Wykład 4 (2006-10-24)

1. Jednostki taksonomii

1) Domena, 2) Phylum, 3) Klasa, 4) Podklasa, 5) Rząd / podsekcja, 6) Podrząd, 7) Rodzina, 8) Rodzaj, 9) Gatunek

2. Podział:

Archea ← Domena → Bacteria ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ phylum 1, 2 phylum 1,2,..., 23

3. Gatunek to podstawowa jednostka taksonomiczna, która obejmuje grupę szczepów, powiązanych genomowo, (co najmniej 70% podobieństwa określonego metodą hybrydyzacji DNA: DNA), wykazujących duże podobieństwo w zakresie wielu niezależnych cech określonych w wysoko wystandaryzowanych warunkach.

Kryterium 70% jest istotne, bo stwierdzono słuszność tej zasady. Kryterium jest słuszne jedynie dla prokariota, a nie dla Eukariota (goryl: człowiek 78% podobieństwa, a nie są tymi samymi gatunkami). Nie można podać uniwersalnej koncepcji dla Prokariota i Eukariota.

Procedura wyróżniania gatunków jest dość skomplikowana, należy:

- wyizolować odpowiednią liczbę szczepów (ok. 20) i zanalizować je

- określić powiązanie ewolucyjne z najbardziej podobnymi gatunkami na podstawie sekwencji 16S rRNA

- określić podobieństwo DNA: DNA wewnątrz grupy danego gatunku, oraz z najbliżej spokrewnionymi i podobnymi znanymi gatunkami. Gatunek obejmuje grupę szczepów wykazującą wysokie, ponad 70% podobieństwo.

4. Szczep to grupa komórek pochodząca z podziału jednej komórki macierzystej. Jeden ze szczepów danego gatunku jest określony jako typowy. Jest to przeważnie jeden z pierwszych izolatów zaliczanych do nowo opisanego gatunku - reprezentant tej jednostki taksonomicznej i nadaje mu nazwę. Powinien być zdeponowany w powszechnie dostępnej kolekcji szczepów. Nie może dojść do żadnej rearanżacji - w obrębie gatunku nie można z niego wyeliminować szczepu typowego. Szczep neotypowy - nowo opisany gatunek szczepu proponowany jako typowy. Po 2 latach od daty publikacji staje się on typowy, o ile nie było sprzeciwu naukowego.

Szczepy mogą się różnić nawet w obrębie danego gatunku.

5. Tworzenie systemu z wykorzystaniem informacji genetycznej związanej z DNA, RNA, aktywnością enzymatyczną.

DNA może być badane całe lub fragment i w ten sposób identyfikowany dany gatunek. Zakres tych metod i danych jest zróżnicowany. Różne techniki stosuje się do rodzin, a inne do gatunków, rodzajów

Stosuje się metody:

- typowanie fagowe

- zymogramy i inne

Różne rodziny różnicuje się różnymi sposobami

- polimorfizm fragmentów restrykcyjnych

- techniki serologiczne

6. Identyfikacja - określanie przynależności wyizolowanych szczepów do gatunków. Identyfikację przeprowadza się na podstawie:

• Oceny mikroskopowej preparatu wybarwionego metodą Grama (kształt, ułożenie, barwa komórki, tworzenie endospor)

• Właściwości biochemicznych i fizjologicznych bakterii

• Morfologii kolonii i wzrostu na różnych podłożach hodowlanych

• Testów immunologicznych (pozwalają określić antygeny, drobnoustroje lub przeciwciała przeciwko nim)

• Typowania fagowego (rozpoznawania przez bakteriofagi specyficznych receptorów występujących napowierzchni komórki bakterii i spowodowanie ich lizy)

• Metod molekularnych

7. Szczepy w obrębie gatunków różnicuje się na:

• Biowarianty (biotyp) - na podstawie różnic w aktywności biochemicznej i fizjologii

