Trzy główne składniki DNA:
zasady purynowe – guanina (G), adenina (A)
zasady pirymidynowe – cytozyna, tymina
cukier (deoksyryboza)
fosforan
Wyższy poziom zorganizowania DNA to nukleozydy:
zasady nukleidowe poprzez wiązanie glikozydowi do atomu C - 1
cząsteczka cukru jest dołączana do atomu:
- N – 1 w zasadach pirymidynowych
- N – 9 w zasadach purynowych
MUTAGENEZA
Wyróżniamy trzy typy uszkodzeń genetycznych:
mutacje punktowe (dotyczące zmian w DNA)
klastogeneza (dotyczy zmiany struktury chromosomalnej)
aneuploidia (niejednolity rozdział chromosomów podczas podziału komórki)
Mutacje punktowe:
podstawienia zasady:
tranzycja – puryna przez purynę, pirymidyna przez pirymidynę
transwersja – puryna przez pirymidynę lub vice versa
występuje 6 możliwych podstawień zasady:
- dwie zmiany AT – GC, GC – AT
- cztery przemiany krzyżowe: AT – TA, AT – GC, GC – CG, GC – AT
mutacje zmiany fazy odczytu:
występują, gdy pary zasad zostają dodane lub usunięte a ich liczba różni się o 3n
pojawia się wtedy drastyczna zmiana syntezy białka
ATC AAT GCG TTA TCA ATG CGT TA
TAG TTA CGC AAT AGT TAC GCA AT
Alkilowanie – pozycje w DNA podatne na atak elektrofilowe:
| Pozycja | Guanina | Adenina | Cytozyna | Tymina |
|---|---|---|---|---|
| N – 1 | TAK | TAK | ||
| N – 3 | TAK | TAK | TAK | TAK |
| N – 7 | TAK | TAK | ||
| Atomy ergocykliczne | O - 6 | N - 6 | O – 2, N - 4 | O – 4 |
| C - 8 | TAK | TAK |
Aflatoksyna B1 (po aktywacji metabolicznej do 2,3 – epoksydu) reaguje z N – 7 guaniny.
Testy mutagenezy bakteryjnej- test Amesa:
Niezawodność testu przetestowana eksperymentalnie:
- 85% znanych kancerogenów dało odpowiedź pozytywną;
- <10% kokancerogenów dało odpowiedź pozytywną;
- jako mutageny zidentyfikowano: 40% chlorowanych kancerogenów, 75% rakotwórczych amin, 100% nitrotwórczych związków, 29% związków nie będących mutagenami.
Inne testy:
użycie fibroblastów (mutanty poznaje się po pojawieniu się kolonii odpornych na analogi puryny: 6 – tioguaninę lub 8 – azaguaninę)
oznaczanie mutageniczności u ssaków
wykorzystanie mutacji w miejscu syntezy kinazy tymidynowej;
odnotowanie liczby mutantów odpornych na alkaloid onabainę.
oznaczenie transformacji komórki;
oznaczenie wymiany chromatydu siostrzanego;
Testowanie rakotwórczości na rybach, niski koszt, większa liczba zwierząt
Testowanie biologiczne na gryzoniach, koszt od 0,5 do 1 mln $, czas do 30 miesięcy
Metody biologicznego wyboru związków chemicznych do testowania:
- badanie zależności struktura-aktywność;
- ściśle opisane procedury wykonywania testów biologicznych.
Kancerogeny to m.in.: arsen i jego nieorganiczne związki, azbest i jego prefabrykaty, 4-Aminobifenyl, benzen, benzydyna i jej sole, chlorek winylu, chrom i jego przetwórstwo, iperyt, 2-Naftyloamina, nikiel i jego rafinacje, 4-Nitrobifenyl, PAH (rozpuszczalne w benzenie).
Orientacyjne okresy czasu potrzebne do wywołania pierwszych objawów
Typ związku chemicznego (czas reakcji):
- drażniące (10min - 2h);
- neurogenne (10 - 12dni);
- teratogenne i embriotoksyczne(kilka miesięcy);
- kancerogenne (lata - dziesiątki lat);
- mutagenne (lata-pokolenia).
Testy ekotoksykologiczne:
- 10 testów na mikroorganizmach (1 – 120 dni);
- 6 testów na roślinach (5- 49 dni);
- 25 na bezkręgowcach (2 - 63 dni);
- 3 na kręgowcach (8- 154 dni).
Powody dla których warto stosować testy krótkotrwałe:
- szybkość- błyskawiczna odpowiedź na postawione pytanie, możliwość podjęcia natychmiastowej decyzji;
- prostota - mogą być rutynowo przeprowadzane przez pracowników technicznych w każdym laboratorium;
- niski koszt - można testować dużą liczbę substancji chemicznych na wielu gatunkach.
Wady testów krótkotrwałych (powody, dla których nie warto robić testów krótkotrwałych):
- zaniedbywanie faktu, że niektóre substancje kumulują się w organizmach;
- zaniedbują możliwość kumulacji i efektów toksycznych z czasem;
- zaniedbują występowanie innych skutków niż wzrost, śmiertelność i spadek rozrodczości, np. zmiana tempa wzrostu (spadek konsumpcji itp.);
- biorą pod uwagę tylko niewielki fragment historii życia organizmu;
- nie pozwalają na wnioskowanie o skutkach na poziomie dynamiki populacji.
