Numer ćwiczenia F	Temat ćwiczenia Fluorescencja aminokwasów i białek	Data wykonania ćwiczenia: 27.02.2014
		Data oddania sprawozdania: 20.03.2014
Grupa B1	Tomasz Berniak Zbigniew Chałupka Piotr Chmielowski	Nazwisko sprawdzającego: dr Janusz Dąbrowski
Uwagi:	Ocena:

1. Cel ćwiczenia

Celem ćwiczenia było badanie zjawiska wygaszania fluorescencji związków biologicznie czynnych, rejestrowanie widm absorpcyjnych i emisyjnych wyżej wymienionych związków oraz badanie wpływu metali na właściwości związków tetrapirolowych.

1. Wstęp teoretyczny

Oddziaływanie fotonów z biologicznie czynnymi cząsteczkami powoduje wzbudzenie tej cząsteczki i przejście na wyższy poziom energetyczny. Wzbudzona cząsteczka może powrócić do stanu podstawowego na kilka różnych sposobów. Są nimi przejścia promieniste, związane z emisją kwantu promieniowania: fluorescencja (10⁶-10⁹ s^-1), fosforescencja
(10^-2-10⁴ s^-1), przejścia bez promieniste: konwersja wewnętrzna (10¹¹-10¹³ s^-1) oraz przejście interkombinacyjne. Porównując przedstawione czasy trwania, fosforescencja trwa zdecydowanie dłużej od fluorescencji oraz konwersji wewnętrznej , która związana jest z rozpraszaniem energii w postaci ciepła. Fluorescencja jest procesem emitowania energii, który przebiega bez zmiany multipletowości, natomiast proces fosforescencji zachodzi zgodnie z zmianą multipletowości.

Fluorescencja jest to proces fizyczny powrotu cząsteczki ze stanu wzbudzonego do stanu podstawowego na skutek emisji kwantu energii w postaci światła w zakresie ultrafioletu lub promieniowania Roentgen’owskiego. Zjawisko fluorescencji może być badane za pomocą spektrofluorymetru, którego schemat blokowy umieszczono poniżej (rys.1):

rys.1a Schemat blokowy spekrofluorymetru

Czynnikiem decydującym o występowaniu fluorescencji w związku organicznym jest posiadanie struktur aromatycznych. Przykładowymi związkami, w których istnieje możliwość zaobserwowania fluorescencji, są: aminokwasy (tryptofan, tyrozyna, fenyloalanina), barwniki roślinnie (β-karoten, chlorofil a- struktura przedstawiona poniżej), oraz witaminy
(ryboflawina). Każdy ze związków fotochemicznie aktywnych charakteryzowany jest za pomocą kilku istotnych parametrów: położenia maksimów absorbcji i emisji oraz wydajności kwantowej. Wydajność kwantowa to stosunek liczby kwantów wyemitowanych do zaabsorbowanych przez daną cząsteczkę. Przykładowo dla tryptofanu maksimum absorpcji przypada na 280 nm a emisji na 340 nm. Wydajność kwantowa tryptofanu wynosi 0,14. Zjawisko fluorescencji tryptofanu związane jest z obecnością grupy indolowej w cząsteczce związku.

rys. 1b. Struktura chlorofilu a.
http://pl.wikipedia.org/wiki/Plik:Chlorophyll_a_structure.svg

Fluorescencja może być wygaszana na kilka sposobów. Jednym z nich jest dodatek wygaszacza, który posiada dużą zdolność pochłaniania energii lecz nie może jej wyemitować. Wygaszanie może odbywać się na dwa sposoby: poprzez przeniesienie elektronu (mechanizm Dextera), bądź przekazanie energii (mechanizm Förstera). Typowym przedstawicielem wygaszaczy jest jodek potasu.

Zjawisko fluorescencji może mieć praktyczne zastosowanie w leczeniu nowotworów, a dokładnie w metodzie PDT. Metoda PDT polega na podaniu pacjentowi fotosensybilizatora, który lokuje się we wszystkich komórkach ciała. Poprzez precyzyjne naświetlanie komórek rakowych, fotosensybilizator generuje reaktywne formy tlenu, który bezpośrednio niszczy chore komórki. Zakres długości światła absorbowany przez fotosensybilizator powinien znajdować się w przedziale promieniowania podczerwonego.

