Przedmiot: Kultury tkankowe zwierzęce i roślinne

Semestr 7, Laboratorium

Ćwiczenie 2. Klonogenne systemy testowe.

Ocena przeżywalności/proliferacji komórek klonogennych rosnących w postaci przywartej do podłoża

Hodowle komórkowe służą do badania działania wielu czynników jak: leki, zwłaszcza leki przeciwnowotworowe (cytostatyki), promieniowanie jonizujące, środki chemicznej ochrony roślin, konserwanty, środki kosmetyczne, środki żywnościowe, itp. Bardzo ważny jest np. „skreening” cytostatyków. Jest kilka metod, które służą do oceny zarówno skuteczności działania, jak i niepożądanej toksyczności cytostatyków, poczynając od prostego liczenia komórek, różnicowego barwienia komórek żywych i martwych, poprzez aktywność metaboliczną-test MTT, MTS, do testów apoptozy włącznie. Za standard uważa się jednak klonogenne systemy testowe, bowiem jedynie one odpowiadają na pytanie jaki procent komórek zdolnych do nieograniczonej proliferacji przeżywa działanie danego cytostatyku. Testy klonogenności są także bardzo przydatne do oceny wpływu promieniowania jonizującego na komórki nowotworowe, a także prawidłowe, np. fibroblasty.

Celem ćwiczenia jest wykonanie testu na przeżywalność komórek klonogennych wybranych linii komórkowych (mysie: LLC, NIH, ludzkie HCT116) po poddaniu ich działaniu wybranych cytostatyków np. farmorubicyny. Farmorubicyna jest pochodną adriamycyny i jest inhibitorem topoizomerazy II. (sprawdzić w Internecie!). Jak wykazano powoduje też pęknięcia nici DNA i wywołuje apoptozę.

Materiały:

1. Wyjściowe hodowle komórek: mysie fibroblasty NIH3T3, komórki mysiego raka płuca LLC (Lewis lung carcinoma) lub inne, ludzkie komórki nowotworowe

2. Roztwór trypsyny z dodatkiem wersenianu (Trypsin/EDTA)

3. Podłoże do hodowli komórek (DMEM) z surowicą i gentamycyną

4. Farmorubicyna (roztwory przygotowane przez prowadzącego)

5. Jałowe butelki hodowlane (dla dokonania standardowego pasażu)

6. Jałowe pipety jednorazowego użytku (pojemność 25, 10, 2 ml)

7. Płytki do hodowli komórek (średnica 5 cm)

8. Próbówki wirówkowe a' 15 ml (jałowe)

9. Próbówki eppendorfa

10. Komora Bürkera do liczenia komórek

11. Pipetor

12. Zlewka na zużyte płyny

13. Płyn do dezynfekcji rękawiczek i blatów lub alkohol etylowy 70%

14.Rękawiczki lateksowe jednorazowego użytku i ochraniacze na obuwie

studenci przynoszą własne

Wykonanie ćwiczenia

1. Komórki zebrać za pomocą trypsynizacji, zneutralizować 1 ml DMEM zgodnie z procedurą opisaną w ćwiczeniu nr 1

2. Przenieść do jałowej próbówki wirówkowej o pojemności 15 ml i odwirować (2000 rpm, 3 min. lub 1500 rpm 5 min), usunąć nadsącz

3. Osad komórek zawiesić w 5 ml medium hodowlanego i równomiernie rozproszyć komórki przez pipetowanie

4.Przygotować komorę Bürkera do liczenia (nałożyć szkiełko nakrywkowe i sprawdzić czy jest dobrze przywarte !)

4. Pipetą a' 2 ml (sterylną) lub pipetą automatyczną ze sterylną końcówką pobrać 0,2 ml zawiesiny komórek i przenieść do próbówki eppendorfa (ta nie musi być sterylna)

5. Pipetą automatyczną pobrać dwukrotnie z próbówki eppendorfa po 10 µl zawiesiny komórek i wprowadzić pod szkiełko nakrywkowe kamery Bürkera

6. Liczyć komórki w 10 większych kwadratach, ograniczonych potrójnymi liniami (w 5 kwadratach każdej siatki) zgodnie z procedura poznaną na ćwiczeniach w 2-semestrze lub na wykładzie

Przypomnienie: objętość zawiesiny komórek znajdująca się w 10 kwadratach wynosi 1µl, zatem suma komórek pomnożona przez 1000 stanowi liczbę komórek w 1 ml badanej zawiesiny

7. Przygotować 5 ml zawiesiny komórek rozcieńczonej tak aby w 1 ml znajdowało się 100 000 (czyli 500 000/5ml)

8. Przygotować roztwory farmorubicyny w medium hodowlanym zawierające: 0,2µg/ml, 0,5µg/ml, 1µg/ml, 2µg/ml (prowadzący ćwiczenia). Są to roztwory dwukrotnie bardziej stężone niż ostatecznie wymagane stężenie, ale po zmieszananiu z komórkami stosunku 1:1 będą właściwe.

