41 Które substancje przechodzą przez błonę zgodnie z prawem Ficka, czyli dyfuzja prosta.
I prawo Ficka: dn/dt = -DAdc/dx
dn – liczba cząsteczek dyfundujących w czasie dt na odległość dx przez powierzchnię A przy różnicy stężeń dc.
D = współczynnik dyfuzji.
dn/dt oznaczane jest często jako prędkość V lub przepływ J.
Czyli strumień przepływającej substancji (ilość moli przepływająca przez daną powierzchnię w jednostce czasu [mol/(m2 s)]) równy jest współczynnikowi dyfuzji razy zmiana stężenia na odległości.
II prawo Ficka – szybkość dyfuzji gazów przez błonę przepuszczalną przy określonym ciśnieniu jest proporcjonalna do rozpuszczalności gazu w cieczy i odwrotnie proporcjonalna do pierwiastka kwadratowego z ciężaru cząsteczkowego danego gazu
Zatem, że szybkość dyfuzji prostej jest wprost proporcjonalna od różnicy stężeń po dwóch stronach błony.
Im mniejsza i bardziej hydrofobowa cząstka, tym szybciej przenika przez błonę.
Jeśli popatrzymy na wzór na współczynnik dyfuzji (ze wzoru Einsteina-Smoluchowskiego) to: D= RT/ NAf, NA to liczba Avogadry, f to oczywiście współczynnik tarcia f=6η0 πr gdzie 6η0 π to współczynnik lepkości
Można więc powiedzieć, że na szybkość dyfuzji wpływa:
gradient stężenia
powierzchnia zetknięcia
wielkość i kształt cząsteczki
lepkość ośrodka
temperatura
hydrofobowość bo błona ma takie, a nie inne właściwości)
ciśnienia
masy cząsteczki (patrzcie prawo II)
o rozpuszczalności nie wiem czy pisać bo jak jest w komórce to zawsze musi być rozpuszczone
Wynika z tego , że najlepiej przez błonę przenikają niepolarne cząsteczki gazów: N2, CO2, O2. Również małe, niepolarne lub umiarkowanie polarne cząsteczki organiczne, jak benzen czy etanol mogą przejść przez błonę. Nieco gorzej jest z małymi i polarnymi jak woda czy mocznik, które przenikają przez błonę w bardzo ograniczonym zakresie.
42 Jakimi parametrami można opisać kinetykę dyfuzji ułatwionej?
W kinetyce dyfuzji ułatwionej, która ma hiperboliczną postać analogiczną do kinetyki enzymatycznej Michaelisa-Menten, jest kilka parametrów istotnych dla szybkości transportu. Po pierwsze jest to szybkość maksymalna Vmax, zależna od ilości kanału/transportera w błonie i szybkości przepływu/zmian konformacyjnych. Po drugie jest to stała wiązania substratu Km, równa stężeniu substratu przy prędkości będącej połową maksymalnej. Jest ona wyrazem powinowactwa substancji transportowanej do nośnika (im mniejsza, tym większe powinowactwo). Jeśli mamy transporter o niepełnej specyficzności, porównanie Km dla różnych substratów pozwala określić względną specyficzność w stosunku do nich. Zmienną w równaniu kinetyki dyfuzji ułatwionej jest różnica stężeń (lub potencjałów elektrochemicznych) po obu stronach błony.
Vtr = Vmax / (1+Km/Cout)
• Km - rowna stężeniu substratu przy połowie prędkości max
• Vmax - zależy od ilości transporterow i szybkości ich transportu,
• Vo- szybkość przenoszenia cząsteczek przez transporter
• Cout - stężenie na zewnątrz
43 Przechodzenie wody przez błony.
Szybkie przechodzenie wody przez błony jest niezwykle istotne dla komórki. Komórka cały czas wydziela i zużywa wodę w reakcjach fizjologicznych. Poza tym wydziela i pobiera jony. Wszystko to prowadzi do niewielkich wahań w osmolarności komórki i naraża ją na liże osmotyczną nawet w teoretycznie izoosmotycznym środowisku. W pewnym stopniu radzą sobie z tym problemem transportery jonów (np. pompa sodowo/potasowa, która netto wypompowuje jeden jon jednowartościowy na zewnątrz). Jednak da zapewnienia idealnej (przynajmniej dopóki coś się nie popsuje) równowagi konieczna jest też szybka wymiana wody przez błonę.
Problem w tym, że woda, jak już wspomniano, dyfunduje przez błonę tylko w organicznym zakresie. Dlatego komórki zwierząt zawierają w swojej błonie specyficzne kanały wodne – akwaporyny. Akwaporyna to homotetreamer podjednostek o masie 28kDa. Każda podjednostka ma 6 transmembranowych helis, które tworzą por długi na 2nm i szeroki na 0,28nm (tzn. por jest w środku każdej podjednostki, czyli jedna cząsteczka akwaporyny ma 4 pory). Helisy eksponują hydrofobowe reszty do błony, a hydrofilowe do środka.
Specyficzność kanału jest zapewniana nie tylko przez wielkość, nieco tylko większą od średnicy cząsteczki wody, ale też przez kilka konserwatywnych reszt R, H i N w porach, które tworzą w porze kilka miejsc wiązania wody oddziaływaniami wodorowymi. Przez por przechodzi kilka cząsteczek wody naraz, każda po kolei zajmuje następne miejsce wiązania. Woda może też przenikać przez błonę za pomocą dużych porów (np. jądrowe, połączenia szczelinowe, bakteryjne poryny), albo w postaci związanej z jonami (otoczka hydratacyjna jonów) przez kanały jonowe.
