WYKŁAD 2

Ocena zanieczyszczeń

• wykorzystuje się podejście chemiczne i ekotoksykologiczne

• podejście chemiczne posługuje się metodami analizy chemicznej zanieczyszczeń. Analizy tego typu są stosunkowo drogie i pracochłonne, wyniki przedstawione są w postaci zawartości (stężeń), znając więc koncentrację zanieczyszczenia w środowisku rezultaty nie dają odpowiedzi na pytanie jaki jest skutek biologiczny

• podejście ekotoksykologiczne wykorzystuje testy toksyczności. Rezultaty nie przedstawiają stężeń zanieczyszczeń (metali, związków organicznych), dają jednak odpowiedź na pytanie o ich wpływ na organizmy (np.: plankton, ryby)

Analizy fizykochemiczne, a biotesty

• metody fizykochemiczne – analizy standaryzowane według norm i standardów fizycznych oraz chemicznych wskaźników czystości wód; polega na analizie wszystkich zanieczyszczeń w wodzie za pomocą drogiej i trudnej w obsłudze aparatury, wyniki są łatwiejsze do porównań

• biotesty – analizy uogólnionego wpływu zanieczyszczeń środowiska przy zastosowaniu bioindykatorów; nie umożliwiają wskazania konkretnych zanieczyszczeń odpowiedzialnych za zmianę aktywności biologicznej indykatora, wyniki ułatwiają ocenę ad hoc skażenia

Czy możliwa jest pełna analiza wody? – czynniki wpływające

• duża ilość składników – np.: metale ciężkie, aniony organiczne

• zróżnicowanie stężeń – głównie ilości śladowe i mikrośladowe

• fluktuacja stężeń w czasie i przestrzeni

• złożony układ matrycy – możliwość interferencji, addycji, znoszenia się efektu substancji

• skomplikowane, czaso i pracochłonne procedury przygotowania próbek – w przypadku gleb:

  • przygotowanie planu poboru z uwzględnieniem kierunków geograficznych

  • pobór próbek za pomocą urządzenia

  • pakowanie próbek

  • opis zawierające istotne dane terenowe

  • kupażowanie (10) próbek z danego miejsca

  • pobór próby uśrednionej z kupażu

  • przeprowadzenie analizy fizykochemicznej

• dodatkowe obciążenie środowiska poprzez zastosowanie odczynników chemicznych - przede wszystkim poprzez dodatek rozpuszczalników organicznych używanych na etapie przygotowania próbek (dodatkowe skażenie środowiska)

• dodatkowe koszty – związane z koniecznością zakupu odczynników wysokiej jakości, ich utylizacją i zagospodarowaniem odpadów (nasila się tendencja do wykorzystywania odpadów do produkcji dóbr pełnowartościowych poprzez ekstrakcję, przy czym z końcowego odrzutu robi się nawozy; dodatkowa ekstrakcja pozwala uzyskać substancje bakteriobójcze i grzybobójcze jako substrat do produkcji wkładek do butów, dezodorantów, tacek spożywczych)

Skład chemiczny wycieków osadowych

• metale

• kationy

• aniony organiczne

• inne

Sumaryczne wskaźniki wód

• ChZT – chemiczne zapotrzebowanie na tlen

• BZT – biologiczne zapotrzebowanie na tlen

• OW – ogólna zawartość węgla

• OWO – ogólna zawartość węgla organicznego

Zielona chemia (green chemistry)

• nie jest w stanie podać odpowiedzi na pytania o mechanizm działania substancji

• metody chemiczne są bardzo nowoczesne, dokładne i czułe, nie odpowiadają jednak na pytanie o wpływ jaki mają substancje zanieczyszczające środowisko na organizmy

• aparatura jest droga i reprezentuje najwyższą klasę

Testy toksyczności

• są to metody pozwalające określić toksyczne działanie jednego lub całej grupy związków chemicznych na organizmy i zwierzęce

• jednym z typów testów jest test toksyczności mieszanin o nieznanym składzie

Zasada działania testów toksyczności

• przykładem może być test Daphnia lub Chlorella, oparty o działanie związków na organizmy będące czułymi indykatorami zmian; służą do opracowania komercyjnych mini-kitów

