Ćwiczenie 1:

Oznaczanie wybranych parametrów jakości tłuszczów spożywczych

Wprowadzenie:

Tłuszcze należą do niezbędnych składników pokarmowych w diecie każdego człowieka. Rodzaj i ilość tłuszczu w żywności znacząco wpływa na jej właściwości żywieniowe, fizyczne i sensoryczne. Do zasadniczych funkcji tłuszczu spożywczego należy jego działanie jako:

- składnika energetycznego pokarmu i źródła węgla w procesach biosyntezy,

- nośnika składników biologicznie czynnych takich jak: niezbędnych nienasyconych kwasów tłuszczowych (NNKT), fosfolipidów, glikolipidów, sterydów, witamin.

Spośród wszystkich składników pokarmowych tłuszcze są głównym i najbardziej skoncentrowanym źródłem energii. Z jednego grama tłuszczu uzyskać można ok. 9 kcal (37,7 kJ), co daje w przybliżeniu dwa razy więcej energii niż z analogicznej ilości białka czy sacharydów. Ponadto związki te pełnią w ustroju człowieka ważną rolę strukturalną. Triacyloglicerole, fosfolipidy, cholesterol i jego estry stanowią część składową komórek ustrojowych, m.in.: błon i organelli komórkowych. Dodatkowo triacyloglicerole są głównym składnikiem zapasowej tkanki tłuszczowej, która to z kolei chroni organizm przed utratą ciepła, a organy wewnętrzne przed wstrząsami i uszkodzeniami. Dla prawidłowego funkcjonowania organizmu istotne są nie tylko wysokie walory energetyczne tłuszczów, ale również obecność w nich nienasyconych kwasów tłuszczowych, wśród których szczególną wartość mają tzw. niezbędne nienasycone kwasy: linolowy i linolenowy ( częściowo arachidowy).

Tłuszcze są istotnym źródłem fosfolipidów (lecytyn, kefalin, sfingomielin, gangliozydów). Składniki te stanowią integralną część struktur komórkowych szczególnie mitochondrialnych, a także biorą aktywny udział w przemianie materii. Fosfolipidy to grupa związków chemicznych, w których oprócz reszt kwasów tłuszczowych występują także reszty kwasu fosforowego. W zależności od rodzaju alkoholu, stanowiącego zrąb cząsteczki, wyróżnia się glicerofosfolipidy (pochodne gliceryny) i sfingofosfolipidy (pochodne sfingozyny - złożonego aminoalkoholu). Przez resztę fosforową do rdzenia sfingo- bądź glicero-fosfolipidowego może być dołączony inny organiczny związek chemiczny (np. etanolamina, inozyna, seryna, cholina). Fosfolipidy są podstawowym budulcem błon komórkowych wszystkich żywych organizmów, szczególnie obficie występują w tkance nerwowej, mózgu u zwierząt, czy też w nasionach roślin oleistych. Fosfatydylocholina ( lecytyna) stanowiąca około 40% wszystkich fosfolipidów błony komórkowej jest jednym z najważniejszych składników zapewniających prawidłową płynność i właściwości biofizyczne struktury komórkowej, ma, więc zasadnicze znaczenie dla właściwego funkcjonowania komórek. Fosfatydylocholina jest także ważnym komponentem cząstek lipoprotein krążących we krwi i istotnym składnikiem żółci.

Oznaczanie zawartości fosforu w produktach spożywczych bogatych w tłuszcze (makrelę, orzech włoski, olej lniany, olej słonecznikowy, oliwę z oliwek, tran) umożliwia ocenę zawartości fosfolipidów. Aby oznaczyć zawartość fosforu w produktach spożywczych należy poddać je najpierw mineralizacji. Podczas tego procesu organiczne związki fosforanowe przechodzą w fosforany nieorganiczne. Zasada oznaczania fosforanów nieorganicznych polega na reakcji z molibdenianem amonu. Jony fosforanowe tworzą z molibdenianem amonu żółty osad molibdenianofosforanu amonu - (NH₄)₃P(Mo₃O₁₀)₄, który pod wpływem związku organicznego - eikonogenu redukuje się do błękitu molibdenowego (mieszanina tlenków molibdenu na niższym stopniu utlenienia).