44. Metoda „patch-clamp”
Technika laboratoryjna w elektrofizjologii umożliwiająca badania pojedynczych i mnogich kanałów jonowych w komórce. Technika ta może być stosowana do różnego rodzaju komórek, zwłaszcza przydatna jest do badania komórek pobudliwych takich jak neurony, kardiomiocyty, włókna mięśniowe i komórki beta trzustki. Może być również stosowana do badań nad kanałami jonowymi bakterii w specjalnie przygotowanych ogromnych sferoplastach.
Technika patch-clamp jest udoskonaleniem Voltage clamp.
Technika umożliwiająca analizy w czasie realnym pojedynczego kanału jonowego
Bada krótkotrwałe zmiany w natężeniu elektrycznym w poprzek błony
Podstawowe eksperymentalne rozwiązanie dla pomiarów przepływu prądu przez pojedynczych kanałów jonowych w błonie komórkowej żyjących komórek.
Elektroda patch (szklana mikropipeta nadająca stałe napięcie o średnicy otworu ok. 0,5-1μm), wypełniona roztworem soli przewodzącej napięcie elektryczne, jest stosowana wraz z lekkim ssaniem błony plazmatycznej. Końcówka mikropipety dokładnie przylega do regionu zawierającego jeden lub kilka kanałów jonowych. Druga elektroda jest wprowadzana przez błonę do cytosolu. Urządzenie do rejestracji, podłączone do elektrody i mikropipety, mierzy natężenie przepływu jedynie przez kanały w płacie błony aby utrzymać odpowiedni potencjał wynikający z przepływu elektronów na elektrodzie cytosolowej. Na podstawie potencjału obliczana jest ilość jonów przechodzących przez kanał.
Odpowiednie konfiguracje oddzielonych patch’ów pozwala na badanie:
wpływu na kanały różnego stężenia jonów i substancji rozpuszczonych takich jak zewnątrzkomórkowe hormony i wewnątrzkomórkowe przekaźniki drugorzędowe (np. cAMP).
Specyficzności kanałów w stosunku do danych jonów
Białek uznanych za potencjalne kanały jonowe na podstawie ich sekwencji
Regulacyjne funkcji jonów Ca2+
Jony wapnia są jednym z najważniejszych cząsteczek sygnalizacyjnych drugiego rzędu. W normalnych warunkach cytozolowe stężenie wapnia jest bardzo niskie, około 0,2μM i jest utrzymywane przez Ca2+-ATP-azy, które wypompowują wapń do ER albo na zewnątrz. W odpowiedzi na specyficzne sygnały ze środowiska komórki otwierają się kanały dla jonów wapnia i jony te napływają z ER lub środowiska zewnętrznego, a ich stężenie w cytozolu może wzrosnąć 10 do 100 razy (przykłady sygnałów: aktywacja receptorów sprzężonych z białkiem G przez jakieś chemiczne ligandy, co aktywuje fosfolipazę C, która powoduje pojawienie się trójfosforanu inozytolu w cytozolu, który aktywuje kanały wypuszczające wapń z ER; napięcie, tak jak w synapsie; wzrost stężenia glukozy w komórkach wydzielających insulinę, który w sumie prowadzi do depolaryzacji błony i otwarcia kanałów bramkowanych napięciem). Wzrost cytozolowego stężenia wapnia przynosi olbrzymie efekty. Wapń wiąże się i bezpośrednio uczestniczy w aktywacji wielu białek ważnych dla przekazywania sygnałów np. PKC (protein kinase C, uczestniczy w kontroli ekspresji genów) oraz wywołujących konkretne efekty w wyspecjalizowanych komórkach np. synaptotagmina w synapsach, czy analogicznego białka w komórkach β trzustki (bo wydzielanie insuliny jest podobne do wydzielania neurotransmitera).
Jony wapnia mogą działać też pośrednio wiążąc białka zawierające motyw „EF hand”. Sztandarowym przykładem jest tutaj kalmodulina. Kalomodulina wiąże 4 jony wapnia w kooperacyjny sposób, czyli niewielki wzrost w ich stężeniu już ją aktywuje, bo każdy następny wiąże się silniej. Aktywna kalmodulina oddziałuje z wieloma białkami i przynosi różnorodne efekty np. wiążąc się do „kinazy lekkiego łańcucha miozyny” (nie wiem jak to się ładnie nazywa po polsku, chodzi o białko które fosforyluje lekki łańcuch miozyny) prowadzi do skurczu mięśnia; wiążąc cAMP fosfodiesterazę wygasza sygnalizację przez cAMP; kompleks Ca2+/kolmodulina może aktywować wiele kinaz/fosfataz regulujących aktywność czynników transkrypcyjnych np. aktywowana kalcyneuryna defosforyluje NFAT (nuclear factor of activated T cells), który aktywuję ekspresję genów niezbęddzną do aktywacji limfocytów T.
Charakterystyczne dla sygnałów przekazywanych przez jony wapnia jest ich błyskawiczne pojawienie się w odpowiedzi na bodziec i równie błyskawiczne wygaszenie sygnału, dzięki pracy wapniowych pomp ATP.
46. Co można powiedzieć o spoczynkowych wartościach stężeń jonow Ca2+
w poszczegolnych przedziałach komorkowych. Jak są one regulowane.