W medycynie zastosowanie znalazł również bardzo popularny chemoterapeutyk
cis-platyna. Wprowadzenie związku do organizmu, z zwłaszcza metalu powoduje zajście sprzężenia w rezultacie czego następuje utworzenie reaktywnych postaci tlenu, które przyczyniają się do dezaktywowania komórek np. rakowych.

1. Wykonanie ćwiczenia

Część I- Pomiar widm wzbudzenia i fluorescencji albuminy i tryptofanu.

Odczynniki: albumina i tryptofan

1. Przygotowano roztwory tryptofanu o albuminy w PBS.

2. Wzbudzono wiązką promieniowania o długości 280 nm.

3. Dodawano porcjami dla odpowiedniej próbki roztwory: KI i CuSO_4.

Część II- Pomiar widm absorpcji, emisji i wzbudzenia związków biologicznie czynnych.

Odczynniki: Witamina B12, protoporfiryna IX, hemoglobina, MnTDCPP, TPP, etanol, PBS

Aparatura: Spektrofotometr- PerkinElmer,

1. Przygotowano roztwory: witaminy B12 w PBS; protoporfiryny IX w etanolu, hemoglobiny w PBS, MnTDCPP w etanolu i TPP w etanolu z dodatkiem kropli DMSO.

2. Zmierzono absorbancje przygotowanych roztworów.

3. Rozcieńczono roztwory do uzyskania maksimum absorbancji pasma Soreta wynoszącego około 0,15.

4. Za pomocą spektrofluorymetru zarejestrowano widma dla rozcieńczonych roztworów protoporfiryny IX, hemoglobiny.

Część III- Badanie wpływu metali na właściwości związków tetrapirolowych.

Odczynniki: chlorofil a, Zn chlorofil, Pt chlorofil

1. Zmierzono widma absorpcyjne przygotowanych roztworów chlorofilu

1. Opracowanie wyników

Część I- Pomiar widm wzbudzenia i fluorescencji albuminy i tryptofanu.

1. Pomiar widm emisji albuminy i tryptofanu

W pierwszej kolejności wykonano pomiar widma emisji dla albuminy i tryptofanu. Uzyskane widma przedstawiono poniżej w formie wykresu.

Rys.1 Elektronowe widmo emisyjne dla albuminy i tryptofanu.

Widmo emisyjne albuminy jest bardzo zbliżone do widma tryptofanu. Jednakże można zauważyć niewielkie przesuniecie maksimum dla albuminy w kierunku krótszych fal. Przesunięcie maksimum może być spowodowane strukturą związku, gdyż tryptofan to aminokwas posiadający grupę indolową, natomiast albumina to białko zbudowane wielu aminokwasów o skomplikowanie strukturze.

1. Pomiar wygaszania fluorescencji za pomocą roztworu KI

Do roztworu albuminy dodawano kolejno porcję nasyconego roztworu jodku potasu. Po dodaniu jednorazowej porcji roztworu KI wykonywano pomiar elektronowego widma emisyjnego. Zebrane widma wykonane w tej części doświadczenia, zebrano na jednym wykresie.

Rys2. Elektronowe widmo emisyjne albuminy, stopniowe wygaszenie widma roztworem KI.

Elektronowe widmo emisyjne pokazuję interesującą zależność: wraz ze ilości dodanego roztworu jodku potasu, spada intensywność fluorescencji albuminy. Jednakże dodatek kolejnej porcji jodku potasu powodował nieznaczne przesuniecie maksimum intensywności w kierunku fal krótszych. Każdorazowe zwiększenie stężenia jodku potasu w stosunku do albuminy powodowało około dwukrotne zmniejszenie intensywności. Poprzednie stwierdzenia potwierdzają fakt, iż KI można uznać za wygaszać fluorescencji. Spowodowane jest to przez fluoroforów.

