Slajd 1

Ocena wartości dowodu z badania DNA

Izolacja DNA

Pomiar stężenia

DNA

Amplifikacja (PCR) loci

polimorficznych

Analiza porównawcza – próbka

dowodowa - próbka referencyjna

Ocena wartości dowodu z badania

DNA (statystyka)

Przygotowanie opinii

Oględziny dowodów, zabezpieczanie śladów

Elektroforeza fragmentów DNA

Interpretacja wyników

Ekspertyza genetyczna

Sekwencjonowanie DNA

(mtDNA)

CSF1PO

D5S818

D21S11

TH01

TPOX

D13S317

D7S820

D16S539

D18S51

D8S1179

D3S1358

FGA

VWA

AMEL

Płeć

Penta E

Penta D

D2S1338

D19S433

Wybór markerów genetycznych nie jest przypadkowy

Badania populacyjne

•

Ich wyniki stanowią podstawę do wyboru locus jako markera identyfikacyjnego

– Locus powinna charakteryzować wysoka heterozygotyczność
– Zgodność z regułą Hardy’ego-Weinberga (allele niezależne statystycznie w obrębie

locus)

– Brak sprzężenia genetycznego z innymi markerami wykorzystywanymi w procesie

identyfikacji genetycznej (allele niezależne statystycznie dla różnych loci)

•

Znajomość częstości alleli niezbędna jest do oceny wartości dowodu z badania DNA

Podstawowa zasada w genetyce populacyjnej, zgodnie z którą

częstości genotypów i alleli w dużych, losowo krzyżujących się

populacjach pozostają niezmienne we wszystkich pokoleniach, przy

założeniu braku mutacji, migracji i doboru naturalnego.

Reguła Hardy’ego – Weinberga

Przykład – reguła Hardy’ego-Weinberga

•

Częstości alleli i genotypów są powiązane za pomocą prostego równania

+2pq+q

= 1

•

Częstości genotypów

– AA = 81%
– Aa = 18%
– aa = 1%

•

Częstości alleli (populacja 100 osób = 200 alleli)

– A = 162 allele + 18 alleli = 190 alleli = 90% = 0,9 (p)
– a = 2 allele + 18 alleli = 20 alleli = 10% = 0,1 (q)

•

p + q = 100% = 1

•

Oczekiwana częstość osobników homozygotycznych: AA = 0,9 x 0,9 = 0,81 =
p

oraz aa = 0,1 x 0,1 = 0,01 = q

•

Oczekiwana częstość osobników heterozygotycznych: 2 x 0,9 x 0,1 = 0,18 =
2pq

•

Reguła HW to przybliżenie stanu rzeczywistego – nie uwzględnia ewolucji

•

Zmiany częstości genów w populacjach zachodzą na skutek: 1)mutacji, 2)
działania doboru naturalnego, 3) dryfu genetycznego, 4) migracji

Obliczenia zgodności z regułą Hardy’ego-Weinberga

• W praktyce porównuje się heterozygotyczność obserwowaną z

heterozygotycznością oczekiwaną (zgodnie z równaniem HW)

• Badania populacyjne pozwalają na określenie heterozygotyczności

obserwowanej (O)

• Za pomocą prostego testu Chi kwadrat możemy ocenić, czy nasze

wyniki są bliskie wartości oczekiwanych (E)

• χ2 = ∑ (O

– E

)2/E

• Test dokładny Fishera można zastosować w tym samym celu
• Oprogramowanie komputerowe umożliwia przeprowadzenie

stosownych obliczeń

Stan równowagi Hardy’ego-Weinberg’a

Marker genetyczny jest w stanie równowagi Hardy’ego-Weinberga, gdy

oczekiwane

częstości

genotypów są zgodne z

obserwowanymi

częstościami genotypów.



Stan równowagi HW dowodzi, że marker jest

stabilny genetycznie

nie obserwujemy

działania presji ewolucyjnej lub nieprzypadkowego kojarzenia.