Przestrzeń międzykomorkowa (osocze), lumen ER – stężenie Ca2+ wynosi
1mM. W cytosolu w fazie spoczynkowej – 10-7 M. Stężeni powyżej 10-5 M w cytosolu jest niebezpieczne dla komorki, dlatego też istnieje kilka elementow regulacji stężenia Ca2+ w komorce które obniżają stężenie tych jonow:
- ATPaza Ca2+ błony plazmatycznej
-wymiennik Na+/Ca2+ błony plazmatycznej
-ATPaza Ca2+ retikulum endoplazmatycznego/sarkoplazmatycznego
-napędzana przez siłę protonomotoryczną pompa wewnętrznej błony
mitochondrialnej o niskim powinowactwie i dużej pojemności
47 . Metody analizy stężenia Ca2+ w komórce
Mikroskopia fluorescencyjna może lokalizować i określać i określać ilościowo specyficzne cząsteczki w ustalonych i żywych komórkach.
Określenie wewnątrzkomórkowego poziomu Ca2+ i H+ z wrażliwymi na jony barwnikami fluorescencyjnymi: fluorochromy, których fluorescencja zależy od stężenia Ca2+ i H+ mają udowodnioną użyteczność w pomiarach stężenia tych jonów w żywych komórkach. Wewnątrzkomórkowe stężenie Ca2+ i H+ ma wyraźny wpływ na wiele procesów. Np. wiele hormonów lub innych bodźców powoduje wzrost cytosolowego Ca2+ od początkowego poziomu ok. 10- do 10-6M, co indukuje wiele komórkowych odpowiedzi włącznie z skurczem mięśni.
Barwnik fluorescencyjny fura-2, wrażliwy na Ca2+ , zawiera 5 karboksylowych grup, które tworzą eterowe połączenia z etanolem. Skutkuje to litofilnością fura-2 i umożliwia to rozprzestrzenianie się z medium przez błony do komórki. W cytozolu, esterazy hydrolizują ester fura-2, otrzymując fura-2, którego wolne grupy karboksylowe czynią cząsteczki nielipofilnymi, a więc nie mogącymi przekroczyć błony komórkowej i pozostają w cytoplazmie. Wewnątrz komórek każda cząsteczka fura-2 może wiązać pojedyncze jony Ca2+ , ale nie inne komórkowe kationy. Wiązanie to, które jest proporcjonalne do cytosolowego stężenia Ca2+ w pewnym zakresie, zwiększa fluorescencję fura-2 w jednej określonej długości fali (340). Przy drugiej długości fali (380nm), fluorescencja fura-2 jest taka sama niezależnie czy jony wapnia są związane i stanowi pomiar całej zawartości fura-2 w regionie komórki. Badając komórki w sposób ciągły w mikroskopie fluorescencyjnym i mierząc szybkie zmiany w stosunku fluorescencji fura-2 w tych dwóch długościach fal można określić ilościowo szybkie zmiany we frakcji fura-2 związanej z jonami Ca2+ , tym samym stężenie Ca2+ w cytosolu.
48. Systemy transportowe kontrolujące stężenie Ca2+ w komórce.
Źródła jonów Ca2+ w organizmie (dla komórki)
Środowisko zewnętrzne
Siateczka śródplazmatyczna
Białka zaangażowane w utrzymywanie odpowiedniego stężenia wapnia w cytoplazmie:
PMCA – usuwa Ca2+ z cytoplazmy na zewnątrz
NCX – usuwanie Ca2+ z cytoplazmy na zewnątrz
SERCA – usuwa do ER
DHPR – napływ Ca2+ do cytoplazmy z zewnątrz bramkowane napięciem
RyR – napływ Ca2+ do cytoplazmy z ER (ang. ryanodine receptor)
Usuwanie nadmiaru Ca2+:
Poza komórkę:
Pompa aktywowana przez ATPazę Ca2+ (PMCA)
Wymiennk Na+ -Ca2+ (NCX)
Do siateczki śródplazmatycznej (SERCA)
Pewne Ca2+ ATPazy pompują jony wapnia na zewnątrz cytozolu, inne pompują Ca2+ z cytozolu do retikulum endoplazmatycznego lub do wyspecjalizowanego ER – sarkoplazmatycznego retikulum w komórkach mięśniowych.
Część Ca2+ w cytosolu jest związana z ujemnie naładowanymi grupami ATP i innych cząsteczek, ale stężenie wolnego Ca2+ jest generalnie mniejsze niż 0,2μM (2*10-7), tysiąc krotnie niższe niż we krwi. Komórki roślinne i wiele mikroorganizmów utrzymuje podobne cytozolowe niskie stężenie Ca2+, nawet jeśli komórka jest hodowana w bardzo rozcieńczonych roztworach soli. Stężenie wolnego Ca2+ ma wpływ na szlaki sygnałowe czy skórcz mięśni.
49 . Fagocytoza i jej znaczenie
Fagocytoza to nieselektywny proces pochłaniania drobnoustrojów i innych dużych nierozpuszczalnych cząstek przez komórki. Polega ona na tworzeniu się dużych wgłębień błony komórkowej, które otaczają pochłanianą cząstkę i zamykają ją w pęcherzyk zwany fagosomem. Fagosom łączy się następnie z lizosomem, który zapewnia enzymy potrzebne do strawienia sfagocytnowanych cząstek. Fagocytoza ma spore znaczenie w przyrodzie. Po pierwsze w ten sposób odżywiają się drapieżne pierwotniaki (np. orzęski zjadające pantofelki na kartach książek do biologii z podstawówki). Zdolność do fagocytozy posiadają też makrofagi i granulocyty obojętnochłonne i jest ona najważniejszym mechanizmem obrony organizmu ssaka przed zakażeniem drobnoustrojami. Sfagocytowane patogeny są następnie zabijane enzymami lizosomalnymi (to tak jakby wrzucać wrogów do kwasu, albo połykać żywcem i trawić w żołądku,). Komórki żerne rozpoznają cząstki do sfagocytowania dzięki receptorom dla antygenów bakteryjnych lub przyczepionych do bakterii białek układu dopełniacza CR1 i CR3 (odporność wrodzona) albo też dzięki receptorom dla przeciwciał (odporność nabyta). Oplaszczenie patogenów czynnikami pobudzającymi fagocytozę to opsonizacja, a te czynniki (czyli głównie przeciwciała albo białka układu dopełniacza) to opsoniny. Fagocytoza przez białe krwinki indukowana opsonizacją do immunofagocytoza.
