Pawlik Radosław

gr. 036 OSDM

SPRAWOZDANIE

Ćwiczenia z biochemii były poświęcone wykrywaniu białek i aminokwasów charakterystycznymi dla nich reakcjami takimi jak:

• Wykrywanie tryptofanu. Reakcja Adamkiewicza - Hopkinsa. Reakcja Voisenta.

• Wykrywanie argininy.

• Reakcja biuretowa (Piotrowskiego).

• Wykrywanie tyrozyny. Reakcja Milona.

• Wykrywanie aminokwasów aromatycznych. Reakcja ksantoproteinowa.

• Wykrywanie cystyny i cysteiny. Reakcja cystynowa.

• Reakcja z ninhydryną.

• Reakcja Sörensena z aldehydem mrówkowym.

• Wykrywanie metioniny metodą McCarthy.

• Denaturacja cieplna. Denaturacja pod wpływem etanolu oraz stężonego kwasu azotowego.

• Wykrywanie tryptofanu. Reakcja Adamkiewicz - Hopkinsa. Reakcja Voisenta.

Zasada:

Reakcje te polegają na powstawaniu barwnych kompleksów, które tworzy układ indolowy w tryptofanie i jego reszty w różnych substancjach białkowych z aldehydami w środowisku stężonych kwasów. W reakcji Adamkiewicza - Hopkinsa środowisko kwaśne wywołuje dodawany stężony kwas siarkowy, z kolei w reakcji Voisenta środowisko kwaśne wywołuje stężony kwas solny.

Wyniki:

W reakcji Adamkiewicza - Hopkinsa po podwarstwieniu stężonym kwasem siarkowym na granicy dwóch faz pojawia się fiołkowy pierścień. W reakcji Voisenta pojawiło się fiołkowe zabarwienie po dodaniu azotanu sodu.

• Wykrywanie argininy.

Zasada:

Ze względu na swoją czułość reakcja ta jest stosowane do ilościowego oznaczania argininy. Pojawiający się barwny kompleks jest charakterystyczny dla reszt guanidyny występującej w argininie, która w środowisku zasadowym powodowanym przez dodanie zasady sodowej i w obecności bromianu sodu jako utleniacza reaguje z α - naftolem.

Wnioski:

Po dodaniu do roztworu wody bromowej pojawia się natychmiast różowo - pomarańczowe zabarwienie.

• Reakcja biuretowa. (Piotrowskiego)

Zasada:

Reakcja ta jest charakterystyczna dla wiązań peptydowych występujących w białkach i peptydach. W środowisku zasadowym wiązania peptydowe ulegają tautomeryzacji przechodząc w formę enolową. Z takimi ugrupowaniami jony Cu²⁺ tworzą dwa wiązania kowalencyjne z atomami tlenu i cztery wiązania koordynacyjne z atomami azotu. Powstaje w wyniku tej reakcji barwny kompleks, którego intensywność zależy od ilości wiązań peptydowych w badanej substancji.

Wnioski:

Do przygotowanego roztworu dodajemy parę kropel CuSO₄ i pojawia się fioletowe zabarwienie co oznacza, że badana substancja jest białkiem. W przypadku peptydów barwa roztworu byłaby czerwona.

• Wykrywanie tyrozyny. Reakcja Milona>

Zasada:

Reakcja polega na tworzeniu się barwnych kompleksów rtęciowo - fenolowo - nitrozowych. Odczynnik Milona zawiera w swoim składzie Hg₂ ²⁺, Hg²⁺, NO₂^-, NO₃^-.

Reakcji tej ulega zarówno wolna jak i związana tyrozyna.

Wnioski:

Po dodaniu do badanej substancji kilku kropel odczynnika Milona i ogrzaniu pojawiło się czerwone zabarwienie.

• Wykrywanie aminokwasów aromatycznych. Reakcja ksantoproteinowa.

