Opioidy i CREB (działanie opioidów na CREB)

Abstract. Ca2+ / cAMP odpowiadające za wiązanie białek (CREB) jest ważnym czynnikiem łączenia regulowanego opioidami wtórnego przekaźnika do zmian ekspresji genów. Opioidy regulują poziom CREB, jest to fosforylacja i łączenie właściwego elementu odpowiedzi w promotorach kilku genów zamieszanych w lekomanii/narkomanii. CREB pośredniczy w akcji opioidów w ekspresji kilku genów w regionach mózgu odpowiedzialnych zazachowanie poszukiwania narkotyków/leków i manifestację znaków zależności. Ponadto, przemiany w poziom CREB mogą wywierać wpływ na dające satysfakcję właściwości morfiny oraz regulację własnej administracji (zarządzania) kokainy. W komórkowym poziomie CREB zachowuje/ą (?) się jak zbieżny punkt dla różnych szlaków komórkowych. Opioidy mają wpływ na dwa różne wewnątrzkomórkowe systemy przekaźnikowe: hamujące - połączone z cAMP oraz stymulujące - zawierające wapń i szlak PKC. Oba typy mediatorów mogą wpływać na CREB, ale w różnych etapach działania (akcji) opiatów. Obecność tego dwufazowego mechanizmu może tłumaczyć zjawisko indukcji niektórych CRE-kontrolowanych genów po ostrym i przewlekłym podawaniu morfiny. Badania komórkowe pokreślają również znaczenie innych członków rodziny ATF/CREB, które Ca2+/cAMP mogą wpływać na element kontroli transkrypcji tak samo jak inne czynniki transkrypcyjne, które robią indukcję opioidów bardziej trwalszą.

Wstęp

Duże zainteresowanie skupiło się na molekularnych zaburzeniach, które mogą przyczynić się do patofizjologicznych (zmian ?!) po leczeniu opiatami. Dobrze jest wiedzieć, że opioidy działające na receptory opioidowe (połączone z klasami Gi/G0 białek G) ostro hamują tworzenie cyklicznego AMP (cAMP), przewodnictwo Ca2+ i aktywację przewodnictwa potasu, co prowadzi do hiperpolaryzacji komórek. Hiperpolaryzacja ustępuje z czasem i poziom cAMP jest znormalizowany, a następnie podniesiony powyżej linii podstawowej. Zmiany wywołane przez indukcję opiatów w aktywacji kinazy białkowej prowadzi do zmian w fosforylacji białek istotnych dla sygnalizacji opioidów i do zmian ekspresji CREB (wapń/cAMP odpowiedź ?? element wiązania białka), które może być ważne w rozwoju i wyrazem uzależnienia od opiatów.

CREB istnieje w trzech alternatywnie splecionych izoformach: CREB-α i CREB-δ różniące się w 14. segmencie aminokwasowym (??), i CREB-β. Izoform CREB-β stanowi 80-90 % białka ogólnego CREB w mózgu. CREB-β wyraża się wszędzie i ten izoform może zrekompensować częściowo utratę CREB-α i CREB-δ po usunięciu CREB z genomu myszy (CREB-knockout; knockout - usunięcie genu z genomu) (Blendy i in. 1996, Glazewski i in. 1999).

Aktywność CREB jest regulowana przez fosforylację w odpowiedzi na różne sygnały.

Wzrost wapnia lub cAMP w rezultacie fosforylacji seryny w domenie indukcyjnej kinazy (KID) w pozycji 133 (Ser133). Ostatnie dane sugerują, że sama fosforylacja CREB nie zmienia struktury drugorzędowej CREB; a raczej fosforylacja tworzy wysokie powinowactwo do innych białek. W szczególności fosforylacja Seryny (Ser 133), promuje interakcję CREB z domenami KIX z koaktywatorów białka wiążącego CREB (CBP) i P300. Wiązanie CBP powoduje interakcję CREB z podstawowym transkrypcyjnym czynnikiem TFIIB i TFIID i tym samym inicjuje indukcję genów CRE-zależnych. CREB pośredniczący w transkrypcji jest uważany za krytyczny różnie adaptacyjnych odpowiedzi neuronalnych/neuronowych. Okazało się to ważne dla pamięci i uczenia się w szereg systemów (może chodzi o różny sposób). Zakłada się, że generowanie mutacji myszy to molekularne narzędzie do badania istotności CREB in vivo.