Wnioski:
- testy ekotoksykologiczne powinny obejmować przynajmniej ½-2/3 czasu życia organizmu;
- w wypadku umiarkowanie toksycznych substancji o skłonności do akumulacji w organizmie powinno się prowadzić testy długotrwałe;
- krótkotrwałe testy (eko)toksykologiczne nie doceniają skutków działania substancji toksycznych o trwałej i umiarkowanej toksyczności, ale mogą przecenić efekty działania substancji chemicznych silnie toksycznych.
Ocena narażenia na czynniki rakotwórcze
W praktyce wykonuje się badania skrócone, obejmujące oznaczanie cech m.in. organoleptyczne wody, wskaźniki bakteriologiczne, wybranych wskaźników chemicznych np. zawartość wolnego Cl.
Miernikami umożliwiającymi ocenę jest analiza tkanek lub płynów ustrojowych człowieka, analizy te nazywane są biomarkerami lub markerami biologicznymi. Prowadzą do wykrycia w tkankach lub płynach ustrojowych: egzogennych substancji chemicznych, metabolitów substancji chemicznych, zmienionych poziomów enzymów, innych substancji biochemicznych związanych z interakcjami szkodliwymi.
Biomarker to każdy pomiar interakcji zachodzącej w systemach biologicznych z potencjalnymi zagrożeniami, mogącymi mieć charakter chemiczny, fizyczny lub biologiczny. Mierzona odpowiedź organizmu wywołana tą interakcją może mieć charakter funkcjonalny, fizjologiczny, biochemiczny na poziomie komórkowym lub molekularny na poziomie sub-komórkowym. Podstawą stosowania biomarkerów jest istotna zależność między stężeniem substancji szkodliwych (lub ich metabolitów oraz związanych z tym zmian) w narządach krytycznych (tj. wątrobie, nerkach, sercu, mózgu), a stężeniem trucizn i ich metabolitów (lub zaburzeń w procesach biochemicznych) w mediach wskaźnikowych (tj. krwi, moczu).
Sekwencja wydarzeń między narażeniem na czynniki rakotwórcze, a wystąpieniem choroby nowotworowej:
W zależności od tego, jakie procesy sekwencji wydarzeń są określone przy użyciu biomarkerów klasyfikuje są jako:
- ekspozycji są to obecne wewnątrz organizmu mierzalne egzogenne substancje lub ich metabolity lub też produkty interakcji między czynnikiem szkodliwym i docelowymi komórkami lub cząsteczkami.
a). biomarker dawki biologiczne skutecznej - ilość wchłoniętego ksenobiotyku, która faktycznie reaguje z takimi składnikami komórki jak białka czy kwasy nukleinowe, w tym DNA.
Szczególnie przydatną metodą w określaniu dawki biologicznie efektywnej jest oznaczanie adduktów, jakie związki rakotwórcze (lub ich metabolity) tworzą z makrocząsteczkami komórkowymi, czyli białkami oraz DNA. U podstaw tej metody leży fakt, że większość związków rakotwórczych to związki elektrofilne lub ulegające transformacji do metabolitów o takich właściwościach. Elektrofilne związki rakotwórcze mogą wiązać się kowalencyjnie z miejscami nukleofilnymi w białkach lub DNA, tworząc odpowiednie addukty.
b). b. dawki wewnętrznej to ilość substancji która wnika do organizmu w wyniku przyjmowania pokarmu, inhalacji, absorpcji przez skórę itd.
- b. skutków to mierzalne biochemicznie, fizjologiczne, behawioralne i inne zmiany zachodzące wewnątrz organizmu, które-zależności od wielkości-mogą być rozpoznawalne jako łączące się z już obecnymi lub mogącymi pojawić się później zaburzeniami zdrowotnymi i chorobowymi.
- b. wrażliwości są wskaźnikami wrodzonej lub nabytej zdolności organizmu do odpowiedzi wywołanej ekspozycją na specyficzny czynnik szkodliwy np. przebyty choroby, czynniki fizjologiczne czy genetyczne.
Zarówno badania na zwierzętach, jak i badania epidemiologiczne wskazują wyraźnie, że istnieje wiele czynników, które mogą zmienić indywidualną odpowiedź na czynniki rakotwórcze. Mogą to być zarówno przebyte choroby, czynniki fizjologiczne lub żywnościowe jak i genetyczne. Związek między czynnikami środowiskowymi i genetycznymi określany jest terminem „ekogenetyczność”.
Za powstawanie pewnych ludzkich nowotworów mogą być odpowiedzialne interakcje zachodzące między chemicznymi kancerogenami oraz wirusami obecnymi np. w wątrobie, nosogardzieli czy narządach płciowych. Wiadomo także, że pewne hormony odgrywają ważną rolę, jako czynnik ryzyka, w odniesieniu do raka piersi u kobiet, chociaż związek między hormonami sterydowymi i prolaktyną w powstawaniu raka piersi nie jest jednoznaczny. Wcześniejsza ekspozycja na substancje chemiczne indukująca odpowiedź immunologiczną może uwrażliwić daną osobę na kolejną ekspozycję, np. poprzez rozwinięcie się nadwrażliwości płucnej po ekspozycji na pył czy substancje chemiczne.
Biomarker ekspozycji – dawka wewnętrzna (przykłady):
| Substancja rakotwórcza | Substancja oznaczana |
|---|---|
| Akrylonitryl | Akrylonitryl w moczu |
| Izotiocyjanina w moczu | |
| Benzen | Fenol w moczu |
| Benzen w moczu | |
| Benzen w wydychanym powietrzu | |
| Mieszanina WWA | 1-hydriksypiren w moczu |
| Różne związki | Tioestry w moczu |
| Kwas glikuronowy w moczu |