• odpowiadają na pytania o wpływ i oddziaływanie obecnych w środowisku substancji chemicznych na organizmy żywe

• do sprawdzania gleb najlepiej nadają się biotesty oparte o kiełkowanie nasion

• mogą być przeprowadzane w zasadzie przez cały rok; w przypadku planów wysiania np.: pomidorów można w okresie zimowym na glebie pobranej z terenu skiełkować nasiona – mierzonymi parametrami jest czas kiełkowania oraz wielkość i dynamika wzrostu; dodatkowo można zmierzyć właściwości fizykochemiczne. W ciągu tygodnia można w warunkach laboratoryjnych (szklarniowych) uzyskać odpowiedź czy gleba nadaje się pod uprawę danej rośliny

• testy ulegają postępowej automatyzacji – w Niemczech w celu oceny skażenia wody stosuje się przepływowe testy w których indykatorem jest Daphnia; w przypadku czystej wody zwierzęta kręcą się w prawą stronę, w przypadku zanieczyszczeń zaprzestają ruchu lub kręcą się w lewą stronę. Wyniki zbierane są za pomocą kamery, a program do obróbki obrazu wychwytuje dane

• przed użyciem niektórych organizmów, np. glonów należy przeprowadzić wstępną inkubację przez 72 godziny w świetle w celu przywrócenia natywnych właściwości fizjologicznych – właściwości chlorofilu

Mikrobiotesty

• Tetrahymena thermophila

• Brachionus calicyflorus

• Pseudokirchneriella

• Artemia salina

• Daphnia magna

• Lemna minor

• Tamnocephalus platyurus

Test Lemna

• bioindykatorem są odpowiednie gatunki z rodzaju Lemna

• w automatycznym aparacie zliczana jest ilość jak i kształt wskaźnika

Monitoring skażeń

• Komisja Europejska w Ramowej Dyrektywie Wodnej nakazuje państwom członkowskim osiągnąć dobry stan wód do 2015 roku, jak również stosowanie biotestów

• W Polsce, Wielkiej Brytanii, Irlandii, Włoszech, Niemczech i Kanadzie stosowane są ekotesty bioindykacyjne w ramach krajowego monitoringu wód śródlądowych

• komisja Helsińska – do zakładów chemicznych, tekstylnych oraz zakładów produkujących i konfekcjonujących pestycydy należy stosować szczególne zalecenia monitoringu

Standardy biotestów

• OECD zaleca testy oparte na dwóch gatunkach bioindykatorów np.: Lemna minor i Lemna gibba

• testy powinny uwzględniać głównie liczbę frondów, czyli listków pływających na powierzchni wody (organizm składa się z jednego/kilku listków i jednego/kilku korzeni)

• wadą takiej metody jest niedoszacowanie gatunków, brak odzwierciedlenia stanu fizjologicznego roślin, brak rozróżnienia roślin żywych i martwych

• należałoby zatem w badaniach uwzględniać poza ilością także powierzchnię i morfologię

• konieczne jest przez to opracowanie nowych, skutecznych testów bioindykacyjnych dla wód śródlądowych

• do tej pory poczyniono już pewne modyfikacje – uwzględnia się w niektórych testów także możliwość zamierania komórek (na co wskazuje brązowa barwa), wyniki przelicza się zatem na suchą masę

Testy toksyczności

• obecne mikrobiotesty są wykorzystywane w ponad 60 krajach całego świata:

  • algaltoxkit - 28

  • tamnotoxkit - 23

  • ostracotoxkit - 26

  • phytotoxkit - 28

• zalety mikrotestów

  • miniaturyzacja

  • przyjazność względem środowiska

  • dostępność

  • standaryzacja

  • łatwość użytkowania

  • dostosowanie do środowiska (woda, gleba, powietrze)

  • wysoka wrażliwość

  • światowy zasięg stosowania

  • niski koszt wyposażenia

Metody działania testów dla roztworów wodnych

• statyczna – stężenie substancji w roztworze z czasem się zmniejsza, a po czasie zostaje całkowicie wyeliminowane. Sytuacja ta dotyczy również składników odżywczych, gdyż woda nie jest wymieniana od momentu wprowadzenia bioindykatora; test krótkoterminowy