50 Endocytoza za pośrednictwem receptorów
Endocytoza za pośrednictwem receptorów.
Endocytoza za pośrednictwem receptorów to proces w którym ligandy ze środowiska komórki wiążą się ze specyficznymi receptorami na błonie, a następnie region błony zawierający receptory z ligandami tworzy inwaginację(^^) i w końcu pęcherzyk transportowy średnicy 0,01-0,5μm. Tworzenie pęcherzyka odbywa się w regionach błony wzbogaconych w klatrynę i AP2 („clathrin-AP2 pits”, ok. 2% pow. błony) - białka opłaszczające pęcherzyki. Polimeryzacja białek płaszcza na membranie wskutek działalności GTPaz powoduje zakrzywienie błony umożliwiające odpączkowanie pęcherzyka. Oprócz tego różne białka płaszcza rekrutują do tworzącego się pęcherzyka różne receptory z ligandami (np. Klatryna i AP2 te mające iść z zewnątrz do endosomów, COPI idące z ER do Golgiego itd.). Receptory poruszają się swobodnie w płaszczyźnie błony, a po związaniu liganda kierują w stronę „pitów” (jestem prawie przekonany, że jest na to jakaś polska nazwa, ale nie chce mi się szukać). Raczej nie jest to aktywne przemieszczanie, ale zmiany konformacyjne po związaniu liganda powodują, że receptor nie może uwolnić się z pitu po tym jak trafi tam przypadkowo. Dodatkowo, receptory posiadają w cytozolowej domenie fragmenty rozpoznawcze, które wykrywane są przez białka zasocjowane z płaszczem. Dla endocytozy jest to NPXY (skróty jednoliterowe), który rozpoznawany jest przez AP2. Niektóre receptory są związane z pitami nawet bez ligandów. W jednym picie może występować kilka typów receptorów. Po utworzeniu pęcherzyka klatryna i AP2 oddysocjowują i wracają do błony. Pęcherzyk, zwany wczesnym endosomem wędruje w głąb cytoplazmy, łączy się z innymi, a przy okazji jego pH zmienia się na kwaśne, a nazwa na późny endosom. Kwaśne pH powoduje dysocjację ligandów, a błony z receptorami odpęcherzykowują wracając do błony komórkowej (recykling receptorów). Późny endosom łączy się z lizosomem i zawartość zostaje strawiona
51. . Białka (i inne substancje) wydzielane w procesach egzocytozy konstytutywnej i regulowanej
Egzocytoza - proces uwalniania z komórki eukariotycznej do przestrzeni poza komórkowej różnego typu makrocząsteczek, m.in. enzymów trawiennych, białek osocza, hormonów, neurotransmiterów, toksyn, wirusów, dla których błona komórkowa jest nieprzepuszczalna. Egzocytoza odgrywa istotną rolę w wielu ważnych procesach zachodzących w komórkach np. neurosekrecja, neurotransmisja, reakcja akrosomalna, krzepnięcie krwi, synteza ściany komórkowej w komórkach roślinnych, wydalanie zbędnych produktów przemiany materii (wodniczka tętniąca), usuwanie niestrawionych resztek pokarmu (wodniczka pokarmowa). Transport i usuwanie na zewnątrz komórki związków chemicznych i cząstek zawartych w pęcherzykach otoczonych błoną cytoplazmatyczną odbywa się w następujący sposób. Błona pęcherzyka po zetknięciu z błoną komórki łączy się z nią, a zawartość pęcherzyka wydostaje się na zewnątrz komórki. Połączenie pęcherzyka z błoną komórkową umożliwiają specjalne białka łączące, tzw. białka fuzjogenne, wbudowane w błonę pęcherzyka.
Kilka minut po syntezie białka na szorstkim ER większość opuszcza organelle w małych błonowych pęcherzykach transportowych. Pęcherzyki odpączkowując od szorstkiego ER nie są opłaszczone rybosomami, zabierają białka do innej organelli ograniczonej błoną – AG (od cis części do trans). Każdy region AG ma inne enzymy modyfikujące białko wydalane a inaczej błonowe.
Pierwszy rodzaj pęcherzyków, które z trans AG od razu przemieszczają się i ulegają fuzji z błoną plazmatyczną egzocytoza konstytutywna (ciągła). Transport:
kolagen z fibroblastów
białka surowicy (osocza) z hepatocytów
przeciwciała z aktywowanych limfocytów B
Drugi rodzaj pęcherzyków, które są przechowywane do czasu sygnału powodującego uwolnienie w błonie plazmatycznej (opłaszczenie latryną, wzrost stężenia wapnia wewnątrzkomórkowego) egzocytoza regulowana:
hormony peptydowe z komórek endokrynnych (insulina, glukagon, ACTH)
prekursory enzymów trawiennych z komórek pęcherzykowych trzustki
białka mleka z gruczołu mlecznego
neurotransmitery (glutaminian, GABA, acetylocholina, noradrenalina)*
Trzeci typ pęcherzyków odpączkowujących z trans AG i kierowany do lizosomów (organelli odpowiedzialnych za degradację makromolekuł
