Joanna Jabłońska

Kamila Kalinowska

Szymon Goleniewski

Biotechnologia III r.

Grupa I

Selekcja szczepów. Raport z ćwiczeń.

1. Wstęp.

Szczepami o wartości przemysłowej nazywamy szczepy drobnoustrojów, które posiadają zdolność do wytwarzania określonego metabolitu, którego produkcja na skalę przemysłową jest uzasadniona ze względów ekonomicznych, terapeutycznych lub innych, bądź są w stanie degradować trudno rozkładalne związki, co może mieć znaczenie dla ochrony środowiska. Szczepy przemysłowe powinny cechować się niewielkimi wymaganiami pokarmowymi, być stabilne pod względem cech morfologicznych i fizjologicznych oraz podatne na manipulacje genetyczne. Powinny również produkować lub rozkładać daną substancję z dużą szybkością i wydajnością.

Skrining drobnoustrojów lub produktów ich metabolizmu jest to kompleksowe postępowanie, obejmujące zespół selektywnych zabiegów mających na celu wykrycie i izolację spośród wielu drobnoustrojów bądź metabolitów tych pożądanych oraz wstępną ocenę ich przydatności.

Pozyskanie szczepu o odpowiednich cechach wymaga wyboru właściwego miejsca i pobrania z niego próbek drobnoustrojów. Źródłem szczepów przemysłowych może być każde naturalne środowisko, np. dla szczepów produkujących amylazę są to takie miejsca jak wysypiska śmieci, woda rzeczna, osad czynny w oczyszczalniach ścieków, syfony w zlewach czy produkty spożywcze jak kasza jęczmienna, ryż, kukurydza, jogurty, gnijące ziemniaki oraz odpady przemysłu spożywczego i gorzelniczego.

Przed izolacja czystych kultur często prowadzi się postępowanie wzbogacające próbkę w drobnoustroje stanowiące przedmiot zainteresowania badacza, poprzez stymulację ich wzrostu przy jednoczesnym ograniczaniu namnażania innych. Uzyskuje się to poprzez dobór odpowiednich składników i pH pożywki, ciśnienia osmotycznego, potencjału redoks, temperatury, natężenia światła, natlenienia oraz stosowanie antybiotyków. Dobrym czynnikiem selekcyjnym może także być czas trwania hodowli. Liczebność pożądanych drobnoustrojów można zwiększyć także na etapie, kiedy są jeszcze w środowisku, poprzez umieszczenie w odpowiednim miejscu substancji-wabików lub zadziałanie chemicznymi lub fizycznymi czynnikami powodujących zmniejszenie liczebności innych drobnoustrojów.

W celu izolacji czystych kultur najczęściej rozcieńcza się populację drobnoustrojów w roztworze Ringera, soli fizjologicznej lub odpowiednim podłożu, a następnie ich posiewie na płytki Petriego z pożywką zestaloną agarem. Można stosować różne metody posiewu: redukcyjny, powierzchniowy oraz wgłębny. Inne techniki to m.in. metoda seryjnych rozcieńczeń czy płytek odciskowych Lederberga. Metody te powodują rozproszenie komórek i zwiększają szanse na to, że wyrosłe z nich kolonie będą monokulturami. Można stosować także odpowiednie środki chemiczne i fizyczne, np. detergenty, flotację, sedymentację, filtrację, wirowanie czy technikę aerozolową.

Kultury amylolityczne można różnicować metoda płytkową, na podłożu zawierającym skrobię. Po zalaniu płytki roztworem jodu (odczynnikiem Lugola) wokół kolonii drobnoustrojów wytwarzających amylazy powstają strefy halo, niewybarwione na kolor granatowy, świadczące o rozłożeniu skrobi.

2. Selekcja szczepów amylolitycznych.

Na ćwiczeniach przeprowadziliśmy selekcję szczepów w poszukiwaniu kolonii bakteryjnych produkujących enzym rozkładający skrobię (oraz inne wielocukry) - amylazę (EC 3.2.1.1.).

Materiałami, z których przygotowaliśmy wysiewy były: (i) woda z Wisły, (ii) osad czynny pochodzący z oczyszczalni ścieków oraz (iii) nadgniły ziemniak.