1. Pomiar wygaszania fluorescencji za pomocą roztworu CuSO₄

Do roztworu tryptofanu dodawano kolejno porcje roztworu siarczanu(VI) miedzi(II) . Po dodaniu jednorazowej porcji roztworu CuSO₄ wykonywano pomiar elektronowego widma emisyjnego. Zebrane widma wykonane w tej części doświadczenia, zebrano na jednym wykresie.

Rys3. Elektronowe widmo emisyjne tryptofanu, stopniowe wygaszenie widma roztworem CuSO₄

Nałożone widma elektronowe emisji tryptofanu zarejestrowane dla kolejnych porcji dodawanego roztworu siarczanu(VI) miedzi(II) przedstawiają zależność, że wraz ze wzrostem stężenia CuSO₄ spada intensywność maksimum. Pierwsza porcja roztworu CuSO₄ obniżyła intensywność maksimum emisji o około 250 jednostek atomowych. Kolejne porcje wygaszacza nie powodowały już tak wielkiego spadku intensywności maksimum intensywności tryptofanu. Jednakże, można uznać, że każdorazowa porcja CuSO₄ powodowało 2-krotny spadek intensywności emisji. Wygaszanie fluorescencji przez siarczanu(VI) miedzi(II) powodowane jest poprzez łączenie się reagujących cząstek i tworzenie fluoroforów.

Część II- Pomiar widm absorpcji, emisji i wzbudzenia związków biologicznie czynnych.

1. W drugiej części ćwiczenia przeprowadzono pomiary absorbancji dla różnych związków posiadających pierścienie tetraporfirynowe.

W pierwszej kolejności przeprowadzono pomiary związków, aby pokazać wpływ metalu w centrum koordynacji na widmo absorpcyjne danego związku.

Rys.4 Nałożone widma absorpcyjne związków tetrapirolowych.

Badanie związków biologicznie czynnych za pomocą spektrofotometru pokazało że położenie pasma Soreta w zależności od badanej próbki jest różne. Dla witaminy B12 maksimum pasma Soreta znajdowało się przy 361nm, natomiast dla związków tetrapirolowych pasmo Soreta znajduje się przy dłuższych falach, np. protoporfiryna IX ma maksimum przy 403 nm. Występowanie maksimum dla witaminy B12 przy wyżej wymienionej wartości może być spowodowane występowaniem dodatkowych struktur aromatycznych- pochodnych benzoimidazolu.

Maksima pasma Soreta dla protoporfiryny IX oraz dla hemoglobiny położone są przy zbliżonych wartościach (kolejno 403nm i 407nm) może to nasuwać stwierdzenie, iż wbudowanie metalu, w tym przypadku żelaza na II stopniu utlenienia, w strukturę protoporfiryny IX powoduje nieznaczną zmianę położenia pasma Soreta.

Jednakże zwracając uwagę na występowanie, a zarazem intensywność pasm Q, możemy dostrzec różnicę pomiędzy tymi strukturami. W przypadku protoporfiryny IX występują cztery maksima dla pasma Q, natomiast dla hemoglobiny są one niewidoczne. Występowanie żelaza w strukturze hemoglobiny przyczynia się do wygaszania pasma Q. Związki charakteryzujące się występowanie pasma Q o dostatecznej intensywności mogą być wykorzystywane w terapii PDT, jako fotosensybilizator, ponieważ absorbują długie fale światła wykazujące się głęboką penetracją tkanek ludzkich. Obecność intensywnego pasma Soreta, przy minimalnej intensywności pasm Q może klasyfikować związek jako użyteczny w diagnostyce w PDT.

Wbudowanie manganu do „free base” – protoporfiryny IX powoduję przesunięcie pasma Soreta o ok. 70 nm w kierunku fal światła czerwonego; zmniejsza także ilość maksimów pasma Q do jednego.

1. Następnie przeprowadzono pomiar fluorescencji dla protoporfiryny IX, hemoglobiny i witaminy B12. Wyniki przedstawiono na wykresie poniżej.

Rys5. Widmo spektrofotometryczne i fluorescencyjne zebranych związków

Analizując nałożone widma absorpcyjne i fluorescencyjne dla pierwszego przypadku – witamina B12 (rys.5) , można stwierdzić brak intensywnej fluorescencji danego związku – występuję ona na poziomie szumów aparatury; związana jest ona z obecnością atomu kobaltu, który jest ferromagnetykiem.