Myszy całkowicie pozbawione CREB nie są żywe/opłacalne.

Myszy pozbawione izoformów CREB-α i CREB-δ są żywotne i nie pokazują pogorszenia w rozwoju chociaż doświadczają utraty pamięci długotrwałej. U myszy bez izoformów CREB-α i CREB-δ następuje mocna redukcja rozpoczynanych przez nalokson (antagonista receptorów opioidowych) zachowań cofających i niski spadek tolerancji, ale nie zachodzą żadne zmiany w odczuwaniu bólu ani w gęstości receptorów opioidowych. Jednakże istnieje wiele mechanizmów rekompensujących taką mutację (np. wzrost CREB, CREB-β i ATF-2). Ponadto niedobór CREB występuje we wszystkich tkankach, sprawiając że dokładne określenie funkcji CREB jest bardzo trudne.

Dalsze badania składają się z analizy ekspresji CREB w regionach mózgowych wskazującej na uzależnienie od opiatów. Zaproponowano że rolą CREB będzie mediacja ekspresji genów w odpowiedzi na opioidy na podstawie obserwacji, które ukazały że administracja opioidów wpływa na niektóre komponenty szlaku cAMP. Ta teza została potwierdzona przy badaniach szczurów uzależnionych od kokainy, w których transkrypcja przeprowadzona przez zwiększoną ilość CREB w jądrze półleżącym przeciwdziała satysfakcjonującemu działaniu kokainy i na odwrót, nadekspresja dominującego, negatywnego mutanta CREB w jądrze półleżącym doprowadziła do wzrostu dającego satysfakcję efektu kokainy.

ZAANGAŻOWANIE CREB W DZIAŁANIU OPIATÓW W MÓZGU

Jądro półleżące

Regionem mózgowym zaangażowanym we wzmocnienie właściwości opiatów i możliwych długoterminowych zmian motywacyjnych powiązanych z uzależnieniem od opiatów jest jądro półleżące. Morfina powoduje wzrost wydzielania dopaminy w jądrze półleżącym. Zasugerowano, że morfina działa na inhibitory µ receptorów opiatowych umieszczonych w neuronach wtrąconych GABA (które też są inhibitorami) w istocie czarnej śródmózgowia i w polu brzusznym nakrywki. Prowadzi to do braku zahamowań neuronów dopaminy w tych regionach mózgu, wzrost wypalania neuronów dopaminy i wywołania dopaminy w prążkowie i jądrze półleżącym. Nie istnieją badania

ukazujące bezpośrednio wpływ administracji opiatów na aktywność neuronów lub na system cAMP w jądrze półleżącym. Opiody nie mają wpływu na poziom białek CREB w jądrze półleżącym. Jednakże, receptory µ-opioidowe morfiny indukują białka c-Fos i AP-1 związane w prążkowiu i NAc (jądro półleżące). Promotor c-Fos jest znany z posiadania elementów CRE i SRE, reagujących na cAMP i Ca2+ i koaktywacja obu tych elementów jest potrzebna do indukcji Fos w pojedynczych prążkowych komórkach (albo w komórkach tego prążkowia). To się zgadza raczej z obserwacja poziomu fosforylacji CREB niż poziomów CREB odpowiedzialnych za aktywność CREB. Funkcjonalnym związkiem z CREB było zademonstrowanie przez zniesienie zdolności narażenia, że kokaina zaindukuje c-Fos przez administrację antysensownych (o nici kw. nukleinowego) oligonukleotydów w tym rejonie mózgu. Indukcja c-Fos po morfinie pokazała bycie pośrednią przez dopaminę i glutaminian, przypisywanych odpowiednio do striatum/NAc z SNc/VTA i kory.

