Enzymy (3 XI 2008)

Enzymy - biokatalizatory białkowe

Enzymy:

• Proste- złożone tylko z aminokwasów

• Złożone- holoenzymy:

część białkowa(apoenzym) i część niebiałkowa: koenzym LUB grupa prostetyczna

-w apoenzymie zlokalizowana jest specyficzność enzymu wobec substratu

-enzymy- należą do klasy globulin, posiadają IV-rzędową strukturę

-im wyższa jest struktura enzymu, tym mniej jest on podatny na modyfikację

Biokatalizatory niebiałkowe:

-inne mechanizmy reakcji

-np. rybozymy, deoksyrybozymy( czyli czynne katalitycznie RNA i DNA)

Sztuczne enzymy

-wykazują aktywność podobną do enzymów

Enzymy:

-są dużo większe od substratów, lecz tylko kilka aminokwasów jest bezpośrednio zaangażowanych w katalizę (=centrum aktywne)

W centrum aktywnym wyróżniamy 2 miejsca: wiążące substrat i katalityczne; związanie substratu przez enzym umożliwia takie ustawienie przestrzenne substratu, że jego fragment podlegający przekształceniu znajdzie się w obszarze działania miejsca katalitycznego

E + S KOMPEKS ENZYM SUBSTRAT E-S E + P

enzymy nie zużywają się w katalizowanej przez siebie reakcji!

Kompleks ten powstaje w centrum aktywnym enzymu:

• Zajmuje on małą część całej cząsteczki enzymu, nieliczne reszty aminokwasowe wchodzą w kontakt z substratem

• Jest to układ przestrzenny- aminokwasy tworzące centrum aktywne nie leżą obok siebie, zajmują liniowo odległe miejsca, a dopiero pofałdowanie je zbliża

• Jest to zagłębienie lub szczelina- niedostępna dla cząsteczek H₂O, jeśli nie biorą one udziału w reakcji

• W tworzeniu kompleksu E-S biorą udział słabe wiązania niekowalencyjne o niskiej energii:

• Hydrofobowe

• Jonowe

• Wodorowe (powst. w wyniku wspólnego użytkowania atomu H przez 2 atomy pierwiastka elektroujemnego; wiązania te mogą być mocne- wtedy gdy donor wodoru, wodór i akceptor układają się liniowo, lub słabe- wtedy atomy te układają się pod kątem)

• Van der Waalsa

• Swoistość wiązania substratu jest uzależniona od precyzyjnego ułożenia i dopasowania wielu atomów centrum aktywnego i substratu

Centrum aktywne jest budowane przez 4 rodzaje aminokwasów:

1. Aminokwasy kontaktowe:

• Są odpowiedzialne za związanie substratu- określają swoistość

• Pierwszy etap procesu katalizy

• Często są to aminokwasy, które w łańcuchach bocznych mają grupy mogące być donorami lub akceptorami protonów. Są to grupy β-karboksylowe asparaginianu, grupy γ-karboksylowe glutaminianu, grupy ε-aminowe lizyny, atomy azotu w pierścieniu imidazolowym histydyny, grupy -OH treoniny, seryny i tyrozyny, grupy -SH cysteiny, np.grupa -COOH pepsyny i NH₂ aminotransferazy

Aminokwasy pomocnicze:

• Utrzymują substrat w miejscu aktywnym poprzez w. jonowe

3. Aminokwasy współdziałające

• Stanowią pomost dla aminokwasów kontaktowych i pomocniczych nadając odpowiednią konformację centrum aktywnemu

4. Aminokwasy zbędne

• Np. papaina, enolaza- można je odszczepić nie pozbawiając enzymu jego aktywności

Modele miejsca aktywnego:

• ZAMEK KLUCZ- sztywny model matrycowy

-ten sam układ przestrzenny, substrat pasuje do enzymu

• 3-PUNKTOWE POŁĄCZENIE

-do związania substratu są potrzebne 3 miejsca do połączenia z enzymem

• INDUKCYJNE DOPASOWANIE

-enzymy są „elastyczne”, dopasowują się do substratu, zbliżanie substratu do centrum aktywnego zmienia jego konformację, dopasowuje się podczas oddziaływania z substratem

• KATALIZY POLIFUNKCYJNEJ

-dla reakcji hydrolizy

-ułożenie grupy elektrofilowej i nukleofilowej centrum aktywnego powoduje przesunięcie elektronu podczas hydrolizy wiązania i jego rozerwania z dołączeniem H⁺ i OH^- z wody

• PUŁAPKI

-odległość wiązań w centrum aktywnym jest większa niż wiązanie substratów, np. arginaza (arginina mocznik)

Jak działa enzym?

-zwiększa prawdopodobieństwo zderzeń cząsteczek, ukierunkowuje je na odległość wiązania, nie zmienia położenia równowagi, ale przyspiesza ustalanie się stanu równowagi reakcji

-obniża energię aktywacji

WYKRES!

Enzymy a katalizatory nieorganiczne (platyna, kw.siarkowy stężony, Fe, Mg, tlenek glinu)

• obniżają energię aktywacji( ale enzymy obniżają ją bardziej)

• środowisko działania katalizatorów nieorganicznych jest homo- i heterogeniczne, a enzymy działają na granicy środowisk wewnątrz i zewnątrzkomórkowego

• już nawet bardzo mała ilość enzymu jest w stanie przetwarzać substrat

• enzymy działają w kompleksach wieloenzymatycznych, a kat.nieorganiczne działają pojedynczo

• wrażliwość-enzymy to białka, odpowiednie pH, niskie ciśnienie

katalizatory nieorganiczne-wymagają często wysokich temperatur, ciśnień, stężeń H⁺ i OH^-

• enzymy posiadają większą aktywność molekularną- potrafią zmienić więcej substratu niż e. nieorganiczne(większa liczba obrotów)

• swoistość- enzym katalizuje jedną reakcję

• sprawność katalityczna-przyspiesza reakcję ok. 10⁶-10¹² razy!