Analogicznie do witaminy B12, hemoglobina ma słaba właściwości fluorescencyjne. i tak samo jak dla witaminy B12 są one w zakresie szumu, co w tym przypadku spowodowanie jest obecności atomu ferromagnetycznego żelaza.

Protoporfiryna IX w przeciwieństwie do wyżej wymienionych- witaminy B12 i hemoglobiny, wykazuje fluorescencje z lokalnym maksimum przy 630 nm, co jest spowodowane brakiem atomu metalu w centrum struktury tetrapirolowej.

1. Kolejno zrobiono pomiar absorpcji związków TTP

Poniżej przedstawiono wykres absorpcji związków typu TTP

Rys6. Widmo spektrofotometryczne zebranych związków typu TTP

Nałożone widma spektrofotometryczne wybranych związków typu TTP pokazuję niewielkie przesuniecie maksimum w kierunku krótszych fal dla związku ze wbudowanym atomem manganu w strukturę. Na widmie widoczne są trzy pasma Q dla związku TTP, natomiast związek MnTDCPP nie posiada widocznych pasm Q. Można wnioskować, że metal wbudowany do „free base” powoduję wygaszenie pasma Q.

Część III- Badanie wpływu metali na właściwości związków tetrapirolowych.

Rys7. Widmo spektrofotometryczne zebranych związków

Na rys.7 który przedstawia zestawienie widm chlorofilu a, Zn chlorofilu, Pt chlorofilu. Zmiana metalu z Mg dla chlorofilu a na Zn powoduję nieznaczna zmianę w pasm absorpcji i emisji, natomiast wbudowanie platyny w chlorofil powoduję przesuniecie maksimów w kierunku krótszych fal.

Energię przejść wyznaczono na podstawie różnic energii fali podstawowej i wzbudzonej:

$E = \frac{\text{hc}}{\lambda}$ , gdzie

h- stała Plancka6, 626 • 10⁻³⁴J • s

c- prędkość światła $\cong 3 \bullet 10^{8}\frac{m}{s}\ $

λ- długość światła [nm]

Próbka	Energia przejścia [eV]
albumina	3,52
albumina+ 1 kropla stęż. KI	3,52
albumina+ 2 krople stęż. KI	3,52
albumina+ 3 krople stęż. KI	3,52
tryptofan	3,48
tryptofan+ CuSO4	3,48

1. Podsumowanie

Celem doświadczenia było zbadanie fluorescencji związków biologicznie czynnych, rejestrowanie widm absorpcyjnych i emisyjnych wyżej wymienionych związków oraz badanie wpływu metali na właściwości związków tetrapirolowych. Badania przeprowadzono w grupach 3 osobowych. Wcześniej założony cel ćwiczenia został osiągnięty.

Ćwiczenie laboratoryjny pozwoliło na zaobserwowanie wpływu wygaszaczy takich jak jodek potasu i siarczan(VI) miedzi(II) na intensywność widma emisyjnego tryptofanu(przedstawiciela aminokwasów) oraz albuminy(białka zbudowanego głównie z  kwasu asparaginowego i glutaminowego, które stanowią 25% struktury). Druga część ćwiczenia dotyczyła wpływu metalu wbudowanego w strukturę tetrapirolową na położenie pasma Soreta umiejscowionym na widmie absorpcyjnym. Można wywnioskować z przebiegu ćwiczenie, iż różny jest wpływ wbudowanego jonu metalu na widmo absorpcyjne. Jednakże wyraźny wpływ można zobaczyć na widmie fluorescencyjnym związków tertapirolowych. Wbudowany atom metalu w strukturę powodował wygaszenie fluorescencji. Wbudowanie atomu metalu może także spowodować wygaszenie pasm Q, co można zaobserwować na przykładzie TTP i MnTDCPP. Ostatnia część ćwiczenia pokazała wpływ wbudowanego metalu do struktury chlorofilu. Ogólnie, im cięższy jest atom metalu w strukturze, tym maksimum przesunięte jest w kierunku krótszych fal.