CHROMATOGRAFIA - POPRAWA

Cel ćwiczenia:

Celem ćwiczenia była identyfikacja i rozdział składników mieszaniny próbki dwoma metodami chromatograficznymi – cienkowarstwową (TLC) i kolumnową (CC). Wyznaczono również współczynniki R_f dla poszczególnych barwników organicznych.

Wykonanie ćwiczenia:

1. Przeprowadzono analizę jakościową otrzymanej mieszaniny barwników metodą chromatografii cienkowarstwowej (TLC):

   1. Przygotowano płytkę chromatograficzną: zaznaczono linię „startu” i „mety”, kapilarami naniesiono wzorce (Sudan I, oranż 2-naftolowy, czerwień metylowa, fluoresceina) oraz badany roztwór – ok. 5-6 razy. Adsorbentem był żel krzemionkowy, którym płytki do TL były już pokryte.

   2. Rozwinięto chromatogram (komorę chromatograficzną napełniono do 5 mm eluentem – toluenem i acetonem w stosunku objętościowym 3:1, ścianki komory wyłożono bibułą, umieszczono chromatogram i odczekano, aż czoło eluenta znajdzie się na linii „mety”, płytkę wysuszono suszarką, ustalono skład mieszaniny).

2. Rozdzielono analizowaną mieszaninę za pomocą techniki chromatografii kolumnowej (CC):

   1. Napełniono kolumnę (umieszczono watę, dodano kilka mililitrów toluenu, przygotowaną uprzednio papkę żelu krzemionkowego wlano do kolumny – zastosowano większą ilość adsorbenta (ok 8 g), niż była podana w przepisie, by uzyskać dłuższą „drogę” dla barwników; spuszczono nadmiar rozpuszczalnika i na powierzchnię nasypano warstewkę piasku).

   2. Za pomocą pipetki Pasteura wprowadzono roztwór mieszaniny barwników do środka; po zaadsorbowaniu barwników w żelu krzemionkowym wlewano odpowiednie rozpuszczalniki.

   3. Zastosowano kolejno: toluen, który wymył Sudan I, następnie mieszaninę toluenu i acetonu w stosunku objętościowym 3:1 (wymycie czerwieni metylowej) i jako ostatni etanol, który umożliwił oddzielenie oranżu 2-naftolowego.

   4. Poszczególne frakcje zebrano do osobnych fiolek.

3. Sprawdzono skuteczności rozdziału:

   1. Ponownie zastosowano metodę chromatografii cienkowarstwowej; ćwiczenie wykonano analogicznie jak w punkcie 1, z tą różnicą, że na płytkę naniesiono rozdzielone składniki, robiąc kapilarami plamki 20-krotnie – otrzymane próbki są bardzo rozcieńczone w stosunku do wyjściowego preparatu.

   2. Chromatogram rozwinięto, używając uprzednio przygotowanej komory chromatograficznej.

Opracowanie wyników:

Stosując metodę chromatografii cienkowarstwowej oszacowano wstępnie skład badanej mieszaniny. W próbce znajdowały się barwniki (kolejno): oranż 2-naftolowy, Sudan I (1-fenyloazo-2-naftol) oraz czerwień metylowa.

Dla poszczególnych plamek wyznaczono współczynniki R_f:

Rys. 2. Pomiar współczynnika opóźnienia R_f

(Chromatogramy znajdują się na poprzednim sprawozdaniu – załącznik 1).

Wnioski:

Metodą chromatografii cienkowarstwowej zbadano skład mieszaniny i oszacowano, że w próbce znajdowały się barwniki: oranż 2-naftolowy, Sudan I, czerwień metylowa. Na chromatogramie pierwszym widać również jasnoróżową plamkę (poniżej plamki czerwieni), która najprawdopodobniej jest zanieczyszczeniem, które było w pierwotnym preparacie. Druga jasnoróżowa plamka znajduje się powyżej fluoresceiny – ją możemy potraktować jako błąd popełniony przy wykonywaniu czynności – przy nanoszeniu wzorców na płytki pracowało wielu studentów i ktoś mógł pomieszać kapilary używane do tego celu; fluoresceina mogła zostać więc zanieczyszczona czerwienią metylową.

Dzięki chromatografii kolumnowej dokładnie rozdzielono poszczególne barwniki syntetyczne. Znajomość składu próbki pierwotnej pozwoliła na dobranie odpowiednich do tego celu rozpuszczalników. I tak zastosowano kolejno: toluen (wymywa najmniej polarne barwniki tj. Sudan I), mieszaninę toluenu i acetonu w stosunku objętościowym 3:1 (oddzielono czerwień metylową); następnie zastosowano sam aceton, jednakże jego polarność była zbyt słaba, by mogła eluować ostatni składnik, dlatego dodano etanolu, który wymył oranż 2-naftolowy. Zastosowana metoda okazała się bardzo dobra, jeżeli chodzi o rozdział. Poszczególne barwniki uległy bardzo wyraźnemu rozwarstwieniu i nie było problemu z zebraniem poszczególnych frakcji. Dowodem tej tezy jest drugi chromatogram, na którym naniesiono same rozdzielone barwniki – na płytce nie zaobserwowano żadnych innych plamek, które mogłyby wskazywać na zanieczyszczenie frakcji innymi składnikami.

Obliczone współczynniki opóźnienia nie odbiegają daleko od wartości wzorcowych, obliczonych na podstawie chromatogramu pierwszego (tabela 1). Różnice mogą wynikać jedynie z niedokładności oka ludzkiego i przyrządów pomiarowych – pomiar odległości za pomocą linijki obarczony jest pewną niepewnością (najmniejszą wartość jaką można odczytać jest 0,5 mm).

Załączniki:

[1] Sprawozdanie oddane do poprawy