W praktyce testy mogą wykazać potencjalny nadmiar homozygot, który często tłumaczony

jest poprzez „

wypadanie alleli

”, a więc niedoskonałość testu powodującą uzyskiwanie

fałszywych oznaczeń jednego allela z dwóch różnych istniejących faktycznie – np. mutacja
w miejscu wiązania startera PCR (allele zerowe).

Stan równowagi Hardy’ego-Weinberga może być zakłócony, gdy:

A. ma miejsce pokrewieństwo wśród rodziców → podwyższona liczba homozygot.
B. istnieje silna istotna substruktura populacji
C. ma miejsce selekcja – osobnicy o pewnych genotypach przekazują je wydajniej niż
osobnicy o innych genotypach

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

Allele Number

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

Allele Number

2. Pula alleli jest próbą losową, a każdy allel jest niezależnym

„losem” z jego rozkładu częstości

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

Allele Number

Rozkład skorelowany

1. Zależności pomiędzy allelami w różnych loci

Trzy prawa prawdopodobieństwa

Wartości prawdopodobieństw leżą w zakresie od 0 do 1 (0%-100%)

Zdarzenia mogą się wzajemnie wykluczać. W tym przypadku
prawdopodobieństwa poszczególnych zdarzeń możemy sumować.

Prawdopodobieństwo, że zajdzie jedno z dwóch zdarzeń wzajemnie wykluczających się

jest równe 1 czyli 100 %
- Prawdopodobieństwo zdarzenia H = 1 – prawdopodobieństwo zdarzenia G.

3. Jeśli dwa zdarzenia są niezależne od siebie, to ich prawdopodobieństwa

możemy przemnażać. Wtedy prawdopodobieństwo, że jednocześnie zajdą
niezależne zdarzenia H i G = iloczynowi prawdopodobieństw dla tych
dwóch zdarzeń

O markerach genetycznych, które są od siebie niezależne (są od siebie odpowiednio oddalone

fizycznie przez co dziedziczą się niezależnie) mówimy, że są w stanie

równowagi

sprzężeń

(linkage equilibrium), są więc statystycznie niezależne.

Markery zależne są w stanie

nierównowagi sprzężeń

(linkage disequilibrium) – w tym

przypadku nie możemy stosować reguły mnożenia (zdarzenia nie są niezależne od siebie, a
więc trzecie prawo prawdopodobieństwa nie jest spełnione).

Nierównowaga sprzężeń

(linkage disequilibrium, LD)

Testowanie możemy prowadzić również w oparciu o prosty test Chi kwadrat

Program Arlequin

Analiza porównawcza ślad - próbka referencyjna

Układ

polimorficzny

Dowód 1 Dowód 2

Dowód 3

D3S1358

16, 17

14, 17

14, 15

16, 17

14, 15

VWA

14, 19

15, 17

16, 19

14, 19

16, 19

D16S539

11, 12

12, 13

11, 12

9, 13

D2S1338

19, 24

19, 23

19, 24

17, 20

Amelogenina

X, Y

X, Y

X, Y

X, Y

X, Y

D8S1179

10, 15

13, 14

D21S11

28, 30

D18S51

14, 15

14, 17

14, 18

14, 15

18, 19

D19S433

12, 13

12, 18.2

13, 13.2

12, 13

14, 15

TH01

6, 9.3

6, 8

9, 9.3

6, 9.3

8, 9.3

FGA

23, 24

22, 23

23, 24

Brak zgodności profili DNA

Układ

polimorficzny

Dowód 2

D3S1358

14, 17

14, 15

VWA

15, 17

16, 19

D16S539

9, 13

D2S1338

19, 23

17, 20

Amelogenina

X, Y

D8S1179

10, 15

13, 14

D21S11

28, 30

D18S51

14, 17

18, 19

D19S433

12, 18.2

14, 15

TH01

6, 8

8, 9.3

FGA

Porównanie wykazało brak zgodności oznaczonego w próbce dowodowej profilu
DNA z profilem genetycznym oznaczonym w nadesłanym materiale porównawczym.
Należy wykluczyć możliwość pochodzenia próbki dowodowej od podejrzanego.