• recyrkulacyjna – modyfikacja metody statycznej, w celu zachowania żywotności bioindykatora doprowadzone są substancje odżywcze w stężeniu optymalnym do wzrostu oraz tlen; woda poddana badaniom nie jest w żaden sposób uzupełniana

• odnawiana – metoda ta zakłada okresową wymianę wody badanej (jednak pochodzącej ciągle z tego samego źródła) na nową, test jest standaryzowany na 24 godzinne wymiany

• przepływowa – w metodzie następuje ciągły przepływ wody w sposób naturalny lub wymuszony z zewnątrz, gwarantuje to dobre warunki wzrostu i indykacji

Podział testów toksyczności

• ze względu na efekty

  • test toksyczności ostrej (lethal) – LC50 (stężenie śmiertelne dla połowy populacji) po określonym czasie, np.: 12, 24, 48, 72 h

  • test toksyczności chronicznej – dawki subletalne (efekt występuje, czy nie)

• ze względu na miejsce przeprowadzenia testu

  • in situ

  • laboratoryjne

• ze względu na rodzaj próbek

  • środowiskowe

  • roztwory wzorcowe

• ze względu na czas

  • reakcja behawioralna, biochemiczna, fizjologiczna, morfologiczna, pojedynczych organów, populacji, ekosystemów (reakcje następujące po sobie w czasie)

  • czas reakcji jest liczony od minut do całych wieków, im dłużej rozpada się dana substancja (np. izotopy), tym dłużej trwają efekty ekspozycji na nie

  • bioakumulacja czynnika trwa przez mięsiące-lata

Ciekawostki o bioindykacji

• płyny do mycia naczyń cechuje różna toksyczność (Ludwik jest najmniej toksyczny)

• kilka dekad temu bioindykacja oparta była jedynie o organizmy zwierzęce

• ostatnio bardzo dużą popularnością cieszą się rośliny ze względów praktycznych, ekonomicznych i bioetycznych

Cechy niezbędne organizmów w bioindykacji

• powszechny i łatwy dostęp – możliwość laboratoryjnej hodowli, łatwość pozyskiwania ze środowiska, zaletą jest także możliwość sterylizacji roślin wodnych pozyskanych z badanego akwenu

• łatwość hodowli – organizm musi być opracowany w hodowli laboratoryjnej zapewniając szybkie pozyskanie odpowiedniej ilości osobników odpowiedniej jakości

• wiedza o strukturze genetycznej i genealogii – w powtarzalności badań kluczową rolę gra znajomość historii hodowli, pozwala to na standaryzację i śledzenie zmian w populacji

• wiedza o wrażliwości organizmu – poznanie oddziaływania różnych klas substancji toksycznych, zwłaszcza dla substancji dla których występuje proporcjonalność dawki do efektu, pozwala to na interpolację wyników

• określona wrażliwość – szczególnie cenione są dane o toksycznym działaniu substancji, które są reprezentatywne dla danego gatunku lub nawet całej gromady

• rodzime występowanie – pozwala na ominięcie bariery introdukcji i problemów w hodowli

• ważność ekologiczna – pozwala na określenie tendencji środowiska lub oceny ryzyka

• wiedza o interakcjach między- i wewnątrzgatunkowych – dzięki temu można ominąć zafałszowanie wyników ze względu na trudne do przewidzenia oddziaływania

Komercjalizacja testów

• aby dany test miał predyspozycje do komercjalizacji musi być powtarzalny, tani, prosty w użyciu, podatny na rozbudowę i nie może wzbudzać wątpliwości etycznych

• prekursorem i osobą żywo zainteresowaną dalszą komercjalizacją nowych testów jest prof. Persun z University of Gent, działa w oparciu o założoną przez siebie spółkę spin-off

• tendencją na rynku biotestów jest możliwość dokładania nowych funkcji przy zachowaniu kosztów, tj. ma na to wpływ wiedza o możliwości przekładania wyników na wartość, a nie zastosowanie nowych/dodatkowych odczynników