W długotrwałym leczeniu morfiną również prowadzi do ważnej indukcji kilku komponentów szlaku cAMP (poziom cyklazy adenylanowej i aktywności PKA, poziomu c-Fos, AP-1 wiązania DNA), ale też do zmniejszania innych (poziom Gαi) w NAc. Z uwagi na obserwowane zwiększenie regulacji szlaku PKA w NAc powinniśmy oczekiwać, że CREB jest też regulowany przez długotrwałe leczenie morfiną. W rzeczywistości, tak było, ale poziomy/stężenie całkowitej immunoreaktywności CREB zmniejszyły się w NAc. To uderzające, ale przewlekłe/długotrwałe zmniejszenie morfiny całkowitego poziomu CREB może być uważane za mechanizm wyrównujący do podniesienia fosforylacji CREB spowodowanego przez nadregulację ?? (upregulation) szlaku PKA. Odstąpienie od morfiny wywołało gwałtowny wzrost c-Fos i AP-1 oraz, z uwagi na wiążące się z tym zmniejszenie całkowitego poziomu CREB, szybką indukcję najwyraźniej zależną od zwiększonej aktywności CREB. Jest to kolejną zagadką, że c-Fos jest indukowane NAc podczas ostrego i przewlekłego leczenia morfiną, jak również podczas wycofanie morfiny. Jednym z możliwych wyjaśnień jest to, że obserwowano indukcję c-Fos u różnych populacji neuronów, a inną możliwością jest to, że indukcja odbywa się za pośrednictwem różnych mechanizmów. Ta ostatnia (druga) możliwość może polegać na aktywacji CREB w każdym przypadku: po ostrym lub przewlekłym podawaniu morfiny albo w trakcie jej wycofywania.

Locus coreuleus (miejsce sinawe - jądro pnia mózgu, położone z tyłu mostu)

Regulacja opiatów CREB była również dogłębnie przeanalizowana w miejscu sinawym - główne jądro noradrenergiczne w mózgu, zaangażowane w kontrolowanie uwagi i aktywności autonomicznego układu nerwowego. Miejsce sinawe (LC) jest również ważne w fizycznym uzależnieniu od opiatów oraz ich w ich wycofaniu. Ostro, opiaty hamują wypalanie neuronów w LC w części przez hamowanie cyklazy adenylanowej i zależnej od cAMP fosforylacji białka. Ostre działanie opiatów powoduje również spadek stanu fosforylacji bez wpływu na poziom białka całkowitego. W związku z tym poziom ekspresji c-Fos zmniejszyły się w LC u szczurów ostro leczonych morfiną. W przeciwieństwie do długotrwałej up-regulacji opiatami systemu cAMP w tych neuronach, z zaobserwowanym wzrostem w poziomie podjednostek białka G, cyklazy adenylanowej, aktywności cyklazy adenylanowej, PKA i w poziomach hydroksylazy tyrozynowej. Spontaniczne, szybkie, wypalanie neuronów LC w plasterkach mózgu, jest również zwiększone przez uprzednie długotrwałe podawanie morfiny.

Długotrwałe podawanie morfiny potwierdziło wzrost całkowitego poziomu immunoreaktywności CREB w LC. Ta regulacja CREB była zaskakująca, ponieważ ekspresja CREB, szczególnie w mózgu, jest generalnie uważana za konstytutywną. Wzrost immunoreaktywności CREB był związany z równoważnym wzrostem CRE wiążącego. Jednakże, leczeniu stanu morfiną, mimo up-regulowanego systemu cAMP, fosforylacja CREB zmniejszyła się do poziomów kontroli, prawdopodobnie ze względu na hamowanie układu przez ciągłą ekspozycję na opiaty. W rezultacie, poziomy c-Fos u szczurów leczonych przewlekle morfiną, zmniejszyły się wzdłuż fosforylacji CREB. Warto zauważyć, że wśród cyklazy adenylanowej, tylko rodzaje/typy VIII i I są up-regulowane przewlekłym podawaniem morfiny, podczas gdy kilka innych typów nie jest dotkniętych (morfiną chyba). Te formy cyklazy adenylanowej są aktywowane przez Ca2+ i tylko średnio aktywowane przez Gαs. Po wytrąceniu opioidów, wycofywanie się up-regulacji układu cAMP przyczynia się do dramatycznego wzrostu wskaźnika wypalania w LC, wzrostu fosforylacji CREB i 2 - 3-krotny wzrost poziomów mRNA i białek na c-Fos.