Ilość powstałych tlenków ocenia się kolorymetrycznie poprzez pomiar absorbancji roztworu przy fali o długości 680 nm.

Tłuszcze spełniają wiele znaczących funkcji w technologii żywności. Stosuje się je między innymi jako czynnik kontrolowanego przenoszenia ciepła (np. tłuszcze smażalnicze), co jednocześnie wiąże się z kształtowaniem cech organoleptycznych produktów tłuszczowych, takich jak: wygląd, tekstura, konsystencja, zapach, smak, mazistość. Poszczególne składniki tłuszczów, takie jak np. mono-, diacyloglicerole oraz lecytyna, są z kolei powszechnie stosowane jako emulgatory.

W trakcie przechowywania tłuszczów zachodzi wiele niekorzystnych zmian, w efekcie których pogarsza się ich jakość bądź też całkowicie ulegają zepsuciu. Procesy te nazywa się jełczeniem, a zachodzą głównie pod wpływem czynników zewnętrznych takich jak temperatura, światło, powietrze. Wyróżnia się dwa podstawowe rodzaje zmian zachodzące w tłuszczach:

1). zmiany hydrolityczne, które powstają w wyniku działania warunków zewnętrznych, mikroorganizmów i enzymów tkankowych i prowadzą do uwalniania z glicerydów wolnych kwasów tłuszczowych, a także powodują rozpad wyższych kwasów tłuszczowych na kwasy o krótszym łańcuchu węglowym,

2). zmiany spowodowane działaniem tlenu na nienasycone wiązania przy udziale światła i katalizatorów, np. jonów żelaza; w efekcie dochodzi do utlenienia (autooksydacji) tłuszczów i powstania nadtlenków, a następnie aldehydów i ketonów.

W celu określenia niekorzystnych zmian zachodzących w tłuszczach podczas jego przechowywania wprowadzono badanie tzw. liczby kwasowej tłuszczów.

Liczba kwasowa (LK) - jest miarą zawartości wolnych kwasów tłuszczowych powstałych w efekcie hydrolizy acylogliceroli; wyraża się ją jako ilość miligramów wodorotlenku potasu potrzebną do zobojętnienia kwasów tłuszczowych zawartych w 1 g badanego tłuszczu. Liczba kwasowa nie jest wartością stałą dla danego gatunku tłuszczu.

Miarą świeżości tłuszczu jest także jego zachowanie w roztworze węglanu sodu. Tłuszcz zjełczały tworzy trwałą emulsję w roztworze węglanu. Zjawisko to tłumaczy się emulgującymi własnościami mydła utworzonego z węglanu sodu i kwasów tłuszczowych, powstających w procesie jełczenia tłuszczu.

Tłuszcze używane do smażenia zawierają związki polarne, których ilość zależy głównie od temperatury i długości smażenia oraz od ilości wilgoci zawartej w smażonych produktach. Wolne kwasy tłuszczowe (WKT) to jeden ze składników związków polarnych, które w dużym nagromadzeniu są toksyczne. Związki polarne są przyczyną zaburzeń trawiennych, a także odpowiadają za choroby serca, krążenia i zwiększenie ilości zachorowań na nowotwory. Dlatego też ciągła kontrola poziomu wolnych kwasów tłuszczowych jest bardzo ważna dla naszego zdrowia. Tester jakości oleju spożywczego/frytury, LRSM, inaczej nisko zakresowy monitor tłuszczu przeznaczony jest do szybkiej kontroli tłuszczów, stosowanych w procesach głębokiego smażenia. Przy pomocy testu możemy optymalnie wykorzystywać olej nie wylewając go zbyt wcześnie. Tester pozwala na wstępną ocenę zużycia tłuszczu i może być używany do wszystkich rodzajów tłuszczów (zwierzęce, roślinne i mieszane roślinno-zwierzęce), pod warunkiem przeprowadzania badania w temperaturze roboczej (pomiędzy 160 - 180 °C). Test LRSM posiada pozytywną opinię użyteczności do oceny jakości tłuszczu smażalniczego wystawioną przez Instytut Żywności i Żywienia oraz Państwowy Zakład Higieny.

