desulfococcus) utlenia propan i butan.

Azoarcus sp. HxN1 (denitryfikator) utlenia alkany C₆-C₈.

Desulfobacterium Hdx3 – degraduje alkany C₁₂-C₂₀.

Węglowodory aromatyczne

Związki te mogą być całkowicie rozkładane (mineralizacja) lub częściowo przekształcane przez drobnoustroje na zasadzie ko metabolizmu.

Bakterie Bacillus sp., Mycobacterium sp., Rhadococcus sp., Pseudomonas sp.…

Cyjanobacteria: Oscillatoria sp., Nostac sp., Anabena sp.

Grzyby: Saccharomyces sp., Aspergillus sp., Cunninghamella sp., Penicillium sp.

Proces biodegradacji węglowodorów aromatycznych przez mikroorganizmy obejmuje 5 faz:

Wchłonięcie cząsteczki węglowodoru do komórki(dyfuzja lub specyficzny transport)

Przygotowanie substratu do rozerwania pierścienia.

Rozerwanie pierścienia.

Przekształcenie związku powstałego po rozszczepieniu pierścienia do intermediatów amfibolicznych.

Włączenie intermediatów amfibolicznych do przemian centralnych.

Węglowodory aromatyczne – benzen

Prokarionty wykorzystują w degradacji dioksygenazy. Wprowadzone zostają dwa atomy tlenu do pierścienia aromatycznego, co osłabia jego stabilność, ułatwia rozerwanie wiązań i dalszy rozkłak, prowadzący do powstania cis-dihydrodiolo, ulegających dehydrogenacji do katecholi. W wyniku kolejnych reakcji powstają metabolity włączone do cyklu Krebsa.

Przykładem bakterii degradujących benzen są Pseudomonas rhodochrous, Pseudomonas aeruginosa.

Grzyby strzępkowe nie prowadzą całkowitej mineralizacji. Katalizatorem początkowej reakcji jest monooksydaza z cytochromem P-450. Powstały tlenek arenu (epoksyd) jest związkiem nietrwałym ale stabilnie toksycznym. Może on ulec przekształceniu do fenoli, te zaś sprzęgane są z glukozą, kwasem glukuronowym, siarczanem lub ksylozą.

Grzyby lignolityczne, Phanerochaete chrysosporium, Pleurotus ostreatus wytwarzają zewnątrzkomórkowe enzymy, które przekształcają wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne do pochodnych chinonowych.

Węglowodory aromatyczne

Kwas benzoesowy degradowany przez Pseudomonas putida

Fenol i p-krezol degradowany jest np. przez grzyby strzępkowe Scedosporium spispermum
Toluen biodegradowany przez Burkholderia ce pacia G4. Ralstonia picketti PKO1, Pseudomonas men docina KR1.
Naftalen jest biodegradowany przez Burkholderia ce pacia F297, Pseudomonas sp., grzyby: Candida sp., Debaryomyces sp.
Benzo(o) piren, bezno(o)antracen degradowany ejst głównie przez Candida sp., Cunnighamella sp., Aspergillus sp., Phanerochaete chrysosporium, Trametes versicolor, Bjekandera ad usta, także nieliczne szczepy Mycobacterium sp., Pseudomonas sp., Flavobacterium sp., Bacillus megaterium.

Fenantren degraduje Brevibacterium sp. Dpo 1361, Sphingomonas LB126.

Policykliczne węglowodory aromatyczne – PAH

Związki te są silnie rakotwórcze i mutagenne, hydrofobowe, praktycznie nierozpuszczalne w wodzie. Zdolność do biodeterioracji. PAH wykazują Pseudomonas sp.,Alcaligenes sp., Agrobacterium sp., Rhodococcus sp., Nocardia sp., Mycobacterium sp., Gordonia sp., Artrobacter sp., Mycobacterium sp. Są aktywne wobec naftalenu, fenaefrenu, antracenu, fluoroantenu, piranu, bezno(o)pirenu.
Rhodococcus sp. I Bacillus subtills degradują piren

Grzyby: Cunninghamella elegans, Rhizoctonia solani, Trametes versicolor, Chrysosporium lignorum, aspergillus torreus, aspergillus flavis, penicillium tor dum, sclerotium rotisil, trichoderma harzinum, phanerochaete chrysosporium, bjerkandera sp.

Rozkład związków aromatycznych w warunkach anoksji

Wszystkie szczepy bakterii zdolne do beztlenowej degradacji tych związków należą do bakterii denitryfikacyjnych, żelazowych, siarczanowych, beztlenowych bakterii fotosyntetyzujących i bakterii fermentujących.

Spośród grzybów właściwość tę posiadają Aspergillus sp., Verticillum sp., Acemonium sp.

Oddychanie beztlenowe czyli redukcja jonów Fe (III), Mn (IV), W(V), Cr (VI), U (VI), jest istotnym procesem przy utlenianiu związków aromatycznych.

Geobacter metallireducens- całkowicie utlenia toulen, fenol, p-krezol, benzoensan, z jednoczesną redukcją Fe (III)

Ferroglobus placidus (termofilny archeon) całkowicie utlenia fenol i kwas benzoesowy.

Bakterie redukujące siarczany prowadzą biodegradację szerokiej puli związków aromatycznych (benzen, fenol, naftalen, 2-metylonaftalen, kwasy 1-i 2-naftalenokarboksylowe, fenantren)
Desulfonema magnum-degraduje benzoesan
Desulfobacterium aniline degraduje anilinę i fenol
Desulfonbacterium phenolicum- fenol i p-krezol
Desulfobacterium catecholium- katechol
Desulfobacterium indolicum- indol
Desulfococcus multivorans i Desulfosarcina varibillis- fenylooctan
Desulfobacterium sp. I Desulfococcus sp.- 3-aminobenzooeasn, hydrochinon
Desulfotomaculum sp.- katechol, fenol, p-i m-krezol, alkohol benzylowy, wanilinę.

Fotosyntetyzują bakterie purpurowe utleniają np. benzoesan.
Zdolność do fotoorganotroficznego rozkładu związków aromatycznych wykazują Rhodopseudomonas palustris, Rhodomicrobium vannieli, Rhodospirillum fulvum, Rhodocyclus purpureus, Rhodocyclus gelationosus
Rhodopseudomonas palustris, Rhodomicrobium vannieli rozkładają benzoesan,
4-hydroksybenzoesan, protokatechol.

Bakterie fermentujące związki aromatyczne…

Wykład 3; 21.10.2013 r.

Rozkład pestycydów i biocydów

Pestycydy różnorodna grupa substancji, które są szkodliwe dla organizmów żywych. Do pestycydów mogą także należeć żywe organizmy – pestycydy biologiczne.

Pestycydy stymulują bądź hamują procesy życiowe organizmów (jakąś ich fazę rozwoju).

Cechą charakterystyczną jest to że są dość trwałe i ze względu na trwałość podzielono je na 4 grupy:

- bardzo trwałe – utrzymują biologiczną aktywność przez 30 lat

- trwałe - 2 do 5 lat

- umiarkowanie trwałe - 1 do 18 miesięcy

- nietrwałe - 1 do 12 tygodni.