Związek funkcjonalny CREB w uzależnieniu od narkotyków: antysens nadejścia oligonukleotyów

Z powodu braku specyficznych inhibitorów udowodniono trudność w zdeterminowaniu roli wskaźnika transkrypcji konstytutywnej in vivo. Zastosowanie antysensownej strategii oligonukleotydowej do specyficznego obniżenia poziomów CREB przezwycięża ten problem w pewnym stopniu. Funkcjonalne konsekwencje morfiny wywołującej CREB w LC były badane poprzez podawanie w zastrzykach antysensownych oligonukleotydów przeciwko CREB mRNA. U szczurów pod wpływem narkotyków (drug-naive, nark. naiwne?), zastrzyk antysensownych oligon. zredukował immunoreaktywność CREB w LC poddanych zastrzykowi w porównaniu do kontroli bez zastrzyku (Lane-Ladd i inni 1997). Takie zastrzyki również wywołują redukcję na poziomach podstawowych typu VIII i I cyklazy adenylowej, katalitycznych i II typie regulatorowych podfrakcji PKA, hydroksylazy tyrozynowej, brak efektu w III i IV typie cyklazy adenylowej i Galfa-i(cokolwiek to jest). W ten sposób aplikacja antysensownych oligonukleotydów CREB redukuje podstawowy poziom kilku, ale nie wszystkich, komponentów ścieżki PKA. Ta ścieżka jest górnie regulowana w podążającym za LC chronicznym leczeniu morfiną. Jednakże , w tych genach CREB był ukazany jako działający jak CRE bez promotora genu hydroksylazy tyrozynowej (Lazaroff i inni 1995). Promotory innych regulowanych genów jeszcze nie zostały wyizolowane (typ VIII cyklazy adenylowej) lub braku funkcjonalnego CREs ( PKA, typ I cyklazy adenylowej). Jednak, antysensowny oligonukleotyd CREB blokował wywoływaną przez morfinę górną regulację typu VIII cyklazy adenylowej i hydroksylady tyrozynowej a także kompletnie nie dopuszczał do wywołanego przez morfinę wzrostu w spontanicznie strzelających proporcjach LC neuronów. Z drugiej strony I typ cyklazy adenylowej i górnej regulacji PKA nie były udawane przez antysensowny olig. CREB u zwierząt leczonych morfiną pomimo znaczącej redukcji ich podstawowego poziomu u zwierząt na haju (te naive szczury:D).

Zastrzyki antysens. oligon. także znacząco złagodziły znaki pewnych zachowań świadczących o wycofywaniu się (z nałogu) [ szczękanie zębami, otrzepywanie się , irytacja, opadanie powieki, bezcelowe żucie] ale nie innych [piloerekcje, łzawienie, ślinienie, utrata wagi]. Większe złagodzenie tych zachowań zostało zauważone 15-30 minut po przyspieszonym odzwyczajaniu się niż podczas pierwszego kwadransu, kiedy syndrom odzwyczajania się jest najbardziej wymawiany (Lane-Ladd i inni 1997). To sugeruje, że CREB może być odpowiedzialny za drugą neuroadaptację do ciągłej aktywności ścieżki cAMP w LC podczas odzwyczajania się.

W antysensownych oligonukleotydach NAc przeciwko CREB, dolno regulowane poziomy białek CREB mają podobny efekt zewnętrzny do chronicznego przyjmowania morfiny. Także Galfai i poziomy katalitycznych podfrakcji PKA były zredukowane poprzez administrację antysens. oligon. w NAc. Chociaż antysensownie wywoływana redukcja Galfai przypominała z wyglądu akcję chronicznej morfiny na CREB , ich efekty na PKA były przeciwne. Jest to ważne,ponieważ PKA fosforyzuje CREB do Ser (Gonzalez i Montminy 1989).