Część doświadczalna

Część I

1. Oznaczanie zawartości fosforu w produktach spożywczych bogatych w tłuszcze.

Mineralizacja

Odczynniki:

1. Stężony H₂SO₄

2. 6 mol/dm³ HClO₄

Wykonanie:

1. Przygotować 4 probówki zawierające do wyboru: lecytynę, makrelę, orzech włoski, olej lniany, olej słonecznikowy, oliwę z oliwek, margarynę, masło (każda z probówek zawiera od 10-20 mg produktu).

2. Do każdej probówki dodać po 0,5 cm³ stężonego H₂SO₄, ogrzewać w piecu elektrycznym w temperaturze 300˚C ok. 20 min. Następnie dodawać kroplami kwas nadchlorowy ( od 2 do 6 kropli) i dalej ogrzewać do momentu uzyskania bezbarwnego roztworu.

3. Probówki ochłodzić do temperatury pokojowej. Rozcieńczyć uzyskane roztwory dwukrotnie poprzez dodanie 0,5 cm³ wody destylowanej. Jedynie w przypadku lecytyny 10X (dodać 4,5 cm³ wody destylowanej).

Oznaczanie fosforu w zmineralizowanych produktach tłuszczowych

Odczynniki:

1. 5% roztwór molibdenianu amonu

2. 0,2% roztwór eikonogenu

3. Stężony H₂SO₄

Wykonanie:

Do czterech nowych probówek skalowanych na 10 cm³ przenieść po 0,5 cm³ rozcieńczonych roztworów a do piątej próbówki (próba ślepa) dodać 0,5 cm³ stężonego kwasu siarkowego. Do wszystkich probówek dodać 5 cm³ wody destylowanej wymieszać, a następnie dodać 0,5 cm³ molibdenianu i 0,5 cm³ roztworu eikonogenu. Uzupełnić wodą do 10 cm³ . Mieszać starannie po każdym etapie! Wszystkie probówki inkubować 20 minut we wrzącej łaźni wodnej, ostudzić. Uzupełnić ponownie do 10 cm³ . Zmierzyć absorbancję przy długości fali 680 nm wobec próby ślepej, zanotować wyniki i odczytać ilość fosforu z krzywej wzorcowej ( patrz punkt 2). Obliczyć jaka jest zawartość fosforu w 100 mg badanych produktów żywnościowych.

2. Wyznaczanie krzywej wzorcowej służącej do oznaczania fosforu

Odczynniki:

1. Wzorzec fosforu (roztwór KH₂PO₄ zawierający 4 μg P/ cm³).

2. Stężony H₂SO_{4 ,}

3. 5% roztwór molibdenianu amonu.

4. 0,2% roztwór eikonogenu.

Wykonanie:

Wykonywać równolegle z punktem 3 (zadanie ilościowe, indywidualne)

Do 11 probówek skalowanych na objętość 10 cm³ dodać kolejno odczynniki według tabeli 1.

Tabela 1

	1, 2	3, 4	5, 6	7, 8	9,10	11
	Ilości dodawanych odczynników w cm^3
Wzorzec fosforu o stężeniu 4 μg/cm^3	0,5	1,5	2,5	3,5	4,5	-
Woda	4,5	3,5	2,5	1,5	0,5	5
Stężony H2SO4	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
5% molibdenian amonu	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
0,2% eikonogen	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5

Po dodaniu każdego odczynnika zawartość probówki należy starannie wymieszać i uzupełnić wodą do objętości 10 cm³, starannie wymieszać i umieścić probówki we wrzącej łaźni wodnej na 20 minut. Następnie probówki wyjąć, oziębić i ponownie uzupełnić wodą do objętości 10 cm³. Zmierzyć absorbancję przy długości fali 680 nm wobec próby ślepej (probówka nr 11).