Niepełny profil DNA

Częściowy profil genetyczny, który oznaczono w próbce dowodowej nie pozwala na
przeprowadzenie wnioskowania odnośnie zgodności profili DNA.

Układ

polimorficzny

Dowód 3

D3S1358

14, 17

VWA

15, 17

D16S539

D2S1338

19, 23

Amelogenina

X, Y

X, Y

D8S1179

10, 15

D21S11

28, 30

D18S51

14, 17

D19S433

12, 18.2

TH01

6, 8

FGA

Zgodność profili DNA

Profil DNA oznaczony w próbce dowodowej jest zgodny z profilem DNA
charakterystycznym dla podejrzanego A.

Co dalej ?

Układ

polimorficzny

Dowód 1

D3S1358

16, 17

VWA

14, 19

D16S539

11, 12

D2S1338

19, 24

Amelogenina

X, Y

D8S1179

D21S11

D18S51

14, 15

D19S433

12, 13

TH01

6, 9.3

FGA

23, 24

1. Sprawca pozostawił swój materiał
biologiczny na miejscu zdarzenia

2. Podejrzany w wyniku działania
przypadku ma taki sam profil DNA jak
materiał pozostawiony na miejscu
zdarzenia (może też być blisko
spokrewniony ze sprawcą ...)

3. Błąd laboratorium

Powody uzyskania zgodności profili

Oskarżenie:
ślad pochodzi od
podejrzanego

Obrona: ślad pochodzi
od nieznanego sprawcy,
podejrzany w wyniku
przypadku ma profil
zgodny z profilem śladu

Hipoteza oskarżenia i hipoteza obrony

Jak ocenić wartość uzyskanego dowodu

• Naszym zadaniem jest udzielenie odpowiedzi na pytanie,

czy jest

prawdopodobne, że do zgodności profili DNA w analizowanych próbkach
doszło na skutek przypadku ?

• Odpowiedź uzyskamy poprzez obliczenie częstości danego genotypu (profilu
DNA) w populacji.
• Jeśli profil DNA jest częsty (np. ma go 1 na 10 osób) prawdopodobieństwo
przypadkowej zgodności jest wysokie.
• Jeśli jednak okaże się, że profil jest rzadki (np. ma go 1 na 1 miliard osób)
prawdopodobieństwo przypadkowej zgodności jest bardzo niskie.
• Dowód w tym drugim przypadku jest bardzo mocny.

Szansa

a priori

na rzecz winy =

Pr(G)/Pr(nieG)

- podejrzany jest winny

nieG

- podejrzany jest niewinny

dowód z badania DNA

Szansa a priori

rzecz winy
podejrzanego - wynika
z wszelkich informacji
wynikających
z dochodzenia, poza
dowodem
z laboratorium

Szansa a posteriori

na rzecz winy

podejrzanego - ustalona przez sąd -
wynika z wszelkich dopuszczonych
dowodów w sprawie (w tym dow. z DNA!)

)

(

)

(

)

(

)

(

)

(

)

(

nieG

Szansa
a posteriori

Szansa
a priori

Iloraz

wiarygodności

Miara wartości dowodu

Prawo Bayesa w postaci szansy

dowód z badania DNA

prawdopodobieństwo prawdopodobieństwo

winy a priori

winy a posteriori

Dowód z badania DNA modyfikuje prawdopodobieństwo
winy a priori

Prawdopodobieństwo przypadkowej zgodności

(match probability)

Prawdopodobieństwo, że inna

niespokrewniona

osoba wybrana losowo z populacji

ma identyczny profil DNA może być oszacowane poprzez obliczenie częstości z
jaką ten profil DNA (genotyp) występuje w populacji.

 Częstości alleli poznajemy dzięki badaniom populacyjnym.
 Populacyjne bazy danych powinny gromadzić dane dla osób
niespokrewnionych o ustalonym pochodzeniu etnicznym.
 Jaką bazę danych wybrać w celu przeprowadzenia obliczeń?

dla różnych grup etnicznych

- dla jednej grupy etnicznej

- dla regionu np. Małopolski.