Bardzo istotne jest wyeliminowanie pestycydów ze środowiska.

Do drobnoustrojów, które rozkładają całkowicie pestycydy należą:

- Trametes versicolor - rozkłada fenantren

- Burholderia cepacia - rozkłada kwas fenoksyoctowy, chorobotwórcza w jamie ustnej dla psów

- Wautersia eutrofa – rozkłada całkowicie pestycydy

- Cunnighamella elegans - …

Kwas fenoksyoctowy - najczęściej rozkładają go bakterie z rodzaju Arthrobacter i Wautersia, następuje monooksygenaza i doksygenaza i powstaje acetylokoenzym A.

Pestycydy chloroorganiczne

Jest to duża grupa związków do których należą DDT, dieldryna, aldryna, lindan, endosulfan, metoksychlor.

Detoksykacja DDT zachodzi tlenowo i beztlenowo. W obecności tlenu prowadzi ją np. Wautersia eutropha.

W warunkach beztlenowych rozkład DDT prowadzą: Brevundimonas diminuta, E. coli, Klebsiella pneumoniae.

Innym pestycydem z tej grupy jest lindan którego degradacje prowadzić mogą bakterie: Bacillus sp., Escherichia sp,. Pseudomonas sp. Rhodanobacter sp., Sphingomonas sp., Clostridium sp., Desulfovibrio sp., grzyby Phanerochaete sp., Pleurotus sp., Trametes sp.

Pestycydy fosfoorganiczne

Ta grupa charakteryzuje się krótszym okresem półrozpadu ale większą toksycznością dla organizmu człowieka.

Zidentyfikowano enzym - hydrolazę fosfororganiczną u bakterii Brevundimonas diminuta i Flavobacterium sp.

Pestycydy piretroidowe i karbaminianowe

Piretroidy to syntetyczne homologi piretryn związków z kwiatów chryzantem oddziaływujących na układ nerwowy owadów. Główną grupą enzymów katalizujących ich przemiany są karboksylazy bakterii Pseudomonas sp, Achromobacter sp., Bacillus sp.

Karbaminiany to sole kwasu karbaminowego. Biodegradują je w procesie hydrolizy Blastobacter sp., Arthrobacter sp., Pseudomonas sp., Micrococcus sp.

Triazyny

To związki z pierścieniem heterocyklicznym z 3 atomami azotu. Z gleby skażonej tym pestycydem wyizolowano Agrobacterium sp., Wautersia sp., Pseudomonas sp.

Biomimetyki hormonalne

To głównie alkilofenole zakłócające pracę układu hormonalnego.

Typowym przedstawicielem są nonylofenole - ksenoestrogeny, stosowane do produkcji wielu produktów powszechnego użycia (nieonowe osrdpki powierzchniowo czynne tzw. plastiki). Innym przykładem ksenoestrogenu jest bisfenol A , wykorzystywany do produkcji m.in. tworzyw sztucznych.

Kolejnym ksenoestrogenem jest oktylofenol używany do produkcji detergentów i pestycydów.

Charakterystyka ksenoestrogenów

Trudno degradowane, usuwa się je fotochemicznie lub metodami ekstrakcji sorpcyjnej.

Okres połowicznego rozpadu w środowisku naturalnym wynosi 28- 104 dni.

Łatwa biokumulacja (wiąże się ze strukturami komórkowymi grzybów m.in. Paecilomyces lilacinus, Mucor sp., Fusarium sp., Rhodotorula sp.)

Obniżają poziom testosteronu, powodując feminizację.

Rozkład nonylofenoli przez drobnoustroje

Proces ten nie jest do końca poznany. Proces wieloetapowy zachodzie przy udziale konsorcjów mikroorganizmów. Biodegradacje tych związków wykazano z hodowanych bakterii rzędu: Sphingomonadales- sphingomonas sp., Sphingomonas cloacae.

A także w hodowli grzybów: np. rodzaj Candida, niektóre gatunki Aspergillus, Trametes versicolor.

Usuwanie mikotoksyn z żywności i pasz przez mikroorganizmy

Najbardziej niebezpieczne są aflatoksyna B1 ochratoksyna A.

Rozkład aflatoksyny B1 do produktu fluoryzującego wykazują Aspergillus (a.) niger, A. parasiticus, A. terreus, A. luchuensis, Penicillium reistrickii.

Całkowitą zdolność usuwania tej toksyny z podłoża oraz z mleka, oleju, masła kakaowego i zboża wykazie Ncardia corynebacteroides.

Także drożdże Kluyveromyces marxianus i bakterie Bacillus megaterium eliminują tę toksynę.

Ochratoksynę A eliminują Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger.

Mikroorganizmy w usuwaniu metali ciężkich. Biodegradacja odpadów organicznych.

Metale ciężkie: żelazo, rtęć, ołów, kadm, chrom, nikiel, miedź, cynk, bizmut, mangan, kobalt, cynk, arsen, telur, selen, molibden; musza mieć odpowiednią gęstość żeby je zaliczyć do metali ciężkich.

Metale ciężkie podzielono na dwie grupy:

- niezbędne do rozwoju i przebiegu procesów metabolicznych np. żelazo, mangan, cynk, miedź, molibden, wanad

- metale o nie znanej funkcji: rtęć, kadm, ołów, cyna, srebro, złoto, platyna.

Toksyczność metali ciężkich

Naturalne źródła emisji metali ciężkich nie stanowią zagrożenia dla środowiska są to:

- wietrzenie skal

- erupcja wulkanów

- procesy glebotwórcze

- pożary lasów

- parowanie oceanów

Niebezpiecznie stają się źródła antropogenie:

- elektrownie i elektrociepłownie, kotłownie lokalne i inne

- procesy spalania w zakładach przemysłowych

- procesy produkcyjne bez procesów spalania

- transport drogowy

- przerób i spalanie odpadów.

Toksyczny wpływ metali ciężkich na organizmy polega na:

- blokowaniu grup funkcyjnych enzymów

- zastępowanie jonów właściwych metali w białkach strukturalnych i enzymach

- indukcji zmian konformacyjnych w biopolimerach.

Metale ciężkie

Pomimo ich toksyczności niektóre mikroorganizmy są zdolne do wzrostu w wysokim stężeniu np. grzyb Penicillium ochrochloron (w nasyconym roztworze siarczanu miedzi).

Taką zdolność do wzrostu w obecności metali warunkują:

- modyfikacje struktury błony cytoplazmatycznej (ograniczenie przepuszczalności dla metali)

- zmiany w budowie ściany komórkowej - zwiększenie syntezy polimerów aktywnych w wiązaniu metali

- produkcja polimerów i drobnocząsteczkowych metabolitów ograniczających dostęp metali dla komórki

- wewnątrzkomórkowa separacja metali.

Niektóre mikroorganizmy wykazują oporność na metale ciężkie warunkowane genetycznie.

Wytwarzają białka wiążące toksyczne metale np. fitochelatynaty i metalotioneiny.

Fitochelatynaty to polimery glutaminianu, cysteiny i glicyny które wiążą metal i transportowane są do wakuoli. Występuje np. u grzyba Schizosaccharomyces pombe.

