Ćwiczenie 5: Cytokiny i cząsteczki wzrostowe

Cytokiny:

- niskocząsteczkowe białka produkowane głównie przez komórki układu odpornościowego

- wywierają swe działanie na komórki docelowe posiadające odpowiednie receptory

- regulują wzrost, różnicowanie i aktywność komórek, przebieg odpowiedzi immunologicznej i zapalnej, proces naprawy tkanek, krwiotworzenie.

- ich produkcja nie wykazuje swoistości antygenowej - powstają zarówno w trakcie odpowiedzi immunologicznej swoistej jak i nieswoistej

- wytwarzane są komórki pobudzone, nie w sposób konstytutywny

- pełnią rolę międzykomórkowych przekaźników informacji

Porównanie własności cytokin i hormonów

Właściwość	Cytokiny	Hormony
źródło	Wiele różnych typów komórek	Wyspecjalizowane gruczoły endokrynne
cel	Wiele różnych typów komórek	Wyspecjalizowane komórki docelowe
Redundancja czynnościowa	wysoka	Niska
działanie	Auto-, para-, endokrynne	Endokrynne
Funkcja	Regulacja reakcji odpornościowych i zapalnych, naprawa tkanek	homeostaza

Charakterystyczne cechy cytokin:

• plejotropia - zdolność określonej cytokiny do oddziaływania na wiele różnych komórek i wywoływania

różnych efektów

• redundancja - właściwość różnych cytokin do wywierania takiego samego efektu

• działanie antagonistyczne - blokowanie efektów biologicznych

• działanie synergistyczne - efekt silniejszy niż wynikałoby to z sumowania efektów działania poszczególnych

cytokin

• zdolność do indukowania sprzężeń zwrotnych dodatnich lub ujemnych

Nomenklatura cytokin:

1. ze względu na komórki wytwarzające cytokinę:

- limfokiny

- monokliny

2. ze względu na dziłanie:

- interleukiny - wydzielane i działające na leukocyty

- chemokiny

- czynniki krwiotwórcze

- czynnik martwicy nowotworu

- interferony

Receptory immunoglobulinopodobne:

W części zewnątrzkomórkowej posiadają charakterystyczne domeny o strukturze zbliżonej do immunoglobin

Receptory dla hematopoetyn:

W odcinku zewnątrzkomórkowym posiadają dwa rodzaje domen:

- zawierają 4 konserwatywne cysteiny w charakterystycznych pozycjach

- zawierające sekwencję Trp-Ser-X-Trp-Ser

- posiadają dwie podjednostki - jedna wiąże cytokinę, druga przekazuje sygnał do komórki

- trzy podrodziny (na podstawie obecności wspólnych podjednostek przekazujących sygnał):

- Bc - dla IL-3, IL-5, GM-CSF

- Rc - dla IL_2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15, IL-21

- Gp130 - dla IL-6, IL-11

Receptory dla interferonów:

Struktura podobna do receptorów dla hematopoetyn, w odróżnieniu od nich posiadają jedynie domeny z 4 konserwatywnymi cysteinami. Brak domen z sekwencją Trp-Ser-X-Trp-Ser

Receptory dla nadrodziny TNF:

- w części zewnątrzkomórkowej powtarzające się domeny

- domeny bogate w cysteinę

Receptory dla chemokin:

- sprzężone z białkiem G

- odcinek transbłonowy 7-krotnie przecina błonę komórkową

Inetrleukina 1:

- ważny regulator odpowiedzi immunologicznej i zapalnej

- produkowana głównie przez monocyty i makrofagi

Czynniki stymulujące produkcję IL-1:

- LPS

- egzotoksyny bakteryjne, peptydoglikany, hemaglutyniny wirusowe

- inne cytokiny (IL-1, TNF)

- składowe dopełniacza (C5a)

Receptory dla IL-1:
- IL1-R1 o m.cz. 80 kD

- IL1-R2 o m.cz. ok. 60 kD - głównie na limfocytach B, monocytach, neutrofilach. Tzw. Receptor „wabik”.