P(E|nieG) = prawdopodobieństwo
przypadkowej zgodności dwóch profili

(match probability, MP)

= prawdopodobieństwo posiadania przez
przypadkową osobę
z populacji profilu DNA zgodnego z profilem
DNA podejrzanego =

częstość profilu DNA

w populacji

Prawdopodobieństwo przypadkowej zgodności

Kontradyktoryjność procesu sądowego

Iloraz dwóch prawdopodobieństw warunkowych:

– ustalono dowód, bo podejrzany jest winny

– ustalono dowód, ale doszło do tego przez przypadek, a

podejrzany w rzeczywistości jest niewinny

LR (likelihood ratio) - iloraz wiarygodności służy do
porównania prawdopodobieństw dowodu przy założeniu
dwóch alternatywnych twierdzeń (hipoteza zerowa i
hipoteza alternatywna).

zgodność profili DNA

Iloraz wiarygodności LR – stosunek dwóch prawdopodobieństw tego samego
zdarzenia (zgodności profili DNA) przy założeniu różnych hipotez.

Jak bardzo dowód (ustalona zgodność profili
DNA) zwiększa prawdopodobieństwo, że to
oskarżony pozostawił dany ślad?”

)

(

)

(

niewinny

jest

podejrzany

DNA

dowód

winny

jest

podejrzany

DNA

dowód

Iloraz wiarygodności

)

(

)

(

)

(

)

(

)

(

)

(

nieG

„

uzyskanie zgodności

profilu DNA podejrzanego

z profilem DNA z miejsca zdarzenia jest

milion

razy bardziej prawdopodobne,
przy założeniu, że jest on sprawcą (źródłem
śladu),

niż

uzyskanie takiej zgodności

jeżeli ślad

pozostawiła inna, niespokrewniona
z podejrzanym osoba, a zgodność podejrzanego
jest dziełem przypadku”

Sposób wyrażania wyniku analizy LR

Wartość LR

przekłada się liczbowo na

szansę powtórzenia się danego zgodnego
profilu DNA w populacji

np.

LR = 100 bilionów

szansa powtórzenia się powyższego profilu DNA
w populacji ... wynosi jak

1 na 100 bilionów

niespokrewnionych osób.

Która hipoteza jest bardziej prawdopodobna

hipoteza prokuratury – to podejrzany popełnił przestępstwo.
Prawdopodobieństwo zgodności profili DNA jest wtedy równe
100%; Hp = 1

hipoteza obrony – to inna losowa osoba z populacji popełniła
przestępstwo, a zgodność profili jest dziełem przypadku

Która hipoteza jest bardziej prawdopodobna

Częstość genotypu w populacji

Marker

genetyczny

Allel 1

Allel 2

Wzór

Częstość

genotypu

D3S1358

0.26159

0.25331

2pq

0.1325

Reguła mnożenia

(product rule)

Częstość profilu DNA obliczana jest poprzez oszacowanie
częstości genotypu dla każdego locus, a następnie
przemnożenie wartości dla wszystkich loci genetycznych.

Reguła mnożenia może być zastosowana dzięki niezależności
analizowanych markerów genetycznych.

Która hipoteza jest bardziej prawdopodobna

Częstość genotypu w populacji

Marker

genetyczny

Allel 1

Allel 2

Wzór

Częstość

genotypu

D3S1358

0.26159

0.25331

2pq

0.1325

VWA

0.28146

0.20033

2pq

0.1128

D16S539

0.32616

0.32119

2pq

0.2095

Analiza wielu niezależnych markerów DNA

Marker

genetyczny

Allel 1

Allel 2

Wzór

Częstość

genotypu

D3S1358

0.26159

0.25331

2pq

0.1325

VWA

0.28146

0.20033

2pq

0.1128

D16S539

0.32616

0.32119

2pq

0.2095

D2S1338

0.26124

0.22132

2pq

0.1156

D8S1179

0.30464

0.18543

2pq

0.1130

D21S11

0.27815

0.19536

2pq

0.1087

D18S51

0.15894

0.13907

2pq

0.0442

D19S433

0.16124

0.15426

2pq

0.0497

TH01

9.3

0.36755

0.23179

2pq

0.1704

FGA

0.21854

0.18543

2pq

0.0810

Częstość profilu DNA

1.35 x 10

-10

Brak zgodności profili DNA

Układ

polimorficzny

Dowód 1

D3S1358

16, 17

VWA

14, 19

D16S539

11, 12

D2S1338

19, 24

Amelogenina

X, Y

D8S1179

D21S11

D18S51

14, 15

D19S433

12, 13

TH01

6, 9.3

FGA

23, 24

Profil DNA oznaczony w próbce dowodowej jest zgodny z profilem DNA
charakterystycznym dla podejrzanego A.