Metalotioneiny występują np. u bakterii Acidothiobacillus thiooxidans, Acidothiobacillus ferroxidans i grzybów m.in. Saccharomyces cerevisiae i Neurospora crassa.

Inną formą ochrony przed działaniem metali ciężkich jest biotransformacja, zmiana stopnia utlenienia (redukcja, utlenienie, alkilacja, dealkilacja ).

Np. u bakterii Pseudomonas sp., Aeromonas sp., wykryto system mer kodowany plazmidowo, odpowiedzialny za ekspresję reduktazy rtęciowej (Hg²⁺ + rtęć metaliczna)

Drobnoustroje pełnią ważną rolę w obiegu metali ciężkich, mobilizują je poprzez ługowanie, kompleksowanie i chelatowanie.

Mikrobiologiczne ługowanie metali

Ługowanie - proces ekstrakcji związków chemicznych lub pierwiastków przy zastosowaniu odpowiednich rozpuszczalników o działaniu selektywnym.

Mikrobiologiczne ługowanie metali (procesy biohydrometalurgiczne) - wykorzystanie zdolności mikroorganizmów utleniających siarkę i/lub żelazo do przeprowadzenia nierozpuszczalnych siarczków metali w rozpuszczalne siarczany.

Bioługowanie metali służy także do bioremediacji skażonych środowisk - usunięcie i odzyskanie metali.

Największe znaczenie ma immobilizacja metali polegająca na:

- biosorpcji i wewnątrzkomórkowej akumulacji - wiązanie jonów metali przez osłony komórkowe oraz akumulacja w postaci np. polifosforanów

- precypitacji – np. u bakterii Citrobacter sp. powstają kwaśne fosforany w ścianie komórkowej

- wiązaniu przez różne polimery pochodzenia drobnoustrojowego.

Jakie pierwiastki można otrzymać na drodze bioługowania

- antymon

- arsen

- cynk

- miedź

- molibden

- nikiel

- ołów

- uran

Składniki osłon drobnoustrojów wiążące metale ciężkie (na kartce)

Wiązanie metali ciężkich przez drobnoustroje w warunkach laboratoryjnych (na kartce)

Mikrobiologiczne ługowanie metali

W procesach biohydrometalurgicznych (pozyskiwanie metali z ubogich rud)

Najczęściej wykorzystywane są bakterie:

- Acidothiobacillus sp.

- Acidithiobacillus ferrooxidans

- Acidithiobacillus sp.

- Ferribacterium sp.

Acidothiobacillus thiooxidans…

Chemolitoautotrofy…

Ługowanie metali z rud siarczkowych

Ługowanie w stosach..

- formowanie stosów na nieprzepuszczalnym

Ługowanie metali ze skal usypanych w zwały

- masa rudy q1000 x mniejsza

- większe rozdrobnienie

- większa efektywność natleniania

- większa efektywność zraszania

- mniejsze niebezpieczeństwo przegrzania

Ługowanie metali w bioreaktorach przemysłowych

…

Ługowanie metali z rud In situ

- zatapianie nieczynnych kopalni

- metoda odwiertu w skale

…

Drobnoustroje biorące udział w redukcji pierwiastków radiooaktywnych

Do tych pierwiastków zaliczamy uran(VI), TechNet(VII), pluton(VI) i neptun(V).

Bakterie redukują je do poziomu uran(IV), TechNet(IV), pluton(IV) i neptun(IV).

Bakterie wykazujące zdolność do redukcji tych pierwiastków są grupą zróżnicowaną i ogólnie podzielić można je na:

- mezofilne bakterie redukujące siarczany

- termofilne bakterie

- mezofilne bakterie redukujące Fe(III)

- bakterie fermentujące

Drobnoustroje biorące udział w redukcji pierwiastków radioaktywnych – przykłady (powinna wysłać ale nie ma)

Odpady organiczne

Odpady organiczne

To wszelka materia organiczna powstała na skutek działalności zarówno mikroorganizmów i roślin jak i organizmów autotroficznych ale także człowieka w procesach przemysłowych.

W Polsce kompostuje się około 2% materii organicznej. W 2015 r. trzeba będzie kompostować 10% odpadów.

Metody utylizacji materii organicznej

Kompostowanie (% tlenowy) - recykling organiczny prowadzący do powstania kompostu nadającego się jako nawóz organiczny; stosowany do materii roślinnej i zwierzęcej.

Tworzenie biogazu (% beztlenowy - fermentacja) - tworzenie metanu z materii roślinnej, zwierzęcej w tym też ze ścieków.

Mechaniczno-biologiczne przetwarzanie odpadów – recykling odpadów komunalnych (m. stabilizacji lub fermentacji metanowej).

Surowce organiczne nadające się do kompostowania

Surowiec do kompostowania to taki którego wilgotność nie przekracza 60%.

Około połowa odpadów organicznych nadaje się do kompostowania.

Osady ściekowe nadają się jedynie do fermentacji.

Kategorie odpadów organicznych (powinna wysłać ale nie ma)

- rolnicze
- komunalne
- rzemieślnicze
- przemysłu drzewnego
- przemysłu spożywczego
- z innych gałęzi przemysłu
- lokalne odpady organiczne
- z gospodarstw domowych

Wykład 4; 28.10.2013 r.

Mikroorganizmy w usuwaniu metali ciężkich. Biodegradacja odpadów organicznych.

Kompostowanie - co to jest?
To suma procesów mikrobiologicznych zachodzących w warunkach tlenowych prowadzonych przez miliardy mikroorganizmów, związane z tworzeniem humusu.
W trakcie mineralizacji powstaje humus, składający się głównie z kwasów fulwowych i huminowych oraz fulwiny, także zwiększona jest ilość związków azotu i fosforu.
Materia organiczna + O₂ +N +P + mikroorganizmyCO₂ +energia cieplna + humus + mikroorganizmy

Wg Hauga to „biologiczna dekompozycja i stabilizacja surowców organicznych w warunkach, które pozwalają na występowanie temperatur termofilnych jako wynik biologicznej produkcji ciepła, z końcowym produktem dostatecznie stabilnym do magazynowania i wykorzystywania do użyźniania gleb bez niekorzystnych skutków w środowisku”
Ta definicja odróżnia kompostowanie od mineralizacji materii organicznej w środowisku naturalnym.

Technologie kompostowania:
Ekstensywne - w pryzmach, stosach
Intensywne - w kontenerach, komorach, wieżach i bębnach
Pryzmy - najstarsza metoda; materia organiczna rozdrobniona ułożona jest w postaci trójkąta lub trapezu. Muszą utrzymywać temperaturę dla rozwoju termofili. Pryzmy mogą być nienaruszone, mogą być okresowo przerzucane lub stale napowietrzane. Dodatkowo stosuje się zraszanie i napowietrzanie co skraca czas kompostowania (9-12 tygodni).