Interleukina 2:

- Produkowana głównie przz limfocyty Th1, także Tc

Receptory dla IL-2:

- niefunkcjonalny - tylko łańcuch alfa

- o pośrednim powinowadztwie - łańcuchy beta i gamma. Na komórkach NK, spoczynkowych monocytach

- o wysokim powinowadztwie - łańcuchy alfa, beta, gamma. Na pobudzonych limfocytach T i B i ok. 10% komórek NK.

Efekty działania IL-2:

- pobudza różnicowanie limfocytów T w kierunku Tc

- wzmaga proliferację pobudzonych limfocytów Tc, także Th, komórek NK

- stymuluje produkcję cytokin: GM-CSF, IL-6, IL-2, IFN-gamma.

- uczestniczy w wygaszaniu reakcji immunologicznej po eliminacji antygenu:

- indukcja ekspresji FasL na limfocytach T (apoptoza)

- indukcja ekspresji CTLA-4, który blokuje cząstki kostymulujące uczestniczące w przekazywaniu sygnału między komórkami APC a limfocytami T

Zastosowania kliniczne IL-2:
- terapia niektórych rodzajów nowotworów, jak rak nerki czy czerniak - IL-2 podaje się łącznie z komórkami LAK lub TIL

- niektóre białaczki np. wywoływana przez HTLV-1 białaczka ATL. Białaczkowe limfocyty T wykazują wzmożoną ekspresję IL-2R, co wykorzystano - podaje się IL-2 sprzężoną z toksyną lub radioizotopem

Działania niepożądane:

- objawy grypopodobne

- wzrost przepuszczalności naczyń (obrzęki, hipotonia, duszność, ostra niewydolność nerek, zaburzenia rytmu serca, bradykardia)

- nudności, wymioty

- niedokrwistość, leukopenia

Inerleukina 6:

- produkowana głównie przez monocyty i makrofagi, także limfocyty T i B, komó®ki śródbłonka, fibroblasty

- czynniki stymulujące to wytwarzanie: IL-2, IL-1, TNF, także IFN, LPS

Działanie IL-6:

- stymuluje powstawanie komórek plazmatycznych z pobudzonych limfocytów B i wydzielanie immunoglobulin

- wraz z IL-1 uczestniczy w aktywacji limfocytów T wzmagając ich odpowiedź na antygen

- stymuluje różnicowanie pobudzonych limfocytów T do Tc

- pirogen

- wzmaga produkcję białek ostrej fazy

- hamuje produkcję IL-1 i TNF (działanie przeciwzapalne)

- nasila procesy krwiotworzenia wykazując synergizm z IL-3 (stymuluje proliferację multipotencjalnych komórek macierzystych i komórek ukierunkowanych poszczególnych szeregów krwinkowych).

Receptory dla IL-6:

- heterodimery: podjednostka alfa wiąże cytokinę, podjednostka beta przekazuje sygnał pobudzenia do komórki

- rozpuszczalny receptor dla IL-6 nie wygasza jej działania, lecz wzmaga je

Inerleukina 10:

- ważna cytokina przeciwzapalna

- wytwarzana głównie przez limfocyty Th2, w mniejszych ilościach przez limfocyty B i Tc, monocyty, makrofagi

Działanie IL-10:

- hamuje powstawanie limfocytów Th1 i produkcję cytokin przez Th1 (IL-2, IFN-gamma)

- hamuje produkcję IL-1, IL-6, IL12, TNF-alfa przez monocyty i makrofagi

- zmniejsza zdolność prezentacji antygenu przez hamowanie ekspresji MHC II na monocytach i makrofagach

- hamuje ekspresję na powierzchni komórek APC cząsteczek kostymulujących (m.in. B7) koniecznych do aktywacji limfocytów Th

- stymuluje proliferację limfocytów B i produkcję przeciwciał (IgG4)

- hamuje odpowiedź komórkową i reakcje zapalne.