Odczytane wartości absorbancji (średnie z dwóch równoległych oznaczeń) nanieść na układ współrzędnych, gdzie wartości absorbancji są wyznaczone na osi rzędnych, a ilość fosforu w próbie na osi odciętych (μg P/próbę).

3. Zadanie ilościowe, indywidualne dla każdego studenta

Wykonywać równolegle z punktem 2 (wyznaczanie krzywej wzorcowej)

Do dwóch probówek pobrać po 1 cm³ zadania, następnie po 4 cm³ wody, dodać 0,5 cm³ stężonego kwasu siarkowego. Następnie do wszystkich probówek dodać 5 cm³ wody destylowanej, 0,5 cm³ molibdenianu i 0,5 cm³ roztworu eikonogenu. Uzupełnić wodą do 10 cm³ . Mieszać starannie po każdym etapie! Probówki inkubować 20 minut we wrzącej łaźni wodnej, ostudzić. Uzupełnić ponownie do 10 cm³ .

Zmierzyć absorbancję przy długości fali 680 nm wobec próby ślepej, wyniki zanotować. Korzystając z krzywej wzorcowej (patrz punkt 2) odczytać jakiej ilości fosforu (μg P/próbę) odpowiadają odczytane w kolorymetrze wartości absorbancji. Obliczyć średnią zawartość fosforu (μg P) w zadaniu indywidualnym.

Część II

Badanie świeżości tłuszczu poprzez wyznaczanie liczby kwasowej wybranych produktów tłuszczowych.

Odczynniki

1. 96% etanol

2. 1% fenoloftaleina w etanolu

3. 0,1 mol/dm³ roztwór KOH

Wykonanie doświadczenia

Do 2 kolb stożkowych z odważonym tłuszczem (2g) do wyboru: margaryna, masło, olej, oliwa) dodać 20 cm³ etanolu w celu rozpuszczenia tłuszczu. Następnie dodać 2 krople fenoloftaleiny, wymieszać i miareczkować KOH stale mieszając i dodając pipetą po 50 μl roztworu do uzyskania stabilnej barwy różowej. Zapisać ilość dodanego KOH

Równocześnie w ten sam sposób wykonać miareczkowanie próby ślepej ( 22 cm³ etanolu i 2 krople fenoloftaleiny) i zapisać ilość zużytego KOH.

Obliczenia:

Liczba kwasowa (LK) = 5,611 x (A-B) / C

A- cm³ KOH zużyte do zmiareczkowania próby badanej

B- cm³ KOH zużyte do miareczkowania próby ślepej

C- ilość tłuszczu w gramach

Podać uzyskane wartości liczb kwasowych dla wybranych tłuszczów.

Badanie świeżości tłuszczu - badanie właściwości emulgujących produktów tłuszczowych.

Odczynniki:

0,25% Na₂CO₃

Wykonanie:

Na dwie szalki Petriego nalać po 5 cm³ ciepłego roztworu 0,25% Na₂CO₃ i nanieść po kropli badanego tłuszczu ( do wyboru: margaryna, olej lniany, oliwa z oliwek, masło świeże i masło przeterminowane). Zaobserwować i zanotować zachowanie plam tłuszczu w roztworze węglanu sodowego.

Badanie świeżości tłuszczu - Tester tłuszczu LRSM

Odczynniki:

Test paskowy LRSM

Wykonanie:

Test paskowy LRSM zanurzamy w tłuszczu ( olej świeży i olej wielokrotnie używany) o temperaturze roboczej (pomiędzy 160 - 180°C). Rozkład tłuszczu jest określany pośrednio, poprzez proste zliczenie liczby żółtych pasków. Wraz z rozkładem tłuszczu, stężenie wolnych kwasów tłuszczowych (WKT) wzrasta, powodując zmianę koloru większej liczby pasków na wskaźniku LRSM. Niebieskie pola zmieniają kolor na zółty przy określonych poziomach stężenia wolnych kwasów tłuszczowych. Zakres pomiaru WKT podany jest procentowo od 1% do 2,5%.

Po wykonaniu pomiaru zanotować procentową zawartość wolnych kwasów tłuszczowych w badanych produktach tłuszczowych.

2

7

---