Powyższe dane wskazują że chociaż antys. oligon. przeciwko CREB redukują poziom białek CREB w NAc i LC, ich specyficzne działanie na żądania celów CREB jest raczej niejasne. Po pierwsze, antysensowne oligon. przeciwko CREB zmniejszają podstawowe, ale nie wywoływane przez morfinę poziomy cyklazy adenylowej I typu i katalizę oraz regulatorowe podfrakcje PKA, których promotory genowe wybrakowują funkcjonalne elementy CRE.

Po drugie, antys. oligonukl. Przeciwko CREB redukują poziom Galfai w NAc, ale nie w LC, ale powód tego jest nieznany. Po trzecie, w stanie nieufosforylowanym, CREB może łaczyć DNA, ale nie aktywuje transkrypcji. Mutacja cząsteczki CREB przez substytucję (podstawienie) Ser zamiast Ala jest potencjalnym dominującym negatywnym represorem zależnej od CREB ekspresji genu zarówno in vivo jak i in vitro (Faentzke i inni 1998). Aktywność CREB jest regulowana poprzez fosforylację i nieufosforylowany CREB w pewnym wypadku może nawet działać jako represor transkrypcji genów (Vallejo 1995). Efekt antys. oligon. CREB na wskaźniki regulowane poprzez chroniczne leczenie morfiną są zebrane w Table I (gdzieśtam w oryginalnym artykule, poszukajcie;) )

Związek funkcjonalny administracji antys. oligon. CREB został zademonstrowany poprzez obalenie zdolności do ostrego wpływu kokainy na wywoływanie c-Fos w NAc i LC. Ponadto , wewnętrzne zastrzyki -Nac antysensownych oligonukleotydów CREB powodowały krótkotrwały spadek samo-administracji kokainy. Podobnie, nadekspresja CREB w tym regionie zmniejszala się, podczas gdy, odwrotnie, nadekspresja w negatywnie dominującym mutancie CREB zwiększała nagradzające efekty kokainy. Creb reguluje ekspresję dynorfin w NAc. Zmieniona transkrypcja dynorfin podobnie wspiera regulacje poziomów CREB zwiększonych efektów kokainy (Carlezon i Inni 1998). Jednakże ta koncepcja pozostaje w niezgodzie z zanotowaną redukcją poziomu CREB w NAc po chronicznym leczeniu morfiną z równoczesnym wzrostem prodynorfin, jest to peptyd alfa-noendorfinowy i c-fos(geny regulujące CREB) (Nye i Nestler 1995, Przewłocka 1996, Nylander 1997). Jednym możliwym wyjaśnieniem jest to, że zmiany w poziomach CREB mogą nie być łątwo przypisane do jego fosforylacji, chociaż fosforylacja jest ważna dla kontroli innych genów i może być niezależna od poziomu CREB. Innym wyjaśnieniem może być to, że CREB tak samo jak CRE łączy receptory opioidowe przez ogólne ATF/CRE wskaźniki transkrypcji do zmiany w celowej ekspresji genów.