Interleukina 4:

- produkowana głównie przez limfocyty Th2, takżę komórki NKT, mastocyty i bazofile

- działanie przeciwzapalne wiąże się przede wszystkim z hamowaniem produkcji cytokin pozapalnych (IL-1, IL-6, TNF).

- stymuluje proliferację limfocytów B i wytwarzanie przeciwciał (IgE i IgG4) nasila ekspresję cząsteczek MHC I i II oraz niektórych cząsteczek kostymulujących (CD80, CD23) na powierzchni limfocytów B

- stymuluje proliferację limfocytów T, różnicowanie Th0 do Th2 a wraz z IL-10 hamuje wydzielanie IFN-gamma przez limfocyty Th1

- aktywuje monocyty i makrofagi, wzmaga ich właściwości fagocytarne i cytotoksyczność, ekspresję cząstek MHC I i II, hamuje produkcję pozapalnych: IL-1, IL-6, TNF

- stymuluje proliferację i aktywuje eozynofile, nasila ich migrację do tkanek

- działania IL-4 znosi INF-gamma

- istnieje korelacja między wydzielaniem IL-4 i stężeniem IgE w osoczu a wzmożona produkcja tej cytokiny prowadzi do reakcji zapalnych przypominających odczyny alergiczne.

- próby stosowania IL-4 w terapii nowotworów (czerniak). Działanie przeciwnowotworowe wynika prawdopodobnie z aktywacji eozynofilów i hamowania angiogenezy. IL-4 podawana jest doguzowo- przy podaniu ogólnoustrojowym silne reakcje niepożądane.

Interferony:

- grupa cytokin wytwarzana i uwalniana przez komórki w odpowiedzi na zakażenia wirusowe

- w ich działaniu na komórki docelowe występuje zjawisko primingu

Rodzaje interferonów:

Typ	Rodzaj	Źródło
I	IFN-α	Leukocyty, komórki dendrytyczne
I	IFN-β	Fibroblasty
I	IFN-ω	Trofoblast
I	IFN-κ	Keratynocyty
II	IFN-γ (immunologiczny)	Aktywowane limfocyty T, komórki NK

Receptory dla interferonów:

- struktura heterodimerów

- IFN typu I wiążą się z receptorem zbudowanym z podjednostek IFNAR-1 i IFNAR-2

- IFN-gamma z receptorem złożonym z IFNGR-1 i IFNGR-2

- Przekazywanie sygnału z udziałem kinaz JAK i białek STAT, innych czynników transkrypcyjnych (NF kappa B, IRF-1)

- indukują ekspresję szeregu genów m.in. dla MHC i II podjednostki oksydazy NADPH komórek żernych, iNOS i wielu innych)

Działanie interferonów:
- działanie przeciwwirusowe - wywierane pośrednio:

- wpływ na przenikanie wirusów przez błonę komórkową

- hamowanie syntezy białek wirusowych

- hamują syntezę białek wirusowych poprzez aktywację kinezy białkowej R (PKR)

- wzmagają degradację wirusowego RNA
- hamują elongację łańcucha białkowego

- aktywują deaminazę adenozyny (ADAR) w komórkach zakażónych wirusem. ADA powoduje deaminację adenozyn w obrębie dwuniciowego wirusowego RNA (adenozyna -> inozyna). Wirusowy RNA staje się niefunkcjonalny.

Działanie przeciwwirusowe wiąże się z wpływem INF na układ odpornościowy:

1. wzmagają aktywność komórek cytotoksycznych ( K, NK, limfocytów Tc )

2. aktywują makrofagi (działanie cytotoksyczne i fagocytame)

3. wzmagają ekspresję cząsteczek MHC (wszystkie IFN klasy I, a INF γ dodatkowo jeszcze klasy II)

4. indukują ekspresję innych cytokin (IL-1, lL-6, TNF)

5. zwiększenie ekspresji receptoró FcR, wzmagając ADCC

6. stymuluje różnicowanie limfocytów B do komórek plazmatycznych produkujących IgG. IgG służą jako opsoniny, kompleksy IgG-antygen aktywują dopełniacz na drodze klasycznej.