9. Z zawiesiny komórek (dobrze wymieszanej) pobrać 5 x po 1 ml i przenieść do 5 jałowych próbówek a' 15 ml. Wcześniej próbówki opisać jako:

K (Kontrola)

0,1 µg Fb,

0,25 µg Fb

0,5 µg Fb

1,0 µg Fb

10. Do próbówki K dodać 1 ml medium hodowlanego, do pozostałych próbówek dodać po 1ml roztworów farmorubicyny przygotowanych wcześniej przez prowadzącego. Inkubować komórki przez ½ godz. lub 1 godz. jeżeli czas pozwoli, bowiem na wykonanie dalszych etapów ćwiczenia po inkubacji z Fb potrzeba jeszcze ~1 godz.

11. Po inkubacji komórki odwirować (także kontrolne) i usunąć nasącz

12. Osady komórek zawiesić w 1 ml medium; zakładamy, że z tych 100 tysięcy nic nie straciliśmy w trakcie wirowania, czyli będzie 100 000 /ml.

14. Przygotować po 2 płytki (średnicy 5 cm) dla każdej grupy doświadczalnej i odpowiednio opisać:

na 2 płytkach grupy kontrolnej napisać K 200 i K 500, oznacza to liczbę komórek jakie będziemy posiewać;

- na płytkach doświadczalnych napisać odpowiednio:

1. Fb 0,1µg, 500 komórek, Fb 0,1µg 1.000 komórek

2. Fb 0.25 µg 5000, Fb 0,25 µg 10.000 komórek

3. Fb 0,5 µg 10 000, Fb 0,5µg 20.000 komórek

4. Fb 1,0 µg 20 000, Fb 1,0 µg 50,000 komórek

15. W identyczny sposób opisać próbówki

16. Obliczyć w jakiej objętości badanej zawiesiny komórek znajdują się wymagane ilości (200, 500, 1000, 5000 i 10.000, 20.000 i 50.000) i ile należy dodać medium hodowlanego do każdej próbówki aby razem z odpowiednią objętością komórek było 5 ml.

17. Odmierzyć odpowiednie ilości medium do właściwych próbówek i dodać do każdej odpowiednie ilości zawiesiny komórek !!! (Ważne, żeby nie pomylić próbek).

18. Tak przygotowane w próbówkach zawiesiny komórek wylewać (po opaleniu próbówek) na odpowiednie płytki

19. Wstawić do inkubatora CO₂ i inkubować przez 7-14 dni.

Wzrost kolonii z pojedynczych komórek ocenić po 7 dniach pod mikroskopem i inkubować dłużej jeśli kolonie nie są dostatecznie duże, lub utrwalić i wybarwić do liczenia jeżeli kolonie zawierają co najmniej 50 komórek (wynik 4~5 podziałów świadczy o zdolności do nieograniczonej proliferacji).

Uwaga: Wymaga to przyjścia przynajmniej 1 osoby z sekcji do sprawdzenia, czy kolonie są dostatecznie duże już po 7-8 dniach inkubacji i ewentualnego utrwalenia komórek. Dalszy ciąg procedury (barwienie, liczenie) wykonywany będzie za 2 tygodnie, na kolejnych ćwiczeniach laboratoryjnych.

Proces utrwalania zależy od czasu niezbędnego do uformowania makroskopowo widocznych kolonii (różny dla różnych linii komórkowych).

Procedura utrwalania i wybarwiania kolonii (po 7-14 dniach)

1. Zlać medium z płytek (uważać aby nie pomieszać płytek z różnych grup dlatego na wieczku i denku płytki trzeba postawić ten sam znak np. literę lub cyfrę), nie płukać!

2. Do każdej płytki dodać po 2-3 ml 96% alkoholu etylowego i utrwalać przez 10 min.

3. Ostrożnie zlać alkohol (uważać aby nie rozmyć napisów)

4. Do każdej płytki wlać około 5 ml wody destylowanej i pozostawić na 3 min.

5. Zlać wodę z pływającymi agregatami białka i jeszcze raz wypłukać płytki wodą destylowaną.

6. Zadać płytki 0,2 % roztworem wodnym fioletu krystalicznego (~2 ml) i pozostawić na 5 minut.

7. Płytki dobrze wypłukać wodą destylowaną, osuszyć na bibule i zamknąć.

8. Płytki przechowywać zapakowane w folię aluminiową w szafie chłodniczej, a liczenia kolonii dokonać na kolejnych ćwiczeniach

Uwaga: utrwalanie i barwienie wykonujemy w laboratorium

BKiGO.

Na podstawie wyników wykreślić krzywe przeżywalności komórek w zależności od stężenia farmorubicyny i przesłać sprawozdanie prowadzącemu ćwiczenia.

2

---