52 Czynniki odpowiadające za swoistość rozpoznania błony docelowej przez pęcherzyki oraz fuzje błon.
Głównymi czynnikami odpowiadającymi za rozpoznanie błony docelowej przez pęcherzyk i fuzje z nią są białka z rodziny Rab i białka z rodziny SNARE. Kiedy pęcherzyki odpączkują i płaszcz ulegnie dysocjacji ze specyficznymi białkami na powierzchni pęcherzyka łączą się białka Rab, których jest wiele rodzajów i są specyficzne dla danego typu pęcherzyków. Aby mogło się związać (miało odp. konformację), białko Rab, które jest GTP-azą, musi być związane z GTP. Następnie, aktywne białka Rab łączą się ze specyficznym dla siebie białkiem z rodziny efektorów Rab dokując pęcherzyk w błonie docelowej. GTP ulega hydrolizie i Rab uwalniają się do cytozolu, gotowe do ponowienia cyklu z innym pęcherzykiem. Fuzja zadokowanych pęcherzyków z błoną odbywa się dzięki (integralnym lub zakotwiczonym lipidem) białkom SNARE. Domeny cytozolowe V-SNARE (vesicle) obecne na powierzchni pęcherzyka łączą się z odpowiednimi domenami t-SNARE (traget) tworząc strukturę nawiniętych na siebie czterech helis alfa. Utworzenie tej struktury na tyle zbliża do siebie obie błony, że może zajść fuzja
53 Hipoteza/teoria SNARE
Zgodnie z tą teorią, fuzja błon przedstawia się następująco (przykład dla najlepiej poznanego łączenia się pęcherzyków egzocytarnych z błona komórkową):
na początku z pomocą białek Rab i Rab efektorów pęcherzyk dokuje w odpowiedniej błonie docelowej
potem specyficzne dla pęcherzyka białka v-SNARE, w tym przypadku białko VAMP, rozpoznają specyficzne dla błony docelowej białka t-SNARE, w tym przypadku syntaksyne i SNAP-25
cytozolowe domeny wszystkich tych 3 białek zawierają powtórzenia heptadowe (7 aminokwasów, 7! NIE 8 jak w starych opracowaniach!), które pozwalają utworzyć im cztery alfa-helisy zawinięte wokół siebie – jedna z VAMP, jedna z syntaksyny i dwie z SNAP-25. ( w ogóle powtórzenia heptadowe są charakterystyczne dla struktur coiled-coil). Helisy zawijają się wokół siebie tak mocno, że przyciągają pęcherzyk do błony na tyle blisko, że może nastąpić fuzja. Helisy te oddziałują ze sobą z taką siłą, ponieważ stworzenie nawiniętej coiled-coil powoduje schowanie aminokwasów hydrofobowych w środku między helisami i umieszczenie przeciwnie naładowanych reszt blisko siebie. Działają tutaj więc zarówno oddziaływania hydrofobowe jak i mostki solne.
No i teraz pojawia się problem, bo SNARE wiążą się tak mocno, że nie chcą puścić po fuzji, a muszą być użyte w następnych pęcherzykach. Odpowiedzią na ten problem jest białko NSF, które z pomocą innego białka – α-SNAP, wiąże się do kompleksów v,t-SNARE i dzięki energii z hydrolizy ATP uwalnia je do siebie. Jeśli zmutujemy albo zinhibujemy NSF lub α-SNAP to SNARE się wyczerpią i nowe pęcherzyki będą się akumulować przy błonach nie ulegając fuzji.
U drożdży zidentyfikowano ponad 20 par v,t-SNARE. Każda odznacza się ogromną specyficznością. Ponadto w niektórych przypadkach 4 helisy w połączeniu pochodzą z 4 rożnych białek, jest wtedy jeden v-SNARE i 3 t-SNARE.
Uwalnianie neurotransmiterów w złączu synaptycznym
Ten proces to szczególny przypadek egzocytozy regulowanej. W stanie spoczynku neurotransmitery magazynowane są w pęcherzykach zwanych pęcherzykami synaptycznymi (odkrywcze), które mają ,40-50nm średnicy (czyli 0,4-0,5μm), są więc w górnej granicy wielkości pęcherzyków wydzielniczych. Wydzielanie neurotransmittera musi być bardzo szybkie, dlatego różni się nieco od normalnej egzocytozy i zachodzi następująco:
w stanie spoczynku pęcherzyki synaptyczne nie pływają gdzieś przy Golgim, ale są utrzymywane w pobliżu błony presynaptycznej przy pomocy włókien cytoszkieletu. Włókna te, oprócz normalnych składników (chyba aktyny, ale mogą to być filamenty pośrednie, nie wiem, nie piszą w lodiszu) zawierają charakterystyczną tylko dla synaps synapsynę. Również błona pęcherzyków posiada zakotwiczoną synapsynę, która łączy pęcherzyki z cytoszkieletem, a także ze specjalnymi synapsynowymi filamentami wyrastającymi z błony presynaptycznej. Białkiem Rab charakterystycznym dla pęcherzyków synaptycznych jest Rab3A i ono tez bierze udział w wydzielaniu neurotransmitera.