Zasada:

Reakcja ta polega na reakcji nitrowania, której ulegają wszystkie aminokwasy aromatyczne. W wyniku czego powstają nitrowe pochodne o żółtym zabarwieniu, które po zalkalizowaniu zmieniają barwę na pomarańczową.

Wnioski:

Po ogrzaniu badanej substancji z kwasem azotowym a następnie oziębieniu i dodaniu roztworu zasady sodowej roztwór przyjmuje barwę pomarańczową.

• Wykrywanie cystyny i cysteiny. Reakcja cystynowa.

Zasada:

W środowiskach zasadowych z ugrupowania tiulowego cysteiny oraz disiarczkowego ugrupowania cystyny wytrąca się siarka w postaci anionu S^2-. Obecność tych jonów wykryć można przez dodanie do roztworu octanu ołowiu w wyniku czego powstaje siarczek ołowiu, który wytrąca się w postaci czarnego osadu.

Wnioski:

Po zalkalizowaniu roztworów z cystyną i cysteiną, następnie ogrzaniu i dodaniu octanu ołowiu i ponownym ogrzaniu w probówce z cysteiną pojawia się czarny osad, w probówce z cystyna pojawia się również osad z tym że większy.

• Reakcja z ninhydryną.

Zasada:

Reakcja aminokwasów z ninhydryną wykorzystywana jest do ilościowego oznaczania tych związków metodą kolorymetryczną lub metoda gazometryczną. Reakcja przebiega w środowisku kwaśnym w podwyższonej temperaturze. Aminokwasy reagują z nadmiarem ninhydryny ulegając dekarboksylacji i oksydacyjnej deaminacji. W wyniku czego powstaje uboższy o jeden atom węgla od wyjściowego aminokwasu aldehyd. Uwalnia się dwutlenek węgla i wydziela się amoniak. Zredukowana ninhydryna wchodzi w reakcję kondensacji z nadmiarem niezredukowanej ninhydryny i amoniakiem w wyniku czego powstaje barwny kompleks.

Wnioski:

Po dodaniu do badanej substancji roztworu ninhydryny a następnie ogrzaniu pojawia się fiołkowe zabarwienie.

• Reakcja Sörensena z aldehydem mrówkowym.

Zasada:

Jest to prosta metoda ilościowego oznaczania aminokwasów. W roztworach wodnych białka występują w postaci soli wewnętrznych. Co powoduje, że nie mogą one być miareczkowane bezpośrednio zasadami, ponieważ całkowite cofniecie dysocjacji zachodzi dopiero przy pH 12 i jest trudne do określenia z powodu braku wskaźników. Problem ten omija się stosując aldehyd mrówkowy, który reaguje łatwo tylko z grupami NH₂ i tworzy hydroksymetylowe pochodne. W miarę przebiegu reakcji uwalniają się protony co powoduje obniżenie pH do 9, zatem końcowy punkt miareczkowania znajduje się w zakresie zmiany barwy fenoloftaleiny. Pozwala to na stosowanie tego wskaźnika przy miareczkowaniu aminokwasów roztworami zasad w obecności aldehydu mrówkowego i nosi to nazwę „miareczkowania formolowego”. Reakcja przebiega w środowisku zasadowym.

Wniosek:

Przygotowujemy dwie probówki. Do pierwszej dodajemy roztwór glicyny, następnie dodajemy kilka kropel fenoloftaleiny oraz zasadę sodową w takiej ilości aby roztwór zabarwił się na różowo. Do drugiej probówki dodajemy formaldehyd, kilka kropel fenoloftaleiny i tyle zasady sodowej aż pojawi się lekko różowe zabarwienie. Następnie roztwór glicyny wlewamy do roztworu formaldehydu i obserwujemy odbarwienie się roztworu co świadczy o zablokowaniu grup aminowych. Tak przygotowany roztwór miareczkujemy do momentu aż pojawiło się nam różowe zabarwienie.

• Wykrywanie metioniny metodą McCarthy.