Kompostowanie w kontenerach i komorach

Różnica polega na objętości bioreaktora (kontener 20 m³, komora 50-100m³)
Bioreaktory te mają system napowietrzania oraz odprowadzania odcieków.
Czas kompostowania jest krótki (2-3 tyg.), a kompost poddawany jest wtórnemu procesowi w pryzmach przez 1-4 miesięcy.

Kompostowanie metodą wieżową…

Procesy kompostowania przypomina hodowle… ciągłą: od góry dostarcza się materiały… a powietrze tłoczy od dołu.
Czas kompostowania jest krótki (2 tyg.), a potem leżakuje w pryzmach przez 4 tyg.

Kompostowanie w bębnach - biostabilizatory…

Materia jest dobrze rozdrobniona i napowietrzona, cały czas przerzucana.
Nie biorą tu udziału grzyby - nie wytwarza się grzybnia z uwagi na ciągłe przerzucanie kompostu.
Po kilku dniach młody kompost dojrzewa w pryzmach przez kolejnych kilka tygodni.

Parametry kompostowania
Najważniejszym parametrem jest stężenie tlenu (do degradacji 100g materii organicznej potrzeba 80g tlenu).
W warunkach beztlenowych, powstają produkty fermentacji (m.in. lotne kwasy tłuszczowe, związki siarki, aminy pierwszorzędowe), które muszą zostać usunięte poprzez dłuższą stabilizację.

	Zakres preferowany	Warunki
	25:1 do 30:1	Stosunki C:N
	50-60%	Wilgotność
	Znacznie więcej niż 5%	Stężenie tlenu
	Różne	Wielkość cząsteczek
	6,5-8	pH
	20-30	temperatura

Termiczne fazy kompostowania:

Są one odzwierciedleniem aktywności metabolicznej zmieniających się populacji mikroorganizmów w degradacji materii, wyróżnia sie 4 fazy:
٠ Faza mezofilna- bakterie i grzyby mezofile, utylizują mezofilne utylizują łatwo dostępną materię z produkcją ciepła do wytwarzania temperatury 45^oC gdzie ich aktywność zostaje przerwana ( komórki wegetatywne giną lub powstają spory)
٠ Faza termofilna - poprzedzona krótką fazą spoczynku, namnażają się mikroorganizmy termofilne - bakterie, promieniowce i grzyby; temperatura optymalna to 50-65^oC, a aktywność enzymatyczna kończy się w 70-80^oC.

٠ Faza schładzania - temperatura powoli maleje, bo produkcja i uwalniane ciepło nie równoważą się. W tej fazie aktywne są termofile: bakterie promieniowe i grzyby.
٠ Resynteza kompostu - przetrwałe mezofile z fazy 1 i gatunki inwazyjne prowadzą degradacje materii organicznej i resyntezę związków humusowych.

Rola mikroorganizmów:
Mikroorganizmy w kompoście pochodzą z roślin i roślinnych odpadów organicznych (rezydenci roślin) i są to mikroorganizmy naniesione.
Na powierzchni roślin znajduje się - szacunkowo ok. 2000 gatunków bakterii i kilkaset gatunków grzybów pleśniowych.
Jeśli materiał do kompostowania jest jednorodny można stosować szczepionki mieszanki mikroorganizmów.
Główną rolę w procesie kompostowania odgrywają bakterie, głównie promieniowce i grzyby pleśniowe.
Mogą też w skład łańcucha pokarmowego w różnych fazach wchodzić pierwotniaki, wrotki, robaki czy skorupiaki.

Przykłady mikroorganizmów biorących udział w kompostowaniu – domena Bacteria (na kartce)

Przykłady mikroorganizmów biorących udział w kompostowaniu – typ Actinobacteria (na kartce)

Przykłady mikroorganizmów biorących udział w kompostowaniu – domena Archea (na kartce)

Przykłady mikroorganizmów biorących udział w kompostowaniu – grzyby (na kartce)

Mikroorganizmy biorące udział w kompostowaniu – zmiany ilościowe (na kartce)

Sukcesja mikroorganizmów (na kartce)

Bakterie w kompoście (na kartce)

Grzyby w kompoście (na kartce)

Dominujące grzyby w kompoście (na kartce)

Grzyby w kompoście (powinna dać ale nie ma)

Grzyby w kompoście
W kompoście zidentyfikowano ponad 300 gatunków grzybów, głównie pleśniowych i drożdży.
Wiele gatunków termofilnych grzybów wytwarza ektoenzymy (amylazy, lipazy, celulazy, ksylanazy, pektynazy, proteazy, fosfatazy).
Wiele gatunków grzybów pleśniowych produkuje laktazy- utlenianie fenolu w procesie humifikacji.

…
Za rozkład ligniny odpowiadają grzyby tworzące tzw. białą pleśń.
……….

Bioutylizacja odpadów keratynowych
Odpady keratynowe głównie pochodzą z przemysłu drobiarskiego.
Głównymi reducentami są mezofile pałeczki Bacillus cereus B_5esz, Bacillus subtilis P₂₂ oraz termofilne Bacillus sp. T₁₄ i Bacillus sp. T₁₆.

Produkcja biogazu
Odbywa się na drodze fermentacji metanowej. Biogaz składa się głównie z metanu (55-70%) i dwutlenku węgla (26-45%).

Dodatkowo może zawierać siarkowodór (0,2-3%) i wodór cząsteczkowy (do 1%).

Biogaz uzyskuje się w trakcie beztlenowego oczyszczania ścieków, ale także w procesach utylizacji odpadów organicznych (roślinnych i zwierzęcych).

Udział bakterii w bioremediacji gleb i wód gruntowych i w usuwaniu zanieczyszczeń powietrza

Bioremediacja
Jest to „alternatywna metoda do tradycyjnej techniki remediacji, tj. wyrównywania zagłębień terenu.

Obecnie rozumiemy to jako metodę biologicznego usuwania skażeń różnego typu metodami biologicznymi, głównie z wykorzystaniem mikroorganizmów, do poziomu bezpiecznego dla życia organizmów.

Dlaczego mikroorganizmy?
Wprowadzony związek jako skażenie do środowiska jest dla nich źródłem węgla i azotu.
Są one powszechne, występują w każdym środowisku, w tym w glebie i w wodzie.
Dzięki właściwością chemotaktycznym mogą dotrzeć do każdego zanieczyszczenia.
Ich bioróżnorodność enzymatyczna pozwala rozłożyć każdy związek zanieczyszczający środowisko.

Jakie mikroorganizmy i dlaczego?

W procesach bioremediacji uczestniczą bakterie (promieniowce, archeony) oraz grzyby.
Mikroorganizmy wbudowują zanieczyszczenia w swoją biomasę, ale także prowadzą procesy:
- mineralizacji - całkowity rozkład związków organicznych
- biotransformacji - przekształcenie na drodze enzymatycznej surowca w produkt mniej toksyczny
- immobilizacji – unieczynnienie skażenia w środowisku, np. formy nieorganiczne pierwiastków przekształcane są w organiczne i wbudowywane w struktury komórkowe.

