Wyznaczanie optymalnego stężenia chlorku 2,3,5 _ trójfenylo- tetrazolowego podczas oznaczania aktywności dehydrogenaz za pomocą testu TTC.
Wprowadzenie
Podstawowym czynnikiem wpływającym na wiarygodność uzyskiwanych rezultatów oznaczania aktywności dehydrogenaz, jest stężenie TTC w inkubowanej próbce. Wielkość optymalnego stężenia TTC jest bowiem zmienna i zależna od aktualnego składu, morfologii oraz stanu fizjologicznego badanej biocenozy. Stężenie to wynika z kompromisu pomiędzy sprzecznymi wymogami: zapewnienia z jednej strony takiej koncentracji TTC, aby związek ten mógł wniknąć w odpowiedniej ilości do wewnątrzkomórkowych miejsc aktywności oksydoredukcyjnej, a z drugiej strony - nie działał jeszcze toksycznie. Niekiedy nie można spełnić obydwu tych wymogów i stężenie TTC nie gwarantuje odpowiedniego nadmiaru tego związku w miejscach aktywności oksydoredukcyjnej komórek, działa toksycznie. Taki przypadek wyklucza możliwość oznaczania za pomocą testu TTC rzeczywistej aktywności mikroorganizmów. Dlatego przed przystąpieniem do oznaczania aktywności mikroorganizmów należy każdorazowo wyznaczyć optymalne stężenie TTC w inkubowanych próbkach.
Odczynniki i sprzęt
Roztwór wodny TTC 2%
Roztwór wodny Na2SO3 0,2%
Alkohol metylowy cz.d.a.
Statyw na probówki
Probówki wirówkowe o pojemności 10 ml, 16 szt.
Wirówka laboratoryjna
Kolorymetr (x = 485 nm)
Mikrodozymetr 8 ml
Mikrodozymetr 1 ml
Pipety 1 ml
Wykonanie doświadczenia
Do oznakowanych probówek wirówkowych wprowadzić następujące objętości [ml] reagentów:
REAGENT |
PROBÓWKA |
||||||||
|
1 i 2 |
3 i 4 |
5 i 6 |
7 i 8 |
9 i 10 |
11 i 12 |
13 i 14 |
15 i 16 |
|
Roztwór Na2SO3 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
|
H2O |
0.9 |
0.8 |
0.7 |
0.6 |
0.5 |
0.3 |
0.2 |
- |
|
Roztwór TTC |
0.1 |
0.2 |
0.3 |
0.4 |
0.5 |
0.7 |
0.8 |
1 |
|
Osad czynny |
8 |
8 |
8 |
8 |
8 |
8 |
8 |
8 |
|
Po wprowadzeniu reagentów zawartość probówek wymieszać, a następnie inkubować próbki w ciemności w temperaturze zgodnej z naturalnymi warunkami hodowli drobnoustrojów przez okres zależny od wykazywanej aktywności drobnoustrojów (obserwować okresowo narastanie intensywności czerwonego zabarwienia drobnoustrojów). Czas inkubacji należy liczyć od momentu połączenia roztworu TTC z osadem czynnym. Po zakończeniu inkubacji próbki szybko odwirować (po doprowadzeniu szybkości do 3000 obrotów na minutę, wirówkę wyłączyć) odrzucić ciecz nadosadową (supernatant), a następnie dla przerwania reakcji enzymatycznych i ekstrakcji TF wprowadzić do próbówek po 8 ml alkoholu metylowego w takiej samej kolejności i zachowując podobne tempo jak przy wprowadzaniu roztworu TTC. Próbki energicznie wytrząsnąć i ponownie odwirować. Oznaczyć ekstynkcję cieczy nadosadowej przy długości fali 485 nm.
Opracowanie wyników
Sporządzić wykres zależności ekstynkcji od stężenia TTC w próbce. Na podstawie sporządzonego wykresu przeprowadzić dyskusję wyników oraz wyznaczyć optymalne stężenie TTC, które będzie stosowane we właściwych oznaczeniach aktywności dehydrogenaz mikroorganizmów.