7. hamowanie proliferacji komóreki indukcja ich zróżnicowania.

Zastosowanie interferonów w terapii:

- terapia zakażeń wirusowych: wzw B, C, D; AIDS, HPV

W przewlekłym zapaleniu wątroby typu B stosowano IFN-afa codziennie w dawce 5 mln j.

Po 4 miesiącach stwierdzono:

- zanik DNA wirusa HBV i HBV-Ag w surowicy u 32% chorych

- zmniejszenie aktywności AlAT

- poprawę obrazie histopatologicznym wątroby

- leczenie chorób nowotworowych m.in. PBS, białaczka włochatokomórkowa, szpicak mnogi, raki pęcherza moczowego, jajnika

- działanie przeciwnowotworowe interferonów:

1. bezpośrednie:

- hamowanie proliferacji i stymulacja różnicowania komórek nowotworowych

- nasilenie ekspresji cząsteczek MHC i antygenów TAA

2. pośrednie:

- stymulacja odpowiedzi przeciwnowotworowej (aktywacja komórek NK, makrofagów, limfocytów Tc itd.)

- wzmożone wytwarzanie cytokin o działaniu przeciwnowotworowym (TNF)

TNF:

- cytokina o plejotropowym działaniu i autoregulacyjnych właściwościach

- jeden z podstawowych mediatorów zapalnych

Do rodziny TNF zalicza się:

- TNF-alfa (wytwarzany głównie przez monocyty/makrofagi)

- TNF-beta = limfotoksyna alfa (limfocyty)

- niedawno opisana limfotoksyna beta (limfocyty)

Czynniki stymulujące syntezę TNF:

-LPS

- niektóre wirusy (Hermes simplex, Coxackie)

- toksyny bakteryjne (streptolizyna O, egzotoksyna paciorkowcowa, enterotoksyna gronkowcowa)

- pasożyty, grzyby

- cytokiny m.in.: IL-1, IL-2

- IFN-gamma wzmaga wydzielanie TNF

Receptory dla TNF:

- TNFR1 (p55), TNFR2 (p75)

- te same dla TNF-alfa i TNF-beta

- występują na powierzchni niemal każdej komórki jądrzastej

- pod wpływem endoproteaz błonowych mogą ulegać złuszczaniu do krwi i płynów tkankowych - inhibitory TNF

- brak korelacji między liczbą receptorów a odpowiedzią komórki na TNF

- po połączeniu z receptorem błonowym TNF bardzo aktywnie stymuluje uwalnianie NF-κB i produkcję przez komórki docelowe szeregu substancji m.in. IL-1, IL-6, TNF, GM-CSF

- część wewnątrzkomórkowa TNFR1 zawiera tzw. Domenę śmierci, która aktywuje szlak wiodący do apoptozy komórki

Działanie TNF zależy od intensywności jego produkcji:

Gwałtowne, duże ilości	Przewlekłe, małe ilości
gorączka	Utrata masy ciała
Objawy wstrząsu i uszkodzenie tkanek	jadłowstręt
Wzrost wydzielania hormonów katabolicznych	Katabolizm białek, zmniejszenie zasobów tkanki tłuszczowej
Ostra niewydolność oddechowa	Hepatosplenomegalia
DIC	Insulinooporność, uszkodzenie komórek beta trzustki
Krwotok do nadnerczy	Zmiany w ścianie wewnętrznej tętnic prowadzące do zmian miażdżycopodobnych

Działanie TNF na układ immunologiczny:

- stymuluje proliferację i różnicowanie limfocytów B i produkcję przeciwciał

- stymuluje proliferację limfocytów T, produkcję cytokin m.in. IL-2, IFN-gamma

- aktywuje makrofagi, nasila ich właściwości cytotoksyczne i produkcję cytokin (m.in. IL-1, IL-6, TNF, CSFs, PAF)

