Skrypt ćw. (krok po kroku)!

Opis metody można znaleźć na stronie: http://www.e-biotechnologia.pl/Artykuly/chromatografia-cieczowa-saczenie-molekularne

Oczyszczanie lakazy:

1. Wykonać roztwór do kalibracji: szczyptę Blue Dextranu (niebieski) i szczyptę dwuchromianu potasu (czerwony) zalać ok. 2-5 ml wody – dokładne obliczanie masy i objętości nie jest konieczne. Roztwór ten musi mieć barwę mocno zieloną.

2. Przepłukać kolumnę chromatograficzną 20 ml wody destylowanej wprowadzając ją do kolumny powoli, za pomocą pipety pasteur’owskiej, starając się, by prądy wody nie podnosiły złoża oraz pilnując by żel (Sephadex G-25) nie miał kontaktu z powietrzem. Można wykonywać w tym samym czasie, co pkt. 1.

3. Po przepłukaniu pozostawić w kolumnie minimalną ilość wody przykrywającą żel (menisk wklęsły = dolny ma wręcz dotykać żelu).

4. Do kolumny dodać 2 ml (lub inną określoną objętość) uprzednio przygotowanego roztworu do kalibracji.

5. Rozpocząć zbieranie do cylindra miarowego tzw. objętości martwej – bezbarwnej wody spływającej z żelu, aż do pojawienia się barwnego Blue Dextranu.

6. „Wpuścić” roztwór do kalibracji w żel, pozostawiając jedynie menisk wklęsły na powierzchni żelu. Zatrzymać rozdział – obserwujemy szybsze przechodzenie w żelu cząsteczek Blue Dextranu (który symuluje lakazę), a wolniejsze czerwonego/żółtego dwuchromianu potasu (symulującego zanieczyszczenia).

7. Powoli dolewać do kolumny wody destylowanej, by nie zburzyć żelu i nie rozcieńczać badanego roztworu do kalibracji.

8. Spuszczać wodę destylowaną do cylindra miarowego, pamiętając o uzupełnianiu jej. Żel w kolumnie nie może mieć kontaktu z powietrzem.

9. Obserwować barwę roztworu łapanego do cylindra. W momencie przypuszczalnej zmiany barwy roztworu na niebieską należy zebrać kilka kropli roztworu do eppendorfu, by sprawdzić jego kolor. Jeśli roztwór rzeczywiście jest niebieski, zamknąć przepływ w kolumnie, zanotować w zeszycie objętość martwą zebraną w cylindrze, a następnie opróżnić cylinder i zbierać do niego frakcję Dextranu Blue (niebieską)

   1. Zwykle objętość martwa mieści się w przedziale 7-8 ml, jednak zależy ona od stężenia przygotowanego roztworu do kalibracji oraz „zużycia” żelu Sephadex G-25. Należy więc zachować czujność.

10. W podobny sposób jak opisano powyżej zebrać frakcję niebieską frakcję Blue Dextranu – symuluje ona objętość, w której pojawi się bezbarwna lakaza - enzym, którego aktywność mamy w planach oznaczyć. Pamiętać o uzupełnianiu wody destylowanej w kolumnie. Nie dopuścić do kontaktu żelu z powietrzem.

11. Po przypuszczalnej zmianie barwy roztworu z niebieskiej na zieloną należy zebrać kilka kropli roztworu do eppendorfu, by sprawdzić jego kolor. Jeśli nastąpiła zmiana zabarwienia zamykamy przepływ w kolumnie i notujemy objętość Dextranu Blue po chromatografii. Jeśli nie nastąpiła zmiana (pośpieszyliśmy się) należy kolejne krople zbierać do cylindra, a do jego końcowego wyniku dodać objętość zgromadzoną w eppendorfach.

    1. Zwykle objętość Dextranu Blue mieści się w przedziale 3-5 ml, jednak zależy ona od stężenia przygotowanego roztworu do kalibracji oraz „zużycia” żelu Sephadex G-25. Czujność wysoce wskazana.

12. Ważne jest, by nie zbierać w tej próbce dwuchromianu potasu (nawet kosztem zmniejszenia ilości zebranego Dextranu Blue), gdyż symuluje on zanieczyszczenia, których chcemy się pozbyć metodą chromatografii.

13. Po zakończeniu zbierania dwuchromianu potasu zapisujemy jego objętość – będzie to objętość, po której w kolumnie chromatograficznej znajduje się sama woda destylowana, o ile pamiętaliście o jej regularnym uzupełnianiu.

14. Przygotować roztwór lakazy w wodzie destylowanej do końcowego stężenia 1 g/ml.

15. Spuścić wodę destylowaną do menisku dolnego, a następnie dodać 1 ml (lub inną określoną ilość) przygotowanego roztworu lakazy.

16. Przepuścić roztwór przez chromatograf, łapiąc określone frakcje:

    1. Jeśli objętości martwej w przypadku roztworu do kalibracji było np. 7 ml to oznacza, że dokładnie po takiej objętości pierwsze cząsteczki lakazy dotrą do wylotu chromatografu. Należy więc po 7 ml zamknąć przepływ, zanotować objętość martwą tego przypadku i zlać łapaną do cylindra wodę.

    2. Lakaza jest bezbarwna, więc nie sposób dokładnie określić momentu rozpoczęcia jej frakcjonowania. Z tego powodu „łapiemy” do cylindra ilość określoną w procesie kalibracji. Jeśli frakcja Dextranu Blue miała objętość np. 4 ml to oznacza, że dokładnie taką samą objętość mamy pobrać bezbarwnego produktu z chromatografu – i, zaprawdę powiadam wam, będzie to oczyszczony (odsolony) roztwór lakazy.