Badania komórkowe

Aktywacja CREB w mózgu zależy w dużej mierze od unerwienia badanych struktur (Liu i Graybiel 1998). NAc otrzymuje wkład od kilku struktur limbicznych w tym ciała migdałowatego (cz. Układu limbicznego), hipokampu i limbicznej kory przedczołowej. Te towarzyszące ukł limbicznemu obwody tak dobrze jak obecność różnych nauronalnych populacji powodują, że ocena związku CREB jest bardo skomplikowana. Ponadto badania nad fosforylacją CREB w mózgu wymagają rozwoju specjalistycznych technik , którye nie bezpośrednio mierzą fosforylację CREB ( Guitart i inni 1992). Główny efekt opioidów na regulację CREB i jego fosforylację został zbadany w NG108-15 neuro-blastomie x komórek glejowych (Bilecki i inni 2000). Połączenie tych komórek zostało założone jako komórkowy model dla badań efektów opioidów i kilku fenomenów działania opioidów na mózg. Molekurarne mechanizmy tolerancji, zależności i odzwyczajania się podstawa działania opioidów na komponenty ścieżki cAMP były jakos pierwsze zauważone w tych komórkach. Ostra morfina, przez receptory delta-opioidowe, uwidacznia się stymulując fosforylację CREB, ale nie całkowity poziom CREB w tych komórkach. Ta stymulacja wymaga Ca2+/kalmoduliny i aktywacji kinazy proteinowej C, ale nie ma wpływu na `duszoną' przez morfinę ścieżkę cAMP. Wzrost poziomu ufosforylowanego CREB był wspierany przez indukcję w poziomach c-Fos, efekt blokowany przez inhibitory Ca2+/kalmodulinowych kinaz proteinowych C, co sugeruje, że CREB pośredniczy w obserwowanych efektach.Ponadto stymulowane przez opioidy poziomy c-Fos pozostają na wysokości przez dłuższy okres czasu(do 6h) niż poziomy ufosforylowanego CREB (do 3h). To sugeruje, że c-Fos może powodować, że ostra stymulacja opioidowa długo się kończy. Długotrwałe (do 5 dni) leczenie morfiną redukuje ufosforylowany CREB i obniża poziom c-Fos do poziomu kontrolnego. Dla kontrastu nagłe odzwyczajanie się (odwyk) indukuje głębokie poziomy fosforylowanego CREB i c-Fos w tych komórkach. To wskazuje, że opioidy mogą udawać dwa różne wewnątrzkomórkowe systemy mediatorowe: inhibicja- związana z cAMP i stymulacja- zawierająca wapń i ścieżkę PKC, udawanie CREB w różnych fazach działania opiatów. Podobnie do wzrostu wskaźników sygnałowych, Ca2+ może również aktywować mitogenowo aktywowaną kinazę proteinową (MAPK) (raczej jej ścieżkę) (Finkbeiner in Greenberg 1996), co zostało ukazane w pośrednictwie fosforylacji CREB w odpowiedzi na napływ Ca2+ i aktywację PKC w oligodendrocytach komórek prekursorowych (Pende i inni 1997. Odkryto, że w komórkach NG108-15 mitogenowo aktywowana ścieżka kinazy proteinowej (MAPKs) jest aktywowana przez stymulacje delta-opioidowych receptorów. Ten wzrost poziomów ufosforyklowanego MAPKs był krótkotrwały (5-20min) i podobny do fosforylacji CREB zawierającej PKC i ani cAMP ani cGMP zależne ścieżki kinazy proteinowej. Dlatego MAPKs może także wspierać indukcję fosforylacji CREB podążającej za leczeniem opioidami tak dobrze jak indukcja syntezy c-Fos. Ponadto ich stymulacja przez ostre opioidy umacnia istnienie aktywatora wewnątrzkomórkowego systemu sprzężonego z delta-opioidowymi receptorami i zawierającego Ca2+. Niedawne dane pochodzące z neuronów CNS tubylców także wykazały, że aktywacja receptorów opioidowych może zwiększać kilka komponentów neuronalnej ścieżki sygnalizacji Ca2+ i w konsekwencji uwydatniać wewnątrzkomórkowe sygnały Ca2+ (Przewłocki i inni 1999).

Ze względu na fakt, że działanie przeciwbólowe i uzależnienia morfiny są związane głównie z μ receptorami, model zawierający μ receptory (komórki Neuro2a, transfekowane ze sklonowanych μ receptorów Neuro2a MOR) był również badany. Morfina działając poprzez μ receptory opioidowe indukuje ostrą fosforylację CREB w Neuro2a komórek MOR, ale efekt ten był krótszy (15-45 min.) i słabszy od stymulacji obserwowanej w NG108-15 komórek. Podawanie ostrych opiatów (morfina, endomorphin-1, DAMGO) również wzrosły wiązania konsensusu CRE i AP-1 elementów w Neuro2a komórek MOR. Poziom białka CREB nie wpłynął istotnie na bymorphine i dlatego CREB wiąże CRES niezależnie od jego stanu dimeryzacji (Waeber i Habener 1991, Richards i wsp. 1996). wskazuje na to udział innych czynników możliwe ATF-2: ATF-2 lub ATF-2 : c-Jun dimerów. Wiązanie tych czynników do różnych motywów CRE jest podobne lub silniejsze niż CREB, a ich siła wiążąca DNA in vitro koreluje z ich zdolnościami do transaktywacji (Benbrook i Jones 1990). Zaobserwowano towarzyszący wzrost aktywności CRE wiążące DNA 40-60 min. po leczeniu morfiną, wskazują na to wtórne dostosowywania prawdopodobnie zależnych od nowo syntetyzowanych czynników.