Dojście potencjału czynnościowego do synapsy powoduje otwarcie kanałów wapniowych bramkowanych napięciem i napływ jonów Ca2+ do cytozolu. Ich stężenie zwiększa się 10 do 1000 razy. Błony pęcherzyków synaptycznych zawierają białko zwane synaptotagminą, która może wiązać jony wapnia. Związanie wapnia przez synaptotagminę powoduje błyskawiczne dokowanie pęcherzyków z błoną, powstawanie kompleksów v,t-SNARE i fuzję, a co za tym idzie uwolnienie neurotransmitera. Mechanizm tego jest nieznany, ale jest kilka możliwości. a) aktywowana synaptotagmina wiąże pęcherzyki do błony, b)aktywowana synaptotagmina katalizuje reakcje SNAREów, c)aktywowana synaptotagmina przestaje blokować t-SNARE na błonie (a konkretnie dwa z nich w kompleksie: neureksynę z syntaksyną)
Po przekazaniu sygnału z błony presynaptycznej odpączkowują dzięki klatrynie pęcherzyki, które następnie są „ładowane” neurotransmiterem
55 Transcytoza – przykłady procesów
Transcytoza to zjawisko transportowania danej substancji z jednego bieguna komórki na drugi poprzez cytoplazmę. Z reguły substancja jest pobierana przy udziale receptora na jednym biegunie i transportowana w pęcherzykach wewnątrzcytoplazmatycznych. Po dotarciu pęcherzyka na drugi biegun komórki, błona pęcherzyka zlewa się z błoną komórkową, a substancja uwalnia się do otoczenia. Przykładem może być transport immunoglobulin A przez komórki nabłonkowe jelita.
Przechodzenie immunoglobulin z mleka matki przez nabłonek jelit. W ruchu pośredniczą receptory Fc wiążące przeciwciała w kwaśnym pH przewodu pokarmowego i uwalniające w neutralnym pH po bazalnej stronie (różnice pH zapewniają jednokierunkowość transportu)
Podobny sposób przenoszenia krążących we krwi immunoglobulin matki w komórkach pęcherzyka żółciowego płodu
W hepatocytach (bazolateralna część łaczy się z krwią, a apikalna przy kanalikach sekrecji żółci) nowo wytworzone białka transportowane z trans AG do części bazolateralnej – egzocytoza do błony; endocytoza obu typów białek:
bazolateralne białka zapracane do błony bazolateralnej
apikalne białka ulegają transcytozie
Może to stanowić mechanizm „fail-safe” sortowania – źle sortowane apikalne białka endocytowane do dobrej błony.
**W odróżnieniu od pęcherzyków opłaszczonych klatryną oraz COPI I COPII, kaweole są inwaginowane i pakowane białkami przez właściwą kompozycję lipidów błony kaweoli (a nie przez opłaszczenie białkami). Kaweole mogą dostarczyć swoją zawartość do kompartymentów podobnych do endosomów lub do błony plazmatycznej po przeciwnej stronie komórki polarnej. Niektóre receptory na powierzchni spolaryzowanych komórek nabłonka przenoszą specyficzne makromolekuły z zewnętrznej przestrzeni do innej przez transcytozę (zendocytowane i idą drogą od endosomu do różnych domen).
56 . Monomeryczne GTPazy. Białka niezbędne do ich funkcji.
Druga główna klasa GTPaz to monomery. Do chwili obecnej zidentyfikowano pięć podrodzin:
* Ras – zaangażowana w procesy wzrostu i różnicowania
* Rho – związana z aktywnością integryn i tworzeniem cytoszkieletu aktynowego
* Rab – zaangażowana w transport pęcherzykowy wewnątrz komórki
* ARF – związana z tworzeniem pęcherzyków transportujących
* Ran – zaangażowana w transport białek jądrowych
Każda podrodzina GTPaz obejmuje wielu przedstawicieli. Niektóre z najbardziej godnych uwagi Ran i ARF – cząsteczki znalezione w różnych przedziałach subkomórkowych. Monomeryczne GTPazy funkcjonują także jako przełączniki cząsteczkowe; zmieniają one swoją konformację w zależności od tego czy są związane z GDP, czy z GTP (włączone ze związanym GTP i wyłączone ze związanym GDP). Monomeryczne GTP-azy wymagają do swojej aktywności innych, rozpuszczalnych w cytozolu białek. Białka pomocnicze: białko aktywujące GTPazę (GAP, GTPase Activating Protein) i białko uwalniające GTP (GRP, GTP Relasing Protein). Forma monomerycznych GTP-az, związana z GDP jest uwalniana od niego przez GEF (guanine nucleotide – exchange factor). Ponieważ GTP jest w komórce więcej niż GDP to wolna GTP-aza spontanicznie wiąże GTP. w przeciwieństwie do trimerycznych białek G, monomeryczne GTP-azy hydrolizują GTP bardzo wolno, czyli są długo aktywne. W praktyce ich sygnalizacja jest wygaszana przez białka GAP (GTP-ase activating protein), które zwiększają szybkość katalizowanej hydrolizy GTP ponad 100-krotnie. Czas takiego sygnału wynosi średnio ok. 1 min. Warto wspomnieć, iż domenę katalityczną tworzą razem reszty aminokwasowe z GTP-azy i GAP.
