Sprawozdanie: otrzymywanie inwertazy (β-D-fruktofuranozydazy) z drożdży
I Izolacja, oczyszczanie i oznaczanie aktywności inwertazy drożdżowej
ΔA obliczono odejmując absorbancję prób właściwych od absorbancji prób kontrolnych.
| ΔA | 200x | 300x |
|---|---|---|
| ETAP I | 0% EtOH | 0,335 |
| ETAP II | 50% EtOH | 0,27 |
| 60% EtOH | 0,244 | |
| 70% EtOH | 0,204 | |
| 80% EtOH | 0,462 |
Wykreślono krzywą wzorcową na podstawie stężeń glukozy i z równania krzywej wyznaczono ilość wytworzonego cukru prostego w badanych próbach.
y= 0,0336x – 0,004
x= (y+0,004)/0,0336
Ilość wytworzonego cukru [EtOH] |
ilość cukru odczytana dla poszczególnych ΔA | ilość cukru po uwzględnieniu rozcieńczeń | ilość cukru po uśrednieniu obu rozcieńczeń* [mg/ml] |
|---|---|---|---|
| 200x | 300x | 200x | |
| 0% | 10,08929 | 5,744047619 | 2017,857 |
| 50% | 8,154762 | 4,642857143 | 1630,952 |
| 60% | 7,380952 | 4,642857143 | 1476,19 |
| 70% | 6,190476 | 4,166666667 | 1238,095 |
| 80% | 13,86905 | 9,077380952 | 2773,81 |
*przed uśrednieniem wyniki pomnożono x2, ponieważ w doświadczeniu użyto 0,5 ml enzymu
Uzyskane wyniki w mg/ml przeliczono na mikromole w celu wyznaczenia aktywności enzymu (wyrażonej w mikromol/minutę) z proporcji:
Przykładowe obliczenia dla pierwszego etapu:
Mmol glukozy = 180 g/mol
3741,07 mg/ml = 3,74107 g/ml
1 mol glukozy -------- 180 g
x mola glukozy ------- 3,74107 g
x = 0,020783722 mola glukozy
1 mol ------ 106 μmol
0,0207 mola ------ x
x = 20783,72 μmol glukozy
Wyniki dla drugiego etapu:
50% EtOH: 16798,94 μmol/ml
60% EtOH: 15939,17 μmol/ml
70% EtOH: 13822,78 μmol/ml
80% EtOH: 30539,00 μmol/ml
Obliczono aktywność enzymu U (ilość enzymu katalizująca przemianę 1 μmola substratu w czasie 1 minuty)
Czas reakcji: 10 minut
| U [μmol/min] |
|---|
| ETAP I |
| 2078,37 |
II Oznaczanie białka metodą Lowry’ego
Wykreślono krzywą wzorcową na podstawie stężeń albuminy i obliczono zawartość białka w badanych próbkach:
y= 0,0441x + 0,011
x= (y-0,011)/0,0441
Ilość wytworzonego białka [EtOH] |
ilość białka odczytana dla poszczególnych wartości absorbancji | ilość białka po uwzględnieniu rozcieńczeń | ilość białka po uśrednieniu obu rozcieńczeń [mg/ml] |
|---|---|---|---|
| 2x | 3x | 2x | |
| 50% | 5,079365 | 4,489796 | 10,15873016 |
| 60% | 3,129252 | 2,743764 | 6,258503401 |
| 70% | 4,399093 | 2,76644 | 8,798185941 |
| 80% | 3,514739 | 2,040816 | 7,029478458 |
| 0% | 8,117914 | 6,1678 | 16,23582766 |
Wyznaczanie aktywności właściwej enzymu na podstawie uzyskanych wcześniej wyników:
Aktywność właściwa enzymu – stosunek oznaczonej aktywności enzymu do ilości białka [U/mg]
Etap pierwszy:
2078,37/17,37 = 119,65 U/mg
Etap drugi:
50% etanolu 1679,89/11,81 = 142,24 U/mg
60% etanolu 1593,92/7,24 = 220,15 U/mg
70% etanolu 1382,28/8,55 = 161,67 U/mg
80% etanolu 3053,90/6,58 = 464,12 U/mg
Wyznaczanie wskaźnika oczyszczenia preparatu:
Jest to stosunek aktywności właściwej preparatu uzyskanej po drugim etapie izolacji do aktywności właściwej w wyjściowym ekstrakcie.
50% etanolu: 142,24/119,65 = 1,19
60% etanolu: 220,15/119,65 = 1,84
70% etanolu: 161,67/119,65 = 1,35
80% etanolu: 464,12/119,65 = 3,88
Wyznaczanie wydajności ogólnej procesu izolacji:
Jest to stosunek aktywności enzymu po drugim etapie izolacji do wyjściowej aktywności enzymu razy 100%.
50% etanolu (1679,89/2078,37)*100% = 80,8%
60% etanolu (1593,92/2078,37)*100% = 76,7%
70% etanolu (1382,28/2078,37)*100% = 66,5%
80% etanolu (3053,90/2078,37)*100% = 147,0%
Wnioski:
Z powodu popełnienia błędu podczas wykonywania doświadczenia odrzucamy wynik dla stężenia etanolu równego 80%. Błąd może wynikać ze złego pomiaru absorbancji.
Najmniejszą aktywność właściwą wykazuje enzym przy użyciu 50% alkoholu, dla którego też wydajność ogólna procesu izolacji jest największa. Podsumowując: do izolacji inwertazy drożdżowej najlepiej stosować alkohol o stężeniu 50%.