Ryc. 3. Schematyczne przedstawienie mechanizmów związanych z działaniem chronic opiate na fosforylację CREB na poziomie komórkowym., leczenie chronic opiate prowadzi do wyrównawczej aktywacji cAMP szlaku fosforylacji CREB jednak pozostaje bez zmian, prawdopodobnie z powodu aktywacji jądrowej fosfatazy białkowe. B, wycofanie głęboko cAMP aktywuje szlak i powoduje napływ Ca2 +, które z kolei zwiększają fosforylację CREB i aktywację genów docelowych (np. c-Fos).

wzrost AP-1DNA środka oślepiającego, osiąga maksimum
w 15 min potem spada powoli przez kilka godzin do poziomu podstawowego. Opioidy aktywują receptoryυ opioidowe zaliczane do krótkotrwałych (5-10 min) fosforylacja
szlaku MAPK, które może nie tylko przyczynić się do
fosforylacji CREB ale także prowadzi do indukcji c-fos i przyczynia się do wzrostu aktywności AP-1DNA.(Rys. 1).
Długotrwałe, do 5 dni leczenia morfiną znormalizowane
z powrotem do podstawowego poziomu c-Fos, AP-1 i CRE
DNA środka oślepiającego aktywuje i lekko obniżyła poziom
fosforylowanego CREB i MAPK. Tłumienie wpływu opioidów na te czynniki może leżeć u podstaw molekularnych (podstaw tolerancji) (ryc. 3A). Mycie morfiny lub stosowanie antagonistów opioidów wywołane
odstąpienie od obu NG108-15 i Neuro2aMOR
komórek. Odstąpienie od morfiny wywołało wzrost c-Fos i poziom fosforylacji indukowanych CREB.
CRE i AP-1 DNA osrodek oślepiający aktywują z wieksza siła w kinetyce podobne do ostrego działania opioidu w tych komórkach (ryc. 3B). Z drugiej strony, zmniejszenie
fosforylacji MAPKs powodowane przez synchroniczna morfine
zostało następnie zmniejszone w czasie wycofania. Co ciekawe,
kinetyka wycofuje spadek fosforylacji MAPK. Wywołało wzrost fosforylacji CREB sugeruje ze zaangażowanie w jeden wspolny mechanizm a sa skutki odwrotne.
Aktywacja szlaku cAMP podczas wycofywania się jest najbardziej prawdopodobna i oczywista, ponieważ mechanizm indukcji dróg PKA jest często negatywnym regulatorem dla kaskady MAPK prawie całkowicie zablokowana fosforylacja
MAPK w tych komórkach.Przewlekłe (chroniczne) morfiny
wzrost leczenia i wycofanie fosforylacji
stresu aktywuje kinazy białkowe (SAPKs) znane jako kinazy Jun N-terminal. Ich głównym celem to ze są czynnikami transkrypcyjnymi c-Jun i ATF-2, które mogą tworzyć heterodimery i wiązać się z ementami CR. Ponadto
fosforylacji c-Jun w-1 AP złożonych z SAPKs może zwiększyć aktywność AP-1 DNA (rys. 4).
Wpływ opioidów na CRE i AP-1-regulowany jest przez
ekspresje genów, badano także w komorkach
Neuro2a i MOR transferowano z genami lucyferazy pod kontrolą CRE i AP-1. Ostra Administracja opioidów agonistów DAMGO wzrosła zarówno w CRE i AP-1 kontrolowana ekspresja genu reporter.