Rodzaje bioremediacji
Bioremediacja naturalna:
- przebiega samorzutnie
- związana jest z obiegiem pierwiastków w przyrodzie
- dotyczy materii organicznej roślin, resztek obumarłych organizmów
- zachodzi w osadach dennych, wodach samooczyszczających się, w glebach

Bioremediacja naturalna środowisku wodnym
Samooczyszczanie się wód czyli udział mikroorganizmów w obiegu pierwiastków, pozyskiwanych z materii organicznej, w procesach m.in.:
- denitryfikacji
- amonifikacji
- proteolitycznych
- rozkładu związków siarkowych
- rozkład fosforu

Rodzaje bioremediacji
• Bioremediacja inżynieryjna
Suma zabiegów mających na celu usunięcie zanieczyszczenia ze środowiska przez mikroorganizmy (czasem rośliny).
Dwie technologie:
- biostymuluacja - pobudzenie autochtonicznej flory środowiska do usuwania zanieczyszczeń, stwarzając optymalne warunki don wzrostu np. dodając pierwiastki biogenne czy odpowiednie akceptory elektronów
- bioaugmentacja - wprowadzenie mikroorganizmów, także modyfikowanych genetycznie, do skażonego środowiska w postaci inokulum, specjalnie przystosowanych do degradacji tych zanieczyszczeń.

Bioremediacja inżynieryjna

Technologia ex situ usuwanie zanieczyszczeń włączając procesy fizykochemiczne stymulując procesy mikrobiologiczne prowadzone w bioreaktorach i filtrach zraszanych dla zanieczyszczeń ciekłych, biofiltrach i biopuczkach.

Technologia in situ – procesy biostymulacji i bioagumentacji wspierane biowentylacją.

Bioremediacja inżynieryjna ex situ
Bioreaktory - urządzenia hodowlane w których proces jest kontrolowany do usuwania np. wielopierścieniowych węglowodorów aromatycznych.
Biofiltry - bioreaktory do hodowli mikroorganizmów z upakowaną fazą stałą do oczyszczania frakcji gazowych
……………

Rekultywacje – wykopuje się skażoną glebę, dodaje pierwiastki biogenne i rozkłada na przygotowanej powierzchni.

Bioremediacja inżynieryjna in situ
Biowentylacja - tłoczone jest sprężone powietrze do miejsc skażonych: skojarzona jest z pewnymi elementami biostymulacji i bioaugmentacji.
Fitoremediacja - wykorzystywanie roślin do usuwania skażeń z gleby i wody, np. bukszpan, lucerna, pomidory, topole. W tym procesie istotne są mikroorganizmy ryzosfery.

Usuwanie skażeń ropy naftowej - biosurfaktanty
Biosurfaktanty czyli bioemulgatory - środki powierzchniowo czynne produkowane przez bakterie degradujące węglowodory.
Drobnocząsteczkowe biosurfaktanty są glikolipidami: ramnolipidy produkowane przez Pseudomonas sp. czy glukozolipidy syntetyzowane przez Alcanivorax borkumensis.

Polimeryczne biosurfaktanty produkuje Acinetobacter sp.

Zanieczyszczenia podatne na bioremediację

Węglowodory ropopochodne i ich pochodne:

Benzyna, olej napędowy, wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne, kreozot, etery, estry, alkohole, ketony (do produkcji lakierów, farb, perfum)
Węglowodory chlorowcopochodne:
- alifatyczne używane jako smary, rozpuszczalniki w przemyśle samochodowym
- aromatyczne - rozpuszczalniki, pestycydy
Nitroaromatyczne - materiał wybuchowy TNT
Metale ciężkie: cynk, chrom, kadm, kobalt, miedź, ołów, rtęć.

Przykłady bioremediacji - produkty ropopochodne z gleb
Do biodegradacji plam olejowych zdolnych jest ponad jeden procent mikroorganizmów posiadających plazmidy metaboliczne dzięki którym szybko adaptują się.
Za degradację węglowodorów w warunkach tlenowych odpowiadają głównie: typ Proteobacteria (α-, β-, γ-Proteobacteria) i Bacteroidetes.
Wyizolowano także ze środowisk zimnych gatunki zdolne do rozkładu składników ropy:
Alcanivorax borkumensis, Vibrio cycloclasticus, Erythrobacter.

Drobnoustroje degradujące węglowodory ropy naftowej – bakterie (na kartce)

Drobnoustroje degradujące węglowodory ropy naftowej – grzyby (na kartce)

Udział bakterii w usuwaniu zanieczyszczeń powietrza
Zanieczyszczenia powietrza mogą być w postaci:
- gazów
- płynów
Oba te rodzaje zanieczyszczeń powstają w wyniku procesów naturalnych, zachodzących w przyrodzie jak i wyniku działalności człowieka.

Rodzaje odorów
Odory emitowane są przez wiele zakładów przemysłowych chemicznych, rafinerie, stalownie, kopalnie.
Odory naturalne emitowane są w procesach obróbki/przetwarzania surowców naturalnych: wędzarnie, palarnie ziaren kawy, produkcja przypraw, żywności czy perfum.
Także w biozakładach (spalarnie, oczyszczalnie ścieków, kompostowanie) produkowane są gazy zanieczyszczające powietrze.

Przykłady najbardziej uciążliwych odorów (powinna dać ale nie ma)

Technologie eliminacji odorów
Metody fizyczne - eliminacja substancji odorowych przez ich rozcieńczenie/dyspersje, spalanie, adsorpcje i modyfikacje/maskowani.e
Metody chemiczne - chemiczna płuczka, UV/ozon, chemiczne utlenianie.
Metody biologiczne - przejście z fazy gazowej do wodnej przez złoże filtracyjne w tzw. bioreaktorach.
Wyróżnia się 4 typy bioreaktorów:
- biofiltry
- biofiltry zraszane
- biopłuczki
- bioreaktory membranowe

Biofiltry
Reaktor wypełniony stałą materią organiczną: torf , kompost, trociny, kora, bawełna, wrzos, gleba, media plastikowe, ceramika, węgiel aktywny i inne, która służy do rozwoju błony biologicznej, która stanowi różnorodną mikroflorę.
Doprowadzane jest wilgotne powietrze i woda.
W czasie oczyszczania powietrza z odorów powstaje osad, który poddawany jest dalszemu procesowi utylizacji.
Służą do oczyszczania ze związków alifatycznych, aromatycznych, siarkowych, olejów aromatycznych.

Biofiltry zraszane
Działają podobnie jak biofiltry z tym, że zaodorwanie od… podstawy biofiltra, a podłoże hodowlane zrasza biofiltr od góry.

Biopłuczki
Składają się z dwóch komór, w pierwszej zachodzi przemiana zanieczyszczeń gazowych do fazy ciekłej a w drugiej następuje biodegradacja substancji odorowych.
Istnieją 2 typy biopłuczek:
- biopłuczka konwencjonalna, która w drugiej komorze zawiera mikroorganizmy w zawiesinie
- biopłuczka z komorą osadu czynnego, która zamiast komory z mikroorganizmami w zawiesinie ma komorę z osadem czynnym

Bioreaktory membranowe
Stosuje się tu porowate membrany hydrofobowe, które wiążą odory słabo rozpuszczające się w wodzie.