57 Monomeryczne GTPazy zaangażowane w transport pęcherzykowy.
W transport pęcherzykowy zaangażowane są głównie GTP-azy: ARF, Sar1 i Rab. Wszystkie są rozpuszczalne w cytozolu. ARF i Sar1 odpowiadają za tworzenie się pęcherzyków opłaszczonych odpowiednio klatryną i COPI oraz COPII. W stanie „włączonym” ze związanym GTP powodują składanie się płaszczy i odpączkowywnie pęcherzyków, a w stanie „wyłączonym” - dysocjację płaszczy z pęcherzyków. W stanie nieaktywnym białka te są słabo przyciągane do odpowiednich błon dzięki swoim hydrofobowym N-końcom (ARF posiada tam kotwicę mirystynową). Obecne w błonach integralne GEF powodują aktywacje ARF i Sar1, które silniej eksponują swoje N-końce, mocniej wiążąc się z błoną i inicjując składanie płaszcza. Po oddysocjowaniu pęcherzyka następuje hydroliza GTP do GDP i dysocjacja płaszcza. Białka Rab działają w pęcherzykach transporujących w następujący sposób. Pęcherzyk utworzony z błony donorowej ma v-SNARE i Rab w konfiguracji z GTP. Kiedy pęcherzyk przyłącza się do prawidłowego v-SNARE , to Rab-GTP hydrolizuje. Inicjuje to fuzję pęcherzyków z błonami akceptorowymi. Rab, w konfiguracji z GTP, dysocjuje z błony i w następnym cyklu powraca do błony donorowej, gdzie GAP odtwarza Rab przez katalizowanie wiązań GTP. Proces ten powoduje wiązanie Rab z błoną przez jej część lipidową i umożliwia uczestniczenie w innych zjawiskach adresowania. Interesujące jest to, że w każdej błonie subkomórkowej istnieją specyficzne białka Rab; ta cecha pomaga zachować specyficzność docelową.
58 Endocytoza za pośrednictwem receptorów – elementy regulujące ten proces w komórce
Endocytoza za pośrednictwem receptorów.
Endocytoza za pośrednictwem receptorów to proces w którym ligandy ze środowiska komórki wiążą się ze specyficznymi receptorami na błonie, a następnie region błony zawierający receptory z ligandami tworzy inwaginację(^^) i w końcu pęcherzyk transportowy średnicy 0,01-0,5μm. Tworzenie pęcherzyka odbywa się w regionach błony wzbogaconych w klatrynę i AP2 („clathrin-AP2 pits”, ok. 2% pow. błony) - białka opłaszczające pęcherzyki. Polimeryzacja białek płaszcza na membranie wskutek działalności GTPaz powoduje zakrzywienie błony umożliwiające odpączkowanie pęcherzyka. Oprócz tego różne białka płaszcza rekrutują do tworzącego się pęcherzyka różne receptory z ligandami (np. Klatryna i AP2 te mające iść z zewnątrz do endosomów, COPI idące z ER do Golgiego itd.). Receptory poruszają się swobodnie w płaszczyźnie błony, a po związaniu liganda kierują w stronę „pitów” (jestem prawie przekonany, że jest na to jakaś polska nazwa, ale nie chce mi się szukać). Raczej nie jest to aktywne przemieszczanie, ale zmiany konformacyjne po związaniu liganda powodują, że receptor nie może uwolnić się z pitu po tym jak trafi tam przypadkowo. Dodatkowo, receptory posiadają w cytozolowej domenie fragmenty rozpoznawcze, które wykrywane są przez białka zasocjowane z płaszczem. Dla endocytozy jest to NPXY (skróty jednoliterowe), który rozpoznawany jest przez AP2. Niektóre receptory są związane z pitami nawet bez ligandów. W jednym picie może występować kilka typów receptorów. Po utworzeniu pęcherzyka klatryna i AP2 oddysocjowują i wracają do błony. Pęcherzyk, zwany wczesnym endosomem wędruje w głąb cytoplazmy, łączy się z innymi, a przy okazji jego pH zmienia się na kwaśne, a nazwa na późny endosom. Kwaśne pH powoduje dysocjację ligandów, a błony z receptorami odpęcherzykowują wracając do błony komórkowej (recykling receptorów). Późny endosom łączy się z lizosomem i zawartość zostaje strawiona
59 Pęcherzyki opłaszczone klatryną – powstawanie i losy.
Generalnie, pęcherzyki opłaszczone klatryną kierowane są do endosomów z błony komórkowej (te właściwie to są wczesnymi endosomami) lub do lizosomów przez późne endosomy z trans-Golgiego. Pęcherzyki te mają dwie warstwy płaszcza: wewnętrzną zbudowaną z białek AP lub GGA (różne warianty dla różnych pęcherzyków) i zewnętrzną zbudowaną z klatryny. Klatryna tworzy charakterystyczne jednostki zwane triskelionami, z których każdy ma trzy łańcuchy ciężkie (180kDa) i trzy lekkie (35-40kDa). Asoscjują one po 36 tworząc wielościan o ściśle określonym zakrzywieniu powierzchni i średnicy. W środku znajduje się pęcherzyk, a między nim a klatryną – kompleksy AP (340kDa), z których każdy skalda się z czterech rożnych podjednostek zwanych adaptynami. To właśnie one określają jakie białka (receptor i związane z nimi ligandy) wejdą do pęcherzyka, stąd ich nazwa – AP=adapter proteins (o specyficzności w następnym zagadnieniu). Pęcherzyki opłaszczone AP1 lub GGA powstają w trans-Golgim i kierują się do lizosomów przez późne endosomy. Te opłaszczone AP3 również powstają w trans-Golgim i kierują się bezpośrednio do lizosomów lub podobnych do lizosomów organelli spichrzowych. Oplaszczenie AP2 natomiast, powstają w błonie komórkowej i tworzą wczesne endosomy, które na skutek fuzji zmieniają się w późne endosomy i łączą z lizosomami. Wszystkie pęcherzyki klatryna/AP tworzą się dzięki GTP-azie ARF, a do ich odpoączkowania konieczna jest jeszcze dynamina, o której szerzej w następnym zagadnieniu. Powtarzając to co już było i za chwile będzie, aktywna - związana GTP forma ARF wiąże się z błoną i rekrutuje kompleksy AP i klatrynę. AP rekrutują odpowiednie receptory/białka transportowe, a klatryna powoduje wybrzuszanie się błony i tworzenie pęcherzyka. W końcu, dynamina wykorzystuje energię z GTP aby odciąć pęcherzyk od błony donorowej. Etap z dynaminą odbywa się tylko dla pęcherzyków klatrynowych. Nie wiadomo, dlaczego inne mogą odpączkować bez dynaminy.