Brak zgodności profili DNA

Prawdopodobieństwo, że ujawniona zgodność jest dziełem przypadku wynosi
1 x 10-12, innymi słowy teoretyczna szansa powtórzenia się danego zgodnego profilu
DNA w populacji niespokrewnionych mieszkańców Polski wynosi jak 1: 1 biliona osób.

Profil DNA oznaczony w próbce dowodowej jest zgodny z profilem DNA
charakterystycznym dla podejrzanego A.

Zgodność profili DNA jest 1 bilion razy bardziej prawdopodobna jeśli, to podejrzany jest
źródłem próbki dowodowej, niż jeśli jakaś inna przypadkowa osoba z populacji stanowi
jej źródło.

Wartości ilorazu wiarygodności (LR) wspomagające
hipotezę oskarżenia:

1 - 10 dowód słaby

10 - 100 średni umiarkowany

100 - 1000 umiarkowanie mocny

1000 - 10 000 mocny

10 000 - 100 000 bardzo mocny

wyjątkowo mocny > 1 milion

Skala obrazująca wartość dowodu

N=260 mln mieszkańców USA (System CODIS - 13
loci typu STR) – US FBI październik 1997

Jeżeli z dużą statystyczną precyzją określi się, że ślad
pochodzi od podejrzanego, to znaczy, że naprawdę od
niego pochodzi, a jeżeli inne dowody przemawiają na
korzyść podejrzanego, należy znaleźć inne
wytłumaczenie ustalonej zgodności:

- naniesienie w innym czasie, niezależnym od
zdarzenia

- ślad mógł być celowo podrzucony

Konserwatywny sposób wypowiadania się co do
źródła pochodzenia śladu przez FBI

Problem częstości rzadkich alleli

Dla alleli bardzo rzadkich przyjmuje się wartość częstości = 5/2N
(zalecane przez NRC II), gdzie N = liczba zbadanych osób

Podobieństwo profili DNA

Układ polimorficzny

Siostra NN?

D3S1358

15, 18

VWA

17, 18

D16S539

D2S1338

16, 25

Amelogenina

X, Y

D8S1179

10, 15

D21S11

29, 30.2

D18S51

16, 17

D19S433

15, 16

13, 15

TH01

7, 9

7, 9.3

FGA

21, 22

• Współczynnik pokrewieństwa F (Theta) – miara poziomu

pokrewieństwa pomiędzy dwiema osobami

• Prawdopodobieństwo, że dana osoba posiada kopię allela przodka

(identical by descent, ibd)

• Dla rodzica i dziecka oraz rodzeństwa F=1/4
• Dla wuja i siostrzenicy F=1/4
• Dla kuzynów pierwszej linii F=1/16
• Przy kojarzeniu w pokrewieństwie oczekiwana częstość heterozygot

jest zredukowana właśnie o współczynnik F

• Przy obliczaniu wartości dowodowej w sprawach dot. spornego

ojcostwa w pokrewieństwie należy zastosować odpowiednią korektę

Problem pokrewieństwa podejrzanych

Związek z podejrzanym

Prawdopodobieństwo zgodności

Niespokrewniony

1 na miliard

Pierwszy kuzyn

1 na 100 milionów

Pół-rodzeństwo

1 na 10 milionów

Rodzic/dziecko

1 na 1 milion

Rodzeństwo

1 na 10 tysięcy

Problem pokrewieństwa podejrzanych

• Dochodzenie spornego ojcostwa (czy ten mężczyzna

jest biologicznym ojcem dziecka?)