• Morfotypy - różnią się morfologią

• Serotypy - różnią się antygenowo

• Patotypy - ze względu na właściwości chorobotwórcze

• Genotypy - wykazują różnice genetyczne

KLON - grupa komórek wykazująca ten sam lub prawie ten sam genotyp

Jest 6 patotypów wywołujących choroby układu pokarmowego wśród Escherichia Coli? Szczepy wykazujące ten sam genotyp to klony. Przy dochodzeniach epidemiologicznych lub ustaleniach rezerwuarów bakterii bez ustalenia genotypowania nie można byłoby stwierdzić czy bakteria zakażająca danego osobnika pochodzi z danego miejsca, (bo tam są te same bakterie). Pacjenci zakażają się florą szpitalną, by określić daną bakterią trzeba zrobić genotypowanie bakterii.

Chorobotwórczość nie jest cechą gatunkową, ale klonalną *. Klony występują w sąsiedztwie człowieka i czasem wywołują epidemie.

8. Technika PCR - badanie fragmentu DNA, zwielokrotnia się go i analizuje.

• Do jednej probówki dodaje się próbkę DNA

• Polimeraza pomaga w amplifikacji DNA, powstają dwie komplementarne nici, dochodzi do denaturacji i rozszczepienia nici

• Występują startery, nukleotydy x4 adenina, cytozyna... +polimeraza

• Primery dołączają się do komplementarnej sekwencji i z udziałem polimerazy dobudowuje się komplementarna nić

• Powstają dwie kopie genu

• Zwielokrotniony fragment można już badać

Pierwsza termostabilna polimeraza została wyizolowana Archebacterii

Technika PCR - reakcja łańcuchowa polimerazy - technika wielokrotnego powielanie odcinków DNA o długości od kilkuset do kilku tyś nukleotydów, wykorzystująca enzym replikujący DNA - polimerazę DNA. T. PCR polega na przeprowadzaniu wielu następujących po sobie cykli syntezy DNA identycznego z powielanym odcinkiem. Pojedynczy cykl składa się z trzech etapów: a) denaturacji powielanego DNA w temp ok. 90^o C, b) przyłączenia do DNA tzw. starterów (primerów), czyli krótkich, jednoniciowych odcinków DNA, które są komplementarne do sekwencji otaczających powielany fragment i stanowią „miejsce startowe” polimerazy, c) replikacji DNA przy udziale polimerazy, w temp 72^o C. wszystkie cykle syntezy przeprowadza się w jednej probówce, gdzie oprócz powielanych fragmentów DNA umieszcza się trójfosforany nukleotydów, (z których powstają nowe cząsteczki DNA), startery oraz polimerazę DNA wyizolowaną z termofilnych bakterii. W czasie replikacji liczba syntetyzowanych fragmentów DNA narasta wykładniczo *w każdym cyklu podwaja się liczba powielonych fragmentów DNA). Pozwala to na uzyskanie ze śladowych ilości DNA w pierwotnej próbce znacznych ilości DNA o takiej samej sekwencji nukleotydów, umożliwiając dalsze badania (np. ustalenie sekwencji).

