Wyznaczanie zakresu liniowego przyrostu p-nitrofenolu oraz oznaczanie aktywności fosfataz
Wprowadzenie
W klasie hydrolaz (EC 3) z grupy esteraz (EC 3.1) ważną rolę w metabolizmie komórkowym odgrywają enzymy powodujące hydrolityczne usunięcie grupy fosforanowej. Enzymy powodujące hydrolizę monoestrów fosforanowych potocznie nazywa się fosfatazami (EC 3.1.3). Uczestniczą one w metabolizmie tłuszczy, węglowodanów, kwasów nukleinowych, nukleotydów i fosfoproteidów. W zależności od optymalnej wartości pH, w którym poszczególne fosfatazy wykazują swą maksymalną aktywność, rozróżnia się "kwaśne" i "zasadowe" fosfatazy.
Ze względu na niską specyficzność substratową fosfataz, ich aktywność wydaje się być dobrym wskaźnikiem ogólnej intensywności procesów życiowych drobnoustrojów. Należy jednak uwzględniać, że duża zawartość ortofosforanów obniża aktywność fosfatazy alkalicznej, natomiast fosfataza kwaśna ulega inhibicji pod wpływem polifosforanów ( zawartych np. w środkach piorących).
Zasada oznaczenia
Aktywność fosfataz oznacza się przez wprowadzenie chromogennego substratu (4-nitrofenylofosforan). W wyniku enzymatycznej hydrolizy powstaje wolny nitrofenol. W środowisku alkalicznym związek ten ma żółtą barwę i jego ilość może być wyznaczana fotometrycznie. W podanej metodyce wyznacza się ogólną aktywność fosfataz. Przez inkubację w buforze o odpowiednim pH można określić osobno aktywność fosfataz kwaśnych i zasadowych.
Wykonanie oznaczenia
Do 12 probówek odmierzyć po 1 ml osadu czynnego i 1 ml roztworu p-NPP-Na2.
Po 5, 10, 15, 20, 25 i 30 minutach przerywać inkubację w kolejnych 2 probówkach dodając po 1 ml Na2CO3 i odwirowując przez 5 minut przy 4000 obr./min. Po odwirowaniu zmierzyć ekstynkcję przy długości fali 405 nm.
Równolegle przygotować trzy ślepe próby:
- 1 ml 0,14 M r-ru NaCl i 1 ml p-NPP-Na2 (wobec tej ślepej próby należy mierzyć ekstynkcję próbek (z wyj. dwóch pozostałych prób ślepych))
- 1 ml r-ru NaCl i 1 ml osadu czynnego
- 2 ml r-ru NaCl
Inkubację prób ślepych przerwać po 5 minutach inkubacji dodając po 1 ml Na2CO3 i postępując identycznie jak w przypadku próbek z substratem.
Druga i trzecia ślepa próba służą do wyznaczenia współczynnika korekcyjnego k1. W tym celu należy zmierzyć ekstynkcję ślepej próby z osadem czynnym w odniesieniu do r-ru składającego się z NaCl i Na2CO3. Wartość k1 należy odjąć od każdego z pomiarów ekstynkcji inkubowanych próbek. Stężenie nitrofenolu w próbkach należy obliczyć korzystając z krzywej wzorcowej.
Opracowanie wyników
Sporządzić wykres zależności stężenia nitrofenolu od czasu inkubacji. Wyznaczyć optymalny czas inkubacji (liniowy przyrost nitrofenolu).
Wyznaczyć aktywność fosfataz obliczając ilość powstałego nitrofenolu w czasie optymalnym, podając wyniki w mg nitrofenolu/ l*h.