Aby wykonać wysiew tarty na pożywce stałej zawierającej skrobię najpierw przygotowaliśmy szereg rozcieńczeń odpowiednio dla każdego materiału: (i) 4 rozcieńczenia, (ii) 7 rozcieńczeń i (iii) 5 rozcieńczeń, a następnie z trzech ostatnich rozcieńczenia z każdej próbki pobraliśmy 0,1ml i rozprowadziliśmy je sterylną głaszczką na powierzchni pożywki. Każdy wysiew przygotowany był w dwóch powtórzeniach. Po tygodniu przeznaczonym na wzrost kolonii bakteryjnych zostały one policzone, następnie szalki zostały zalane płynem Lugola, dzięki któremu możliwe było odróżnienie szczepów amylolitycznych od tych nieprodukujących amylazy (wokół szczepów amylolitycznych powstawał efekt halo - na zabarwionej na fioletowo pożywce - w wyniku reakcji nierozłożonej skrobi z płynem Lugola, powstawały okrągłe przejaśnienia). W przypadku próby zawierającej szczepy bakteryjne ze zgniłego ziemniaka, rozcieńczenie nr. 4 w jednym powtórzeniu znajdowała się 1 kolonia amylolityczna na 380 (0,26%), w drugim powtórzeniu 7/400 (1,75%), rozcieńczenie nr. 5 - 0/132 (0%) i 0/131(0%)(wysiew z rozcieńczenia nr.3 nie został policzony ze względu na zbyt dużą ilość kolonii bakteryjnych), woda z Wisły dała następujące wyniki: rozcieńczenie 2 - 1/20(5%) i 6/23(26%), rozcieńczenie nr. 3 - 0/3(0%) i 1/4(25%), rozcieńczenie nr. 4 - 0/1(0%) i 0/0(0%), zaś osad czynny: rozcieńczenie nr. 5 - 14/39 (36%) i 3/34 (9%), rozcieńczenie nr. 6 - 1/8 (12,5%) i 1/4 (25%) . Następnie kolonie amylolityczne ( po 6 z każdego środowiska) zostały przeszczepione na skosy pożywki ze skrobią. Na kolejnych ćwiczeniach wybranymi szczepami o najwyższej aktywności amylolitycznej zostały zaszczepione kolby zawierające płynna pożywkę z dodatkiem lub bez skrobi. Na ostatnich ćwiczeniach płynne hodowle zostały przesączone przez filtry membranowe o wielkości porów = 0,22μm w celu oddzielenia komórek bakteryjnych, a przesącz zawierający enzym został przelany do podpisanych probówek i następnie umieszczony w lodówce do czasu oznaczania aktywności amylaz.

3. Porównanie aktywności amylaz bakteryjnych i roślinnych.

W ćwiczeniu porównywana była aktywność enzymów amylolitycznych w zależności od ich pochodzenia, zastosowanego pH oraz poddaniu działania wysokiej temperatury i dużej siły jonowej. Amylazy bakteryjne pochodziły z nadgnitego ziemniaka, z Wisły i z osadu czynnego oraz były one hodowane na podłożu ze skrobią lub bez. Enzymy roślinne natomiast pochodziły z ziarniaków jęczmienia, z których jedna część została poddana kiełkowaniu a druga nie. Roślinne amylazy poddano także działaniu siarczanu amonu oraz wysokiej temperaturze. Jedna z prób zawierała enzym unieruchomiony na nośniku DEAE-celuloza. Każda z prób przeprowadzana była w pH 4,7 oraz 8,5. W celu dokonania oceny aktywności poszczególnych rodzajów amylaz do każdej próby dodano roztwór skrobi oraz płyn Lugola (dający granatową barwę roztworu w obecności skrobi). W zależności od szybkości odbarwienia się roztworu (rozkładu całej zawartości skrobi) przyznawano punkty w następujący sposób:

5pkt- odbarwienie <1min

4pkt- odbarwienie <2min

3pkt- odbarwienie <5min

2, 1pkt- odbarwienie <10min

0pkt- brak odbarwienia po 10 min

Otrzymane wyniki były następujące:

Enzym	pH 4,7	pH 8,5
1. Ziemniak 1 skrobia	0	5
2. Ziemniak 1 bez skrobi	4	5
3. Ziemniak 2 skrobia	1	5
4. Ziemniak 2 bez skrobi	5	5
5. Wisła skrobia	1	5
6. Wisła bez skrobi	2	5
7. Osad czynny skrobia	4	5
8. Osad czynny bez skrobi	3	5
9. Kontrola (brak enzymu)	0	0
10. Ziarniak nie skiełkowany	5	5
11. Ziarniak skiełkowany	5	5
12. Siarczan amonu	- (brak enzymu)	4
13. DEAE-celuloza	4	5
14. Wysoka temperatura	5	5

Na podstawie wyników doświadczenia można stwierdzić, iż wśród enzymów bakteryjnych największą aktywnością wykazywały się pochodzące z nadgniłego ziemniaka a najsłabszą pochodzące z Wisły. Bakterie rozwijające się na ziemniaku mają do dyspozycji dużą ilość skrobi w porównaniu do bakterii rozwijających się w Wiśle gdzie mogą występować jedynie jej śladowe ilości. Wśród enzymów roślinnych największą aktywnością wykazywały się pochodzące ze skiełkowanych ziarniaków. Ziarniak podczas kiełkowania hydrolizuję z dużą szybkością materiał zapasowy, którym jest właśnie skrobia. Zadziałanie siarczanem amonu wpłynęło na obniżenie aktywności amylaz, co oznacza, że są one wrażliwe na sole siarczanowe. Natomiast zadziałanie wysokiej temperatury nie zmniejszyło aktywności enzymu, przez co można stwierdzić, że jest on termostabilny. Unieruchomienie amylazy na nośniku nie ma negatywnego wpływu na jej aktywność. Wbrew uzyskanym wynikom (możliwość popełnienia błędów podczas przygotowywania doświadczenia) należy stwierdzić, iż enzymy bakteryjne działają lepiej w środowisku kwaśnym, roślinne natomiast w pH bardziej zasadowym.

4. Literatura.

Chmiel A., Biotechnologia. Podstawy mikrobiologiczne i biochemiczne, Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa, 1994, s. 231-232, 246-253

Jeljaszewicz J. (red.), Problemy współczesnej mikrobiologii, Wydawnictwo Polskiej Akademii Nauk, Wrocław, 1983, s. 44-46

Różalski A., Ćwiczenia z mikrobiologii ogólnej, Wydawnictwo Uniwersytetu Łódzkiego, Łódź, 2004, s. 61-64

---