Rys. 4. Zaangażowanie aktywowanych mitogenicznie kinaz białkowych
(MAPK) i stres aktywuje kinazy białkowych (SAPKs)
w sygnalizacji opioidów w komórkach z ekspresją receptorów opioidowych.
Opioidy działając poprzez receptory opioidowe (OR) aktywuja MAPK, przyczyniając się do zwiększonej fosforylacji CREB,
i wraz z aktywnym CREB wywołują syntezę c-Fos,
ułatwia to białku-1 aktywatora (AP-1) tworzenie kompleksu. CREB i AP-1 z kolei stymulują aktywację ekspresji kolejnych genów, które mogą być zaangażowane w rozwój tolerancji i uzależnienia. Przewlekłe leczenie morfiną zmniejsza poziom fosforylacji MAPK, prawdopodobnie z powodu kinazy białkowej (PKA), która działa jako negatywny regulator w kaskadzie MAPK.  W przeciwieństwie do morfiny powoduje wywolanie Fosforylacji SAPKs które mogą fosforylować
AP-1 i ATF-2 czynniki transkrypcyjne. Mechanizm ten jest odpowiedzialny za wzrost AP-1 i CREDNA. Opioidy regulują aktywność MAPK i SAPKs.

Stosowanie naloksonowych antagonistów opioidowych wytrąca komórki Neuro2a MOR i wywołuje kontrolowaną ekspresję genu reporterowego.CRE i AP-1. Powyższe ustalenia wyraźnie wskazują, że na poziomie komórkowym głównych opioidowych mediatorów na ekspresję genów oddziaływują Ca2+  i cAMP. W zależności od czasu narażenia na działanie jak i czasu wycofywania opioidów obie drogi są ​​w stanie wywołać
fosforylację CREB, aktywację wiązania CRE DNA, kontrolować wydzielanie genów reporterowych CRE, a także aktywować inne czynniki transkrypcyjne i związane z nimi geny. Ta kaskada zdarzeń tworzy podstawę do ogólnego i długotrwałego dostosowania komórki do aktywności opioidów. Co ciekawe, komórki traktowane morfiną, a następnie hodowane przez kilka dni bez opioidów utrzymują na poziomie fosforylacji CREB jakąś tolerancję na działanie morfiny, podkreślając w tym procesie rolę CREB . Ostatnie badania nad aktywacją CREB w organotypowych kulturach prążkowia  wykazały, że dynamika fosforylacji CREB jest zależna od regionu mózgu. Stworzyło to intrygująca możliwość wykorzystania
różnych poziomów aktywacji CREB do umieszczania różnych neuronowych procesów w różnych obszarach mózgu (Liu i Graybiel 1998). Dane pochodzące z hodowli komórkowych in vivo  mogą wyjaśnić
zjawisko indukowanej ekspresji genów, jak c-fos lub dynorfiny czy podczas ostrego lub przewlekłego leczenia, jak również podczas wycofania.

Streszczenie

CREB jest jednym z najważniejszych czynników łączącym opioidowe wtórne przekaźniki, istotne w zmianie ekspresji genów. Opioidy regulują poziom CREB, możliwe jest to dzięki fosforylacji oraz wiązaniu się z kilkoma promotorami genów odpowiedzialnych za uzależnienie od narkotyków. CREB kontroluje ekspresję
genów zlokalizowanych w mózgu, odpowiedzialnych za chęć poszukiwania narkotyków i manifestację
objawów uzależnienia. Hodowle komórkowe zawierające receptory opioidowe `gamma' i `mi' wykazały wzrost tolerancji i uzależnienia. Z drugiej strony, nasze rozumienie tego procesu może być sztuczne, tzn. gdy na DNA zadziała CRE a nie CREB. Nasze niedawne odkrycie, podkreśla, że ​​nie tylko CREB, ale również inne domniemane czynniki wpływające na aktywność wiązania DNA CRE może mieć kluczowe znaczenie w transkrypcji dostosowania do opioidów. Najnowsze danych dowodzą, że regulacja ekspresji genów przyczynia się istotnie do rozwoju tolerancji i uzależnienia. Jednak szczegółowa wiedza na temat molekularnych
szlaków, w których opioidy wywołują różne zmiany jest jeszcze do odkrycia. Znajomość molekularnych mechanizmów tych procesów stanowiłoby podstawę do opracowania nowych strategii leczenia uzależnienia.

---