Zaraz po utworzeniu pęcherzyka jego płaszcz oddysocjowuje. Prawdopodobnie dzieje się to z wykorzystaniem energii z ATP przez cytozolowe białko Hsc70. Pozwala to nie tylko na recykling płaszcza, ale też odsłania miejsca wiązania Rab i białka SNARE.
Pęcherzyki klatryna/AP1 jeden mają jedną charakterystyczną cechą, mianowicie transportują rozpuszczalne enzymy lizosomalne do późnych endosomów. Enzymy te mają sekwencje sygnalne, które w odróżnieniu od większości sekwencji sygnalnych białek są resztami cukrowymi a nie krótkimi fragmentami polipeptydowymi. Ten fragment sygnalny to mannozo-6-fosforan, dodawany w cis-Golgim. Enzymy te przechodzą taką samą N-glikozylację w ER jak białka mające iść na zewnątrz komórki, ale w Golgim na końce ich łańcuchów cukrowy dodawana jest ufosforylowana mannoza. W trans-Golgim M6P rozpoznawany jest przez transbłonowe receptory, które z kolei rozpoznawane są przez AP1. W kwaśnym pH endosomu M6P dysocjuje,a fosfatazy odcinają resztę fosforanową. Receptory M6P podobnie jak inne receptory/białka transportowe odpączkowują w specjalnych pęcherzykach i wracają do trans-Golgiego, choć czasami mogą trafić do błony komórkowej, gdzie biorą udział w odzyskiwaniu na drodze endocytozy wydzielanych do środowiska enzymów lizosomalnych. Późne endosomy w końcu łączą się z lizosomami i enzymy trafiają na swoje miejsce.
60 . Adaptyny, dynamina, ARF
Adaptyny
Adaptyny odgrywają ważną rolę w wychwytywaniu specyficznych cząsteczek przeznaczonych do transportu i pomagają w selekcji cząsteczek, które mają być transportowane. Cząsteczki te niosą na sobie specyficzne sygnały transportu, które są rozpoznawane przez receptory cargo znajdujące się w błonie przedziału wyjściowego. Adaptyny pomagają w wychwyceniu specyficznych cząstek cargo przez przechwytywanie receptorów cargo, które wiążą te cząsteczki. W ten sposób wyselekcjonowany zestaw cząsteczek ładunku, związanych ze swoimi specyficznymi receptorami, zostaje wprowadzany do światła każdego nowo powstającego pęcherzyka spłaszczanego klatryną. Istnieją przynajmniej dwa typy adaptyn: te, które wiążą receptory cargo w błonie komórkowej są odmienne od tych, które wiążą receptory cargo w aparacie Golgiego. Stanowi to odbicie różnic cargo niesionego przez pęcherzyki okryte klatryną z błony komórkowej od cargo niesionego przez pęcherzyki z aparatu Golgiego
Dynamina
Małe białko wiążące GTP, konieczne do odcięcia nowo utworzonego pęcherzyka od błony donora. Występuje tylko przy pęcherzykach opłaszczonych klatryną/AP2. W końcowej fazie pączkowania, dynamina polimeryzuje tworząc pierścień dookoła „szyjki” pęcherzyka. Wydaje się obecnie, że używa ona energii z hydrolizy GTP do zaciśnięcia się i oderwania pęcherzyka. W przypadku jeśli zablokujemy dynaminę, w komórce zakumulują się wykształcone, ale nie oderwane pęcherzyki.
ARF
Małe białko o masie około 20 kDa, które jest mirystylowane na końcu N. Obecność reszt mirystolowych zwiększa współdziałanie ARF z błonami. Zamieniając GTP na GDP, kompleks ARF – GTP wiążę się z błonami. W procesie wiązania zachodzą zmiany konformacyjne, które sprawiają, że domena końca N wbudowuje się do błonowej dwuwarstwy lipidowej. Ta zaktywowana forma ARF lub jej drożdżowy funkcjonalny odpowiednik Sar1p – następnie przyłącza do błony płaszcze COP-I lub COP-II. W przeciwieństwie do związanego z błoną ARF-GTP, ARF-GDP znajduje się w cytosolu i jest niezdolny do przyłącznia COP do błon. To prowadzi do hipotezy, że ARF-GTP pobudza przyłączenie płaszcza do pęcherzyka, a po hydrolizie GTP, ARF-GDP dysocjuje z błon. Do tej pory nie wyjaśniono, w jaki sposób ARF przyłącza do błon COP-I. Pierwotnie postulowano, że ARF występuje w stechiometrycznej ilości z koatomerem. Obecnie jednak uważa się, że ARF może aktywować fosfolipazę D (PLD), enzym występujący w aparacie Golgiego, odpowiedzialny za modyfikację lipidów. Sugerowano, że to raczej produkt działania PLD – kwas fosfatydowy, a nie ARF może rekrutować podjednostki koatomeru do błon aparatu Golgiego. Sposób, w jaki ARF ułatwia włącznie płaszcza to problem, który nadal znajduje się w obszarze zainteresowań wielu badaczy.