- nasila cytotoksyczność komórek NK

- aktywator i czynnik chemotaktyczny dla neutrofilów, nasila cytotoksyczność neutrofilów (produkcja RFT, właściwości fagocytarne)

- indukuje ekspresję na komórkach cząstek MHC klasy II i wspólnie z IFN-gamma, MHC II

Działanie TNF na neutrofile:

- limfopenia, neutrofilia

- wpływ na adhezję neutrofilów do śródbłonka - TNF nasila ekspresję na powierzchni neutrofila cząstek adhezyjnych (CD11b/CD18)

- zahamowanie chemotaksji neutrofilów wobec C5a, LTB4, IL-8. Mechanizm nie do końca wyjaśniony

- TNF nasila produkcję RFT przez neutrofile.

Działanie TNF na śródbłonek naczyniowy:

- TNF zmienia antykoagulacyjne właściwości śródbłonka na prokoagulacyjne:

- hamuje aktywność trombomoduliny

- pobudza ekspresję czynnika tkankowego

- hamuje fibrynolizę zmniejszając ekspresję t-PA i nasilając wytwarzanie Pal-1 i Pal-2

- nasila produkcję PAF, endoteliny

- zwiększa ekspresję molekuł adhezyjnych (selektywna E, ICAM)

- zwiększa syntezę IL-8

Działanie TNF na komórki tkanki tłuszczowej:

- hamuję ekspresję genu dla lipazy lipoproteinowej w tkance tłuszczowej - zahamowanie lipogenezy stanowi jedną z przyczyn kacheksji w przewlekłych procesach zapalnych czy chorobie nowotworowej

- zmniejsza lipogenezę także poprzez hamowanie syntezy kilku innych enzymów: syntetaza kwasów tłuszczowych, karboksylaza acetylo-CoA

- nasila lipolizę w adipocytach

Wpływ TNF na osteoblasty, komórki maziówki i fibroblasty:

- pobudza czynność osteoblastów (niszczenie kości, hiperkalcemia, uszkodzenie nerek). Stymuluje powstawanie z komórek progenitorowych układu krwiotwórczego komórek podobnych do osteoblastów

- w płynie stawowym chorych na RZS stwierdzono występowanie TNF, co dowodzi jego udziału w procesach zapalnych toczących się w obrębie stawów.

Działanie przeciwnowotworowe TNF:

- indukcja apoptozy komórek nowotworowych

- hamowanie proliferacji i stymulacja różnicowania komórek neoplastycznych

- wpływ na naczynia krwionośne nowotworu - hamuje angiogenezę, aktywność trombomoduliny na powierzchni komórek śródbłonka, zwiększa uwalnianie TNF

- bezpośrednie działanie cytotoksyczne - poprzez fosfolipazę A2 uruchamia kaskadę kwasu arachidonowego, w której generowane są rodniki hydroksylowe uszkadzające struktury komórkowe

Zastosowanie kliniczne TNF:

- terapia niektórych nowotworów np. czerniak lub mięsak. Podawanie miejscowe. Stosowany łacznie z IFN-gamma lub chemioterapią

- terapia RZS - podaje się przeciwciała monoklonalne blokujące TNF

Czynniki krwiotwórcze:

- regulują wzrost i różnicowanie komórek progenitorowych krwiotworzenia

- oddziałują na wielopotencjalne komórki pnia oraz na ukierunkowane prekursory odpowiednich szeregów krwinkowych

- funkcjonują również jako regulatory odpowiedzi immunologicznej

SCF- czynnik wzrostu komórek macierzystych

- działa na bardzo młode, wielopotencjalne komórki krwiotworzenia stymulując ich różnicowanie w kierunku bardziej zróżnicowanych komórek poszczególnych układów krwinkowych

GM-CSF:

- stymuluje proliferację i dojrzewanie prekursorów linii granulocytarno-makrofagowej

- działa na dojrzałe granulocyty i makrofagi zwiększając ich właściwości fagocytarne, stymulując ekspresję receptorów dla Fc immunoglobulin, cząstek adhezyjnych, produkcję cytokin (IL-1, IL-6, TNF)

- zastosowanie kliniczne: neutropenie, niedokrwistość plastyczna, MDS, po chemio- i radioterapii.