9. Cechy różniące Bacteria, Archea, Eukariota

Cecha	Bacteria	Archea	Eucariota
Jądro otoczone błoną	-	-	+
Białka histonowe	Nie	Tak	Tak
Mitochondria	-	-	+
Chloroplasty u fototrofów	-	-	+
ER	-	-	+
Ściana kom. z kw. muraminowym	+ (mycoplazmy bez ściany)	-	-
Lipidy błon	Poł. estrowo z kw. tłuszczowym	Poł. estrowo z kw. tłuszczowym	Poł. estrowo z kw. tłuszczowym
Sterole w błonach	Nie (z wyj. Mykoplazm)	-	+
Wakuole gazowe	+	+	-
Tymina w tRNA	Tak	Nie-urydyna/pseudurydyna	Tak
Aminokw Inicjatorowy. w tRNA	N-formylmetionina	Metionina	Metionina
Introny w mRNA	Brak	Niekiedy obecne	Obecne
Ryboz., Stała sedymentacji	70S	70S	80S
Czynnik elongacji 2	Nie zaw dwuftaminy	Zawiera dwuftaminę	Zawiera dwuftaminę
Rodzaj rybosomalnego RNA	16S, 23S, 5S	-||- (różn w sekwencji 16S)	18S, 28S, 5,85S, 5S
Hamowanie syntezy białka przez chloramfenikol	Tak	Nie	Nie
Hamowanie syntezy białka przez anisomycynę	Nie	Tak	Tak
Polimeraza RNA zależna od - liczba enzymów - struktura - wrażliwość na rifampicynę	1 4 podjednostki tak	Kilka 8-12 podjednostek nie	3 12-14 podjednostek nie
Chemolitotrofizm	Niektóre tak	1 gatunek	Nie
Metanogeneza	Nie	Niektóre tak (7 na 9 gr.)	Nie
Wiązanie azotu cząsteczk. N2	Tak	Tak	Nie
Nitryfikacja	Niektóre tak	Nie	Nie
Denitryfikacja	Niektóre tak	Niektóre tak	nie

10. Składniki niezbędne do wzrostu mikroorganizmów (wzrost bakterii rozpatrujemy dwojako - jako wzrost jednej komórki, lub częściej jako wzrost liczby bakterii po rozmnażaniu)

- źródło węgla C, energii, elektronów

- makroelementy: C, O, H, N, S, P, K^+, Ca^2+, Mg^2+, Fe^2+, 3+

- mikroelementy: Mn^2+, Zn^2+, Co^2+, Mo^2+, Ni^2+, Cu^2+

- specyficzne związki, czynniki, Na^2+? U halofili

- czynniki wzrostowe, tj związki organiczne, które są niezbędne, ale organizm ich nie wytwarza: aminokwasy puryny, pirymidyny witaminy np.: biotyna (Leuconostac mesenteroides), B12 (Lactobacillus sp.), kwas foliowy (Enterococcus faecalis), kwas pantotenowy, pirydoksyna, niacyna, ryboflawina, tiamina (Bacillus anthracis)

11. podział mikroorganizmów:

Ze względu na źródło węgla C (odżywianie)

CO2 - autotrofy Związki organiczne - heterotrofy

Ze względu na źródło energii

Światło - fototrofy Utlenianie zw chemicznych - chemotrofy

Ze względu na źródło elektronów

Zredukow. Zw. Nieorganiczne - litotrofy Związki organiczne - organotrofy

12. Podział bardziej szczegółowy od powyższego ↑

Typy metabolizmu		Źródło energii, H/ elektr. i C	Mikroorganizmy
FOTOLITOAUTOROFY		- energia świetlna - nieorg. Źródło H/ē - CO2	Glony, sinice, Bakterie purpurowe i zielone siarkowe
FOTOORGANOHETEROTROFY		- energia świetlna - organiczny dawca H/ē - źródło C zw org/ CO2tez	Bakterie purpurowe bezsiarkowe i zielone bezsiarkowe
CHEMOLITOAUTOTROFY		- energia chem, zw. Org - nieorg. Źródło H/ē - CO2	B. utlen siarkę, B. wodorowe, B. nitryfikujące, B. utleniające Fe^2+
CHEMOORGANOHETEROTROFY		- energia chem, zw. Org - organiczny dawca H/ē - zw. Org źródłem C	Pierwotniaki, grzyby, większość bakterii w tym patogennych.(np. gronkowiec, pałeczki salmonelli, durów)
Prototrofy - wystarczy im 1 związek dający enegię, ē, np Glukoza	Auksotrofy-1zw. im nie wystarczy, muszą dostarczyć więcej tych których nie syntezują

Miksotrofy - organizmy mogące prowadzić metabolizm w zależności od warunków środowiska w sposób zmienny np. Begiatea sp?

4

---