    3. Po pobraniu frakcji lakazy łapiemy objętość, którą wcześniej oznaczaliśmy obecnością barwnego dwuchromianu potasu.

17. Należy pamiętać o uzupełnianiu wody destylowanej w kolumnie, by nie dopuścić do kontaktu żelu z powietrzem.

18. Po otrzymaniu roztworu lakazy należy przepłukać kolumnę chromatograficzną objętością ok. 20 ml wody destylowanej.

19. Przygotowujemy próbki, które będziemy badać spektrofotometrycznie (można wykonywać w tym samym czasie, co pkt. 18)

20. Ustalamy rozcieńczenie enzymu – lakazy (w naszym przypadku było ono 10-krotne). Oznacza to, że do probówek dodawaliśmy składniki w następującej ilości i kolejności:

    1. 500 ul buforu McIlvaine’a (o określonym pH)

    2. 440 ul wody destylowanej (350 ul do uzupełnienia próbki oraz 90 ul do rozcieńczenia enzymu)

    3. 10 ul lakazy

    4. 50 ul 0,5 M roztworu syryngaldazyny (DODAWAĆ TUŻ PRZED POMIAREM – stojąc obok spektrofotometru)

    5. Końcowa objętość próbki wynosi 1 ml.

21. Aby przeprowadzić pomiar należy ustawić na spektrofotometrze następujące parametry:

    1. Czas trwania reakcji: 60-120 s (w zależności od ustaleń)

    2. Czas trwania interwałów: 10-20 s (w zależności od ustaleń)

    3. Długość fali: 525 nm

    4. Factor: 2564 [nkat/l]

22. Najwyższą aktywność lakaza wykazuje w pH 5,5-6,0, więc właśnie jedną z tych wartości należy wybrać jako pierwszą - wzorcową. Wykres zależności aktywności lakazy od pH powinien być zgodny rozkładem normalnym (Gaussa-Laplace’a, krzywą dzwonową).

23. Po wykonaniu próbki (BEZ syryngaldazyny) przenosimy ją na stanowisko ze spektrofotometrem (już ustawionym).

24. Należy zbadać aktywność lakazy w następujących pH: 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0, a następnie wyciągnąć wnioski na podstawie wyników. Każdą próbę powtarzamy dwa razy.

    1. W przypadku, gdy aparat pokaże wynik ujemny uznajemy, że brak jest aktywności enzymu w danym pH - wpisujemy 0 do tabeli.

    2. W wypadku rozbieżności w wynikach o wartości przekraczającej 1/3 pierwotnego wyniku wykonujemy trzecią, decydującą próbkę. W przypadku, gdy aktywność w niej zaobserwowana będzie w odchyleniu 1/3 od średniej dwóch poprzednich wyników i każdego z tych wyników z osobna, wykonujemy czwartą próbkę. Jeśli trzecia próbka będzie porównywalna do jednej z dwóch poprzedzających ją, wybieramy te dwie próbki do obróbki statystycznej – wyciągnięcia średniej – wspominając także o pominięciu wyniku ostatniej próby.

       1. Próbka I – 200, Próbka II – 600. Należy wykonać trzecią próbkę, ponieważ 1/3 z 600 = 200, a 600 – 200 = 400, czyli rozbieżność między próbkami jest większa niż 1/3 wartości wyższego wyniku.

       2. Próbka III – 500. Próbka III mieści się w odchyleniu 1/3 zarówno w stosunku do średniej dwóch poprzedzających ją próbek (400), jak i do próbki II (600), co oznacza, że próbkami, które będziemy brać pod uwagę będą próbka II oraz próbka III. Średnia aktywność dla danego pH będzie wynosić 550.

       3. Dlaczego tak się dzieje? Czasem przyczyną jest źle umyty tip, czasem nieprzepipetowanie roztworu w kuwecie, czasem błąd w dodawaniu poszczególnych składników, lub błąd maszyny. Nie należy się tym przejmować i tego specjalnie dociekać, a powtarzać doświadczenie do osiągnięcia oczekiwanych wniosków.

25. Otrzymane wyniki notujemy w celu wyciągnięcia wniosków końcowych i wykonania wykresu zależności aktywności lakazy od pH.

26. Przygotowujemy odpowiednio rozcieńczoną próbkę (w naszym przypadku 50-krotnie – 2 ul próbki, 98 ul wody do rozcieńczenia, czyli ogółem 448 ul wody destylowanej) roztworu nieoczyszczonego (tego, który nakraplaliśmy na kolumnę chromatograficzną) i mierzymy jej aktywność w pH o najwyższej aktywności (ph 5,5-6,0).

27. Przelewamy lakazę do oddzielnych eppendorfów, szczelnie zamykamy i podpisujemy (nie piktogramami, ale słownie, aby było jasne, która grupa wykonała dane doświadczenie) – będziemy na niej pracować w przyszłości.

28. Wykonujemy sprawozdanie:

    1. Porównujemy aktywność enzymu w różnych pH odnosząc te wartości do aktywności nieoczyszczonego enzymu (uwzględniając różnice rozcieńczenia i objętości).

    2. W MS Excel nanosimy otrzymane dane potrzebne do sporządzenia wykresu zależności aktywności enzymu od pH.

    3. Obliczamy wydajność oczyszczania.