Mikroflora degradująca odory w warunkach tlenowych
Dane na temat mikroflory są dość skąpe.

Skład mikroflory zależy od składu ilościowego i chemicznego gazów odorowych np. w usuwaniu siarkowodoru i amoniaku biorą udział chemolitoautotrofy - bakterie siarkowe i nitryfikacyjne.
W przypadku odorów organicznych obserwuje się olbrzymią bioróżnorodność mikroorganizmów: bakterie, w tym promieniowce, grzyby oraz inne organizmy…

Mikroflora degradująca odory w warunkach tlenowych (na kartce)

Mikroflora biofiltrów i bipłuczek (na kartce)

Mikroflora biofiltrów (na kartce)

Mikrobiologiczne odsiarczanie węgla
Jest to proces istotny z uwagi na powstające kwaśne deszcze na skutek emisji CO₂ podczas spalania węgla
- stężenie siarki w węglu wynosi 0,05-7%.
Odsiarczenie gazów odlotowych jest bardzo kosztowne.
Mikrobiologiczne odsiarczanie węgla z wykorzystaniem Thiobacillus sp. umożliwia równoczesne usunięcie licznych metali (nikiel, kobalt, beryl, wanad).

Przykłady mikroorganizmów stosowanych w bioaugmentacji gleb skażonych związkami aromatycznymi (na kartce)

Wykład 5; 4.11.2013 r.

Metody i techniki badania stosowane w ochronie środowiska.

Biomonitoring

Metoda gdzie wykorzystywane są wszystkie mikroorganizmy. Wyróżniamy w nim 3 wskaźniki:

- bioindykatory – organizmy używane jako wskaźnik stanu środowiska; organizm, który zmieni swe zabarwienie pod wpływem zanieczyszczeń w środowisku, szeroko rozpowszechnione, nie przemieszczają się (stałe), łatwe do obserwacji, są to np. dżdżownice, pszczoły miodne, mchy, małże, kraby.

- biomarkery - różne składniki materii ożywionej, są to elementy większych układów analizujących stan środowiska.

- biosensory - wyizolowane biomarkery wbudowane w układy pomiarowe.

Przykłady bioindykatorów
- mchy

- małże

- krab semaforowy

- porosty

- pszczoła miodna

- dżdżownica.

Biomarkery
Ilościowe wskaźniki zmian zachodzących w systemach biologicznych w odpowiedzi na pojawienie się w środowisku ksenobiotyków.

Biomarkery mogą mieć charakter biochemiczny, immunochemiczny, lub genetyczny.

Biomarkery biochemiczne

Rolę biomarkerów pełnić mogą białka i metabolity wewnątrzkomórkowe. Ilości, a co za tym idzie aktywność enzymów metabolizujących ksenobiotyki wzrasta w organizmach na działanie danego ksenobiotyku. Wzrost aktywności enzymu jest w tym przypadku miarą efektu biologicznego.

Biomarkery immunochemiczne

Rolę takich biomarkerów pełnią przeciwciała specyficznie wiążące antygeny pochodzące od ksenobiotyków. Specyficzność ta wykorzystywana jest w testach ELISA.

Biomarkery genetyczne
Zasadą metody jest wykorzystanie genów kodujących białka emitujące światło lub wywołujące efekt barwny, wbudowanych w taki sposób, aby odpowiedź (świecenie, zmiana barwy) powstała w odpowiedzi na obecność polutanta.
Odpowiedź barwna - przykłady
- gen gusA kodujący białko rozszczepiające X-gal, połączony z obszarem promotorowym uaktywnianym przez polutant.
Szczep E. coli zawierający plazmid z genem lac Z, połączony z genem kodującym arsR- białko regulatorowe operonu ars (odpowiedzialnego za usuwanie antymonu i arsenianów). Aktywność β-galaktozydazy wytwarzanej w takich komórkach w obecności arsenianów lub antymonu, może być oznaczona z użyciem chromogennego subststratu.

Najczęściej stosuje się:
- metodę kłaczków osadu czynnego

- bioaugmentację
- bioreaktory
- biosensory

Metoda kłaczków osadu czynnego
Metoda powszechnie stosowana do biologicznego oczyszczania ścieków.

To zespoły mikroorganizmów w napowietrzanych reaktorach przez które ścieki przepływają.

Kłaczki osadu czynnego zbudowane są z różnorodnych mikroorganizmów, głównie z bakterii, pozakomórkowych substancji polimerycznych i cząstek organicznych i nieorganicznych.

Frakcja mikroorganizmów stanowi od 5 do 20% całości kłaczków. Decydują też one o jego strukturze i wytrzymałości na zniszczenie fizyczne.

Skład osadu czynnego
Osad czynny jest kłaczkowatą zawiesiną złożoną głównie z:

- bakterii (z rodzaju Pseudomonas, Acinetobacter, Zoogela, Enterobacteriae, Aeromonas, Flavobacterium, Achromobacter, Micrococcus)

- pierwotniaków – orzęsków (z rodzaju Paramecium, Vorticella, Aspidiscus, Suctoria)

- wiciowców (z rodzaju Tetramitus, Trigomonas, Bodo)
- wrotków

- niektórych grzybów

- martwych komórek

- nierozłożonych dużych cząstek organicznych
- cząstek oraganicznych

Powstawanie kłaczków osadu

Wytwarzanie śluzowatych otoczek przez bakterie co sprzyja łączeniu się komórek za pomocą tego śluzu w kłaczkowate skupiska.

Kationy powodują łączenie się ujemnie naładowanych komórek.

Siatki cienkich nitek, wytwarzanych przez niektóre bakterie ułatwiają łączenie się komórek.

Bioreaktory

Co to są bioreaktory?
Urządzenie hodowlane w których proces rozkładu związków jest kontrolowany.
Najczęściej wykorzystuje się je w oczyszczalniach ścieków.

UASB - bioreaktory beztlenowe z warstwą osadu i przepływem wznoszącym. Najbardziej efektywne. W granulach osadu czynnego znajdują się Clostridium sp., Bacteroides sp., Desulfovibrio sp.
W warstwie pośredniej znajdują się bakterie homooctowe - Clostridium aceticum, Acetobacterium woodii.

W warstwie wewnętrznej występują metanogeny – Methanosaeta sp.

Bioaugmentacja

Co to jest bioagumentacja?
Wprowadzenie do skażonego środowiska (głównie gleby) mikroorganizmów zdolnych do rozkładu związków toksycznych.

Skuteczność zależy od rodzaju i stężenia substancji toksycznej, składu inokulatu interakcji z florą autochtoniczną.

Mikroorganizmy w bioaugmentacji
Cechy predysponujące do udziału w tym procesie to:

- odpowiednia szybkość działania
- szeroki zakres aktywności degradacyjnej
- niezbyt długi czas życia
- mobilność - zdolność do penetracji w głąb systemu
- odporność na zmiany środowiska

- niewielki koszt izolacji

Mikroorganizmy w bioagumentacji - pozyskiwanie
- selekcja z gleby, wody, osadów

- izolacja wszystkich kultur
- identyfikacja i namnożenie
- testowanie pod względem przydatności w biodegradacji

Mikroorganizmy można izolować i wprowadzać je do tego samego środowiska lub też do innego. Mogą to być zaadaptowane czyste szczepy lub konsorcja mikroorganizmów.