Zasada:

W przeciwieństwie do reakcji cystynowej, w której z cystyny i cysteiny w środowisku zasadowym odłączała się siarka, w metioninie siarka jest odporna na działanie zasad. Reakcja odłączania siarki przebiega w środowisku kwaśnym, które jest spowodowane dodanym stężonym kwasem solnym.

Wnioski:

Przygotowujemy dwie probówki. Do pierwszej dodajemy roztwór metioniny, następnie zasady sodowej, kilka kropel nitroprusydku sodu oraz glicynę. Do drugiej probówki zamiast metioniny dodajemy wody destylowanej i jest to tak zwana próba ślepa. Obie probówki ogrzewamy w łaźni wodnej, następnie oziębiamy i dodajemy kwasu solnego co powoduje, że roztwór w pierwszej probówce zabarwia się na kolor różowo - brunatny, co świadczy, że znajduje się w niej metionina. Próba ślepa zabarwia się na kolor żółto - zielony.

• Denaturacja cieplna. Denaturacja pod wpływem etanolu oraz stężonego kwasu azotowego.

• Denaturacja cieplna.

Zasada:

Polega na nieodwracalnych zmianach w strukturze cząsteczek białka i niszczeniu struktur wyższego rzędu. W wyniku koagulacji następuje wytrącenie się białka z roztworu. Wytrącanie się denaturowanych białek ułatwia obecność soli (elektrolitów), których jony obecne w roztworze powodują zobojętnienie ładunku elektrycznego jonów zawiesiny białka.

Wnioski:

Do doświadczenia użyto dwóch roztworów białek. Do pierwszej probówki dodano roztwór białka jaja kurzego a następnie dodano kwasu octowego i ogrzano do wrzenia. Do drugiej probówki dodano roztwór albuminy tu także dodano kwasu octowego i ogrzano do wrzenia. W jednej i w drugiej probówce wytrącił się osad, który zwiększył się po dodaniu NaCl. W probówce z białkiem jaja kurzego zaobserwowano obfitszy osad niż w probówce zawierającej roztwór albuminy.

• Denaturacja pod wpływem etanolu.

Zasada:

Krótkotrwałe działanie etanolu powoduje wytrącanie białka z roztworu, ale nie powoduje denaturacji. Denaturacja zachodzi dopiero po dłuższym czasie jego działania i wyższej temperaturze. Etanol wpływa na zmianę struktury przestrzennej cząsteczek białka. Osłabia wiązania hydrofobowe i reaguje z naładowanymi grupami na powierzchni cząsteczki, co powoduje naruszanie jej „płaszcza wodnego”.

Wnioski:

Do doświadczenia użyliśmy dwóch roztworów: białka jaja kurzego i albuminy. Do dwóch probówek dodajemy roztworu białka jaja kurzego oraz etanolu. W obydwóch wytrąca się osad. Po dodaniu do jednej nadmiaru wody obserwujemy rozpuszczanie się osadu. Drugą pozostawiamy na godzinę. Po godzinie dodajemy nadmiar wody i zaobserwujemy, że wytrącony osad nie rozpuszcza się. To znaczy, że zaszła nieodwracalna denaturacja. Podobnie postępujemy z roztworem albuminy. W pierwszej probówce bezpośrednio po działaniu etanolu wytrącony osad rozpuszcza się w nadmiarze wody. W roztworze pozostawionym na godzinę wytrącony osad nie rozpuszcza się.

• Denaturacja pod wpływem kwasu azotowego.

Zasada:

Reakcja ta ma zastosowanie w badaniu białka w moczu. Kwas azotowy jest jednym z wielu czynników denaturujących białka.

Wnioski:

Do doświadczenia użyliśmy dwóch roztworów: białka jaja kurzego oraz albuminy. Do probówek zawierających te roztwory dodaliśmy kwasu azotowego. Na granicy dwóch roztworów wytrącił się biały pierścień denaturowanego białka.

---