Interleukina 3:

- wytwarzana przez pobudzone limfocyty T

- synergizm z SCF w stosunku do pluripotencjalnych komórek macierzystych szpiku

- działanie takie jak GM-CSF w odniesieniu do komórek progenitorowych szeregu granulocytowego i monocytowego; w odróżnieniu od GM-CSF stymuluje również dojrzewanie eozynofilów i bazofilów

- wpływ na komórki progenitorowe szeregu erytrocytowego i megakariocytowego

- wpływ na limfopoezę - stymuluje dojrzewanie prekursorów limfocytów B i T

- znajduje zastosowanie w leczeniu aplazji szpiku, polekowej i idiomatycznej oraz korekcji cytopenii po chemio- i radioterapii

Erytropoetyna:

- produkowana w nerkach przez komórki śródbłonka naczyń włosowatych otaczających kanaliki nerkowe

- produkcja wzrasta w stanach niedotlenienia

- receptor dla Epo na komórkach krwiotwórczych układu erytroidalnego

- stosowana głównie w leczeniu niedokrwistości towarzyszącej przewlekłej niewydolności nerek

Chemokiny:

- cytokiny o małej masie cząsteczkowej (8-12 kD)

- działanie chemotaktyczne wobec leukocytów

- uczestniczą w reakcjach zapalnych i odporności przeciwzakaźnej

- aktywatory i stymulatory proliferacji i różnicowania leukocytów

- regulują procesy angiogenezy i krwiotworzenia

- rola w reakcjach odrzucania przeszczepu, także powstawaniu przerzutów nowotworowych

Podział strukturalny chemokin:

- na podstawie liczby cystein w końcu aminowym łańcucha peptydowego i liczby AA dzielących dwie pierwsze cysteiny:

- C - limfoaktyna Alfa i beta

- CC - MIP1 alfa i beta, RANTES. Działaja na limfocyty, monocyty, komórki tuczne, eozynofile

- CXC - IL-8, PF4. Działają głównie na neutrofile i limfokiny

- CX3C - fraktalina

Podział czynnościowy chemokin:

- pozapalne (indukowane) - sterują napływem do ogniska zapalnego komórek immunokompetentnych

- limfoidalne ((konstytutywne) - wytwarzane w narządach limfatycznych; regulują krążenie różnych populacji limfocytów, przemieszczanie się dojrzewających tymocytów z kory do rdzenia grasicy; przemieszczanie komórek dendrytycznych z tkanek obwodowych do obwodowych narządów limfatycznych.

Funkcje chemokin:

- czynnik chemotaktyczny

- wpływ na procesy dojrzewania leukocytów:

- regulacja migracji dojrzewających leukocytów do odpowiednich mikrośrodowisk w narządach krwiotwórczych

- MIP-1alfa i MIP-1beta wpływają na różnicowanie granulocytów i monocytów

- SDF-1 stymuluje proliferację prekursorów limfocytów B

- czynniki aktywujące komórki odpornościowe

- IL-8 aktywuje neutrofile i wzmaga ich cytotoksyczność

- MIp-1alfa aktywuje monocyty

- RANTES i MIP-1alfa aktywują eozynofile, nasilają cytotoksyczność Limfocytów Tc i komórek NK

Interleukina 8:

- właściwości pozapalne

- produkowana przez monocyty, komórki śródbłonka

- silny czynnik chemotaktyczny dla neutrfilów, stymuluje właściwości bakteriobójcze neutrofilów: produkcję RFT, degranulację ziarnistości uwolnienie enzymów lizosomalnych

- pobudza uwalnianie histaminy i LTB4 przez bazofile

- nasila przechodznie niektórych limfocytów T z mikrokrążenia do tkanki

---