Mikroorganizmy w bioaugmentacji
Mikroorganizmy wprowadza się do skażonego środowiska bezpośrednio lub związane na nośnikach. Najczęściej stosuje się kapsułkowanie w alginianie, karagenie, poliuretanie, chitozanie, agarozie lub żelowych gumach.

Immobilizacja przedłuża okres życia komórek, zwiększa ich stabilność oraz ogranicza wpływ czynników zewnętrznych.

Możliwe jest stosowanie mikroorganizmów modyfikowanych genetycznie - GMM, uzyskanych poprzez wprowadzenie specyficznych genów do chromosomu lub wprowadzenie plazmidów degeneracyjnych, kodujących enzymy rozkładające ksenobiotyki.

Modyfikuje się szczepy autochtoniczne, wyizolowane z danego środowiska.

Jednak metoda ta nie wyszła jeszcze z laboratorium, gdyż nie znane są skutki uboczne (m.in. transfer horyzontalny genów).

Przykłady mikroorganizmów stosowanych w bioaugmentacji gleb skażonych związkami aromatycznymi (na kartce)

Czynniki ograniczające bioagumentację

Budowa chemiczna, stężenie, toksyczność, biodostępność i biodegradowalność ksenobiotyku.

Parametry fizykochemiczne gleby, struktura, wilgotność, zawartość materii organicznej, pH, temperatura, potencjał oksydoredukcyjny, stężenie tlenu.
Skład i struktura zespołów mikroorganizmów zasiedlających glebę, wzajemne oddziaływania, obecność innych organizmów glebowych.

Praktyczne zastosowanie bioagumentacji

Bioagumentacja gleby skażonej fenolem z wykorzystaniem Ralstonia eutropha KT_-1 w 2000 roku w Japonii: szczep pozyskano z gleby, a po namnożeniu wprowadzono z powrotem bez dodatkowych czynników.

Reintrodukcja szczepów Gordona sp. BP₉ i Mycobacterium sp. VF₁ do gleby skażonej pirenem.

Konsorcjum z 3 szczepów bakteryjnych i grzybowych do degradacji antracenu, fenantrenu i pirenu.

Wprowadzenie do gleby grzyba Absidia cylindrospora do rozkładu fluorenu.

Bakterie zmodyfikowane genetyczne, np. E. coli HB₁₀₁ z genem dioksygenazy kwasu 2,4-dichlorofenoksyoctowego do rozkładu kwasu fenoksyoctowego przy Enterobacter agglomerans z genem umożliwiającym rozkład bifenylu.

Biosensory

Co to jest biosensor mikrobiologiczny?
Sonda zawierająca biologiczną część jako bioczujnik oraz przetwarzacz który zmiany biologiczne przetwarza w sygnał.

Analityczny kompakt zawierający biologiczny składnik (enzym, przeciwciało, DNA, mikroorganizm) zintegrowany z fizykochemicznym przetwarzaczem.

Funkcja zależy od aktywnego metalu.

Wybór bioczujnika zależy od dokonywanych oznaczeń.

Biosensory

Wyizolowane biomarkery wbudowane w układy pomiarowe.
Układ pomiarowy składa się z biosensora, transduktora przetwarzającego sygnał biologiczny na sygnał elektryczny i integratora/rejestratora.

Mikroorganizmy jako elementy biosensorów

Zalety:
- zdolność do metabolizowania wielu związków chemicznych, adaptacji w czasie do zmieniających się warunków środowiska, wzrost kosztem degradacji nowych cząsteczek
- dzięki zmianom mutacyjnym i rekombinacyjnym mogą mieć szerszy panel enzymów wewnątrzkomórkowych, które mogą być stosowane do konstrukcji biosensorów (jednak jest to zbyt kosztowne)

- całe komórki są bardziej oporne na działanie czynników środowiskowych, w tym na metale ciężkie
- żywe komórki zdolne są do metabolizowania różnych związków w warunkach tlenowych i beztlenowych z produkcją różnorodnych metabolitów.

Wady:
Słaba dyfuzja substratu i produktu przez błonę biologiczną.

Możliwość zwiększenia przepuszczalności: zastosowanie rozpuszczalników lipidów jak chloroform, toluen etanol.

Skutkiem tych zabiegów są martwe komórki jako źródło enzymów wewnątrzkomórkowych.

Takie martwe komórki stosuje się do monitorowania reakcji katalizowanych przez oksydazę glukozy, oksydację aminokwasów czy inwertazy.

Bakterie gdzie enzymy występują w peryplazmie (inwertaza, katalaza, fosfataza) nie muszą być poddawane zabiegom zwiększania przepuszczalności.

Zrekombinowana Escherichia coli, zdolna do ekspresji hydrolazy organofosforanowej, została wykorzystana w sondzie do wykrywania związków organofosforowych.

Ważna jest selekcja szczepów tych mikroorganizmów, które wykorzystują odpowiednie związki jako źródło węgla i energii.
Do degradacji niektórych grup związków (np. węglowodorów, fenoli, środków powierzchniowo czynnych), powinno używać się osadu czynnego - konsorcjum mikrobiologicznego, jako bardziej zróżnicowanego pod względem enzymatycznym.

Np. do wykrycia sacharozy lub laktozy wykorzystuje się mieszaninę szczepów:

- Kluyveromyces marxianus – beta-galaktozydaza

- Saccharomyces cerevisiae – inwertaza

- Gluconobacter oxydans – oksydaza glukozy.

Mikroorganizmy immobilizowane w biosensorach
Immobilizacja mikroorganizmów stabilizuje biosensor.

Zachodzi na drodze: adsorpcji, poprzez wiązania kowalencyjne, wiązania krzyżowe (np. wtapianie w żelatynę, albuminę) lub w kombinacji tych technik.

Skuteczną techniką jest łapanie komórek w pułapkę – żele polimeryczne, są wtedy oddzielone od detektora membraną dializacyjną.

Biosensory oparte na bioluminescencji
Wykorzystuje się bakterie naturalne wykazujące zdolność do świecenia, posiadają enzym lucyferazę. Bakterie morskie: Photobacterium phpsphoreum, Vibrio fisheri, Vibrio harveyi, Vibrio logei. Bakterie glebowe: Photorhabdus luminescens.

Geny odpowiedzialne za proces luminescencji mogą być przenoszone za pomocą plazmidu do bakterii powszechnie występujących w środowisku naturalnym m.in. Pseudomonas fluorescens czy P. putida.

Takie biosensory wykorzystywane są do detekcji zanieczyszczeń chemicznych m.in. pestycydów czy metali ciężkich.

Przykładem jest Pseudomonas fluorescens HK44, który jest zmieniony genetycznie i świeci w obecności naftalenu, salicylanu.
Zalety: szybka reakcja, wysoka czułość, szeroki zakres substancji, nieinwazyjność.