• Dochodzenie spornego pokrewieństwa (czy ten

mężczyzna jest wujkiem dziecka?)

• NN –identyfikacja szczątków ludzkich (czy ten fragment

ludzkiego ciała pochodzi od zaginionego krewnego?)

Analiza pokrewieństwa (podstawowa)

• Więcej niż jeden analizowany scenariusz

• Masowe groby, katastrofy
• Sprawy imigracyjne

• Jednocześnie można porównywać pomiędzy

sobą tylko dwie alternatywne hipotezy.

• Zaawansowane programy komputerowe do

rozwiązywania tego rodzaju problemów, np.
DNA_VIEW.

Analiza pokrewieństwa (zaawansowana)

Dochodzenie spornego ojcostwa

Współczynnik ojcostwa

(paternity index, PI = LR)

Iloraz wiarygodności: H

szansa, że to pozwany przekazał allel

szansa, że inny przypadkowy mężczyzna przekazał allel

= 1

jeśli ojciec jest homozygotą

= 0.5

jeśli ojciec jest heterozygotą

D3 :

Matka: 15, 17

Dziecko: 15

Ojciec: 15

to allel pochodzący od ojca, częstość = 0.2335

PI = 1/0.2335 = 4.28

Układ

polimorficzny

matka

dziecko ojciec?

θ=0

θ=0,25

D3S1358

15,17

4.28

1.89

VWA

16,19

16,19

3.82

1.46

D16S539

11,13

11,13

2.69

1.37

D2S1338

17,24

17,24

5.0

1.50

Amelogenina

X,Y

D8S1179

12,13

12,14

1.00

2.29

D21S11

29,31

29,31

4.30

1.50

D18S51

12,17

4.20

1.04

D19S433

13,15

14,15

14,15

1.40

1.70

TH01

9.3

7,9.3

1.73

0.90

FGA

22,24

22,24

3.60

2.46

D5S818

11,13

11,12

12,13

1.25

1.59

D13S317

9,13

12,13

12,13

2.19

2.07

D7S820

8,11

2.90

1.00

współczynnik ojcostwa CPI (LR)

274 900,75

250,95

Łączny współczynnik ojcostwa

(combined paternity

index, CPI)

Współczynnik ojcostwa CPI = sumaryczna wartość LR -
Uzyskanie

wyników analizy (brak wykluczenia pozwanego)

jest 100 000 razy bardziej prawdopodobne, przy

założeniu,

że pozwany jest biologicznym ojcem dziecka ...,

niż uzyskanie powyższych wyników analizy DNA, przy
założeniu, że biologicznym ojcem jest inny niespokrewniony
z nim

mężczyzna, a pozwany nie wyklucza się w wyniku

działania przypadku.

Wynik w postaci współczynnika ojcostwa (LR)

PI = L = 100 000

a priori

p = 0,5 wówczas

[

W = L /(L + 1)]

prawdopodobieństwo ojcostwa (a posteriori)

W = 99,999%

Prawdopodobieństwo ojcostwa (W)

•Inny (bardziej przejrzysty dla sądu sposób wyrażenia
prawdopodobieństwa

•Prawdopodobieństwo ojcostwa

W = pL /(pL + 1-p)

• W = Wahrscheinlichkeit (prawdopodobieństwo)

• p = prawdopodobieństwo a priori

• L = PI

PI = L = 100 000

a priori

p = 0.2 wówczas

[

W = pL /(pL + 1-p)]

prawdopodobieństwo ojcostwa (a posteriori)

W = 99,996%

Prawdopodobieństwo ojcostwa (W)

• Wiarygodny mężczyzna twierdzi, że oskarżenie kobiety
jest fałszywe

• Statystyka mówi, że np. w podobnych przypadkach tylko 1 raz
na 5 mężczyzna jest winny

• p zamiast 0,5 może zostać ustalone na 1/5 tj. 0.2

14,18

15,18

15,17

,18

,17

15,17

Typowa transmisja alleli

(brak mutacji)

Mutacja ojcowska

Problem mutacji w komórkach płciowych

Sprawa dotycząca kazirodztwa