Polskie normy wykorzystania organizmów

• kiełż – Gammarus varsoviensis

• gupik – Lebides reticulatus

• rozwielitka – Daphnia magna

• glon – Chlorella

Normy czasu trwania i efektu biotestów

• ryby - 4 dni - śmierć (Salmo – pstrąg)

• bezkręgowce - 24-48 h - brak ruchu (Daphnia – rozwielitka)

• glony - 4 dni - tempo wzrostu (Chlorella)

• bakterie - 30 min - zapotrzebowanie na tlen (Pseudomonas putida)

• rośliny wyższe - 4 dni (v 24h) - wzrost (Lemna)

(od tego momentu zaczyna się treść nieobowiązkowa)

Roślinne testy toksyczności

• przykładem może być arcyciekawy (!) mikrobiotest w oparciu o Spirodella oligorhhiza z rodziny Lemnaceae opracowany na University of Łódź

• gatunek ten wykorzystywany jest monitorowania wód śródlądowych na obecność hepatotoksyn pochodzenia sinicowego

Rodzaje badań testu Spirodella

• terenowe – ocena zmiany stężeń MC-LR i aktywności fosfatazy zasadowej

• laboratoryjne – opracowanie wyników

Parametry możliwe do oznaczenia

• biomasa i skład jakościowy

• stężenie MC-LR i aktywność fosfatazy alkalicznej

• temperatura wody

• przezroczystość (klarowność)

• pH

• stężenie całkowite fosforu

Cele badań za pomocą testu

• dynamika zmian markerów u bioindykatorów w obecności wody z MC-LR

  • fotosynteza

  • fluorescencja chlorofilu (test JIP – in vitro)

  • stężenie chlorofilu

  • aktywność katalazy, dehydrogenazy, fosfatazy

  • zawartość DNA

  • integralność membran cytoplazmatycznych (wyciek elektronowy)

• porównanie zmian zależności w odpowiedzi na stężenie MC-LR

Zalety wykorzystania Spirodella

• ze względu na wzrost zainteresowania gatunkami z grupy Lemnaceae

• roślina pływa po powierzchni wody, ze względu na występowanie w okolicy przejścia faz może indykować zarówno związki hydrofilowe jak i hydrofobowe

• cechuje się wysoką wrażliwością względem innych gatunków z tej rodziny

• daje typową reakcję fizjologiczną, reprodukcyjną, genetyczną i morfologiczną

• pełni ważną rolę w bioremediacji zbiorników wodnych

• gatunek ten nie jest opracowany pod kątem indykacji w literaturze

• metodyka oznaczeń parametrów nie jest przystosowana dla tej grupy systematycznej

Metodyka badań

• hodowla prowadzona jest w sterylnym szkle laboratoryjnym

• przewidziane są trzy rodzaje dodatków do hodowli

  • standard substancji (kontrola +)

  • woda (kontrola -)

  • próba badana (próbka)

• metodyka poszczególnych analiz musiała być walidowana do gatunku

• enzymy badane były standardowymi metodami enzymologii

• stężenie toksyn mierzono za pomocą HPLC

Uzyskane wyniki

• tylko dawka minimalna określona przez WHO nie była szkodliwa dla roślin

• każde stężenie powodowało zmiany w organizmie

• zawartość chlorofilu praktycznie nie uległa zmianie

• test JIP – im więcej toksyny tym więcej pozytywnie zabarwionych dołków na płytce 96

• katalaza nie wykazywała zależności proporcjonalnej przez co nie może być wskaźnikiem

• zmiany aktywności dehydrogenazy i fosfatazy były liniowe – dobry marker

• MC-LR wykazywała stosunkowo silny wpływ na wyciek elektronów

• zawartość DNA była bardzo zmienna

Zalety testu

• prosty

• ekonomiczny

• wrażliwy

• szybki

• rozwojowy (możliwość dodania nowych parametrów)

Wykorzystanie

• oznaczanie nowych substancji (np.: hepatotoksyny)

• można go wykorzystać zarówno w kolbkach jak i szalkach, wyniki są porównywalne

• można wprowadzać modyfikacje np.: w oznaczaniu frondów

Obecnie dostępne testy toksyczności

• mikroby – 10 testów

• rośliny – 6 testów

• bezkręgowce – 25 testów

• ryby – 3 testy