Przykłady biosensorów opartych na bioluminescencji

Zastosowanie	Mikroorganizm
Monitorowanie tempa wzrostu	E. coli
Monitorowanie toksyczności wybranych metali ciężkich	E. coli HB101, Pseudomonas fluorescens 10586
Wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne	Pseudomonas fluorescens HK44
Toksyczność metali w glebach	Pseudomonas fluorescens
Monitorowanie chlorofenoli w glebie	E. coli HB101, Pseudomonas fluorescens 10586r
Identyfikacja BTEX (benzene, toluene, etylobenzen, ksylen) w miejscach skażenia	Pseudomonas fluorescens

Białka luminescencyjne
Lucyferaza bakteryjna – gen luxAB

Lucyferaza eukariotyczna – gen luc
Zielone białko fluoryzujące (GFP) z meduzy Agorea Victoria – gen gfp

Przykład zastosowania:

Szczep E. coli, w którym gen Luxa z Vibrio harveyi znajduje się pod kontrolą promotora alkB z Pseudomonas aleovorans. Komórki odpowiadają świeceniem na obecność alkanów.

Biosensory w monitorowaniu zanieczyszczeń środowiska

Związki monitorowane	Mikroorganizm
BZT (biologiczne zapotrzebowanie na tlen)	Pseudomonas putida, Arxula adeninivorans IS3, konsorcjum osadu czynnego
Węgiel organiczny	Drożdże
Akrylamid, kwas akrylowy	Brevibacterium sp.
Związki fenolowe	Pseudomonas putida
Chlorofenole	Rhodococcus sp.
P-nitrofenol	Arthrobacter sp.
Naftalen	Sphingomonas yanoikuyae B1, Pseudomonas fluorescens WW4
Azotyny	Nitrobacter vulgaris
Cyjanki	Sachcaromyces cerevisiae
Lotne kwasy tłuszczowe	Stenotrophomonas sp.

Biosensory (powinna dać ale nie ma)

Biosensory, np.:
immobilizowane komórki bakteryjne, przeciwciała, peroksydaza z chrzanu, Agrobacterium radiobacter, reduktaza…

Rola drobnoustrojów w testach toksyczności i mutageniczności

Do testów toksyczności i mutagenności wykorzystuje się wyselekcjonowane szczepy bakteryjne (np. metoda replik czy metoda gradientowa).

Oprócz mikroorganizmów wykorzystywane są makroorganizmy, które pokazujemy ile jest rodzajów testów, ale nie stanowią one obiektu naszego zainteresowania.

Testy toksyczności
Rodzaje testów:
- testy przeżywalności (wyznaczanie wartości LC50)
- testy wzorcowe (bakterie, grzyby, glony, wyznaczanie wartości EC59)
- testy enzymatyczne - hamowanie aktywności enzymu lub grupy enzymów u wybranych bioindykatorów

- testy genotoksyczności (mutagenność)

- testy bioakumulacji

Przykłady organizmów wykorzystywanych w testach toksyczności
Bakterie: Pseudomonas sp., Escherichia sp., Salmonella sp., Bacillus sp., Vibrio sp.

Grzyby: Candida sp. Saccharomyces sp., Penicillium sp., Aspergillus sp.
Glony: Chlorella, Scenedesmus, Selenastrum

Testy toksyczności-testy z wykorzystaniem roślin i glonów (powinna dać ale nie ma)
Poziomy troficzne:

…

2. Konsumenci 1 rzędu- rozwielitki
3. Konsumenci 2 rzędu mięsożercy- brak
4. Konsumenci 3 rzędu…

Testy toksyczności z wykorzystaniem bakterii luminescencyjnych
Miarą toksyczności jest redukcja emisji światła przez bakterie świecące. Porównuje się poziom emisji światła próbek hodowli poddanych działaniu związku badanego z poziomem emisji hodowli kontrolnej.

Bakterie świecące
Wzrost vibrio fischerri na podłożu …………

Testy toksyczności
BIOTOX- test wykorzystują bakterie świecące Vibrio fischeri, reakcją testową jest obniżenie luminescencji (świecenia) bakterii. Czas inkubacji jest wyjątkowo krótki – tylko 15 min. Test wykorzystuje się wg standardowej procedury producenta przy użyciu analizatora i liofilizowanych bakterii.

Microtox łączy w sobie zalety badania toksyczności oparte na ocenie funkcjonowania całych organizmów z szybkością i precyzją instrumentów analitycznych.

Działa w oparciu o bakterie luminescencyjne (Vibrio fischeri) w celu pomiaru toksyczności wody lub innych próbek (w tym ścieków, fazy stałej (osady, gleby itp.)) substancji i związków chemicznych.

Spirotox… (powinna dać ale nie ma)

Testy genotoksyczności
Typy mutacji:
• substytucyjna zmiana zasady na inną:

- tranzycja A G lub C T

- trans wersja A lub G T lub C
• delecja - usunięcie 1 lub większej liczby zasad
• insercja - wstawienie 1 lub większej liczby zasad

• mutageneza - poniżej

Mechanizmy molekularne:

- modyfikacja chemiczna

- wprowadzenie analogu zasady

- interkalacja

- modyfikacja fizyczna (UV)

Czynniki mutagenne
Aflatoksyna B1…

Barwniki akrydynowe prowadzą do powstania mutacji, przesunięcie ramki odczytu w wyniku interkalacji pomiędzy pary zasad DNA.

Efektem działania kwasu azotowego (III) jest możliwość mutacji w wyniku tranzycji A-T C-G.

Testy genotoksyczności (mutagenność)
Test Amesa stosuje sie mutanty Salmonella typhimurium niezdolne do biosyntezy aminokwasu l- histydyny. Bakterie wysiewa się na podłożu agarowy minimalnym, nie zawierającym histydyny. Związek aplikowany jest na powierzchni płytki na krążku bibułowym, często wraz z ekstraktem z wątroby szczura. Jeżeli pod wpływem badanego związku nastąpi rewersja do prototrofii (co objawi się w postaci kolonii bakteryjnych), uznaje się związek za genotoksyczny.

• SOS-Chromotest

Zasada polega na indukcji przez badane związku układu SOS do naprawy uszkodzonego DNA. Organizmami testowymi są komórki E. coli. Gen regulujący ekspresję genów układu SOS (muc) jest połączony z genem indykatorowym np. regulującym ekspresję genu kodującego beta-galaktozydazę. Wzrost aktywności beta-galaktozydazy stanowi miarę genotoksyczności.

• UMU- test

Procedura podobna do metodyki SOS-Chromotest. Stosuje się mutanty Salmonella typhimurium z plazmidem zawierającym gen muc.

• Test mutatox

Stosuje się mutant Vibrio fischeri niezdolne do bioluminescencji. Pod wpływem związków genotoksycznych następuje aktywacja świecenia.

• Test z wykorzystaniem drożdży

Wykorzystuje się drożdże Saccharomyces cerevisiae i Saccharomyces pombe, które w formie niezmutowanej potrzebują aminokwasów. Bada się z ich wykorzystaniem mutacje oraz mitotyczny crossing-over.

Porównanie odpowiedzi różnych biomarkerów i bioindykatorów na pentochlorofenol (powinna dać ale nie ma)