• Enzym wykazuje specyficzność wobec reakcji i stereospecyficzność do określonej budowy konformacyjnej substratu

Np. Specyficzność może być:

• Absolutna - enzym katalizuje tylko 1 reakcję, np. Katalaza(H₂O₂H₂O i O₂), oksydaza glukozowa, ureaza(mocznik NH₃ i CO₂)

• Wysoka, np. fosfataza glukozo-6-fosforanowa(glukozo-6-fosforanglukoza)

• Mała, np. esteraza (wiązanie estrowe), lipaza (dowolny tłuszcz), peptydaza (dowolne białko), wykazują specyficzność grupową

• Niska, np. oksydaza ksantynowa(hipoksantynaksantynakwas moczowy)

Enzymy wykazują specyficzność:

• Przestrzenną, np. oksydaza L lub D-aminokwasowa, alfa-glikozydaza,β-glikozydaza

• Grupową; enzymy działają na grupę wspólna, np. związki posiadające gr. OH

Czynniki wpływające na szybkość reakcji enzymatycznej(SKRYPT)

• Stężenie substratu, wykres!!

• Stężenie enzymu

• Temperatura

• pH

• siła jonowa

• obecność aktywatorów i inhibitorów

Aktywatory (skrypt)

Aktywacja:

• obecność wolnych grup tiolowych -SH- ujawnia się w warunkach beztlenowych

Katepsyny- autoliza komórek

• zwiększenie lub zmniejszenie efektywności ekspresji genów- biosynteza enzymów

• regulacja aktywności enzymatycznej alloster. poprzez efektory

Modyfikacja:

• zymogenowa- poprzez usunięcie inhibitora maskującego,odcinka prekursorowego, np. pepsynogenpepsyna, gdzie pepsynogen jest nieczynną forma enzymu, tzw. zymogenem

• prekursorowa forma enzymu, zymogen nie wykazuje aktywności katalitycznej

• przykłady: proteazy: pepsynogen i pepsyna, trypsynogen i trypsyna, chymotrypsynogen i chymotrypsyna

• synteza tych enzymów w postaci nieaktywnej ma na celu ochronę komórek i narządów przed samouszkodzeniem, gdyż enzym nie może pełnić swoich funkcji w komórce syntetyzującej

• kowalencyjna- poprzez fosforylację i defosforylację, np. kinazy białkowe i fosfatazy białkowe (np. fosforylaza glikogenowa jest aktywna po fosforylacji, a synteza glikogenowa aktywna jest po defosforylacji)

• kinazy białkowe aktywują niektóre nieaktywne białka enzymatyczne

• fosforylacja: źródłem reszt fosforanowych jest ATP, miejscem ich wiązania są grupy -OH seryny, treoniny, tyrozyny

• hydrolityczne odłączenie reszt fosforanowych, czyli defosforylacja przez odpowiednią fosfatazę białkową inaktywuje enzym

Rola metali(ksero!)

-Enzymy działające poza komórką wymagają Ca²⁺, np. enzymy krzepnięcia krwi

INHIBICJA- hamowanie aktywności enzymów:

• nieodwracalna- zupełna

• odwracalna- kompetycyjna i niekompetycyjna

• mieszana

1. INHIBICJA NIEODWRACALNA

Niespecyficzne inaktywatory powodują denaturację białek poprzez:

• czynniki fizyczne

• pH

• temperaturę

• inne czynniki denaturujące

Przykłady inhibicji nieodwracalnej:

• DIPF- diizopropylofluorofosforan, składnik gazów bojowych, hamuje esterazę acetylocholinową, działa na układ nerwowy, uniemożliwia przekazywanie impulsów nerwowych

• Amid kwasu jodooctowego, modyfikuje -SH reszt cysteinylowych, może być stosowany jako czynnik diagnostyczny

• Penicylina- SUBSTRAT SAMOBÓJCA, modyfikuje centrum aktywne peptydylotrafnsferazy glikoproteidów, potrzebnej do budowy szczelnej ściany komórkowej

• Aspiryna- acetyluje serynę c.a. cyklooksygenazy i wpływa na przemiany kwasu arachidonowego- stan zapalny)

• Eflornityna- śpiączka afrykańska

2. INHIBICJA ODWRACALNA

Inhibicja kompetycyjna:

-inhibitor jest podobny strukturalnie do substratu

-wiąże się z enzymem w jego miejscu aktywnym, co powoduje obniżenie jego powinowactwa do substratu, czyli do wzrostu stałej Michaelisa

- wykres z enzymów(L-W)

- jest 100% odwracalna przez zwiększenie stężenia substratu

-prędkość maksymalna reakcji się nie zmienia, lecz osiąga się ją przy wyższym stężeniu substratu

Przykłady:

• Arsenian- analog fosforanu

• Allopurynol- analog purynyhipoksantyny, inhibitor oksydazy ksantynowej (zmniejsza wytwarzanie kwasu moczowego, lek przeciw dni moczanowej)

• Antywitaminy aminokwasów białkowych

• ATP, ADP- dla oksydoreduktaz

• 2,3-bifosfoglicerynian- hamuje fosfomutazę glicerynianową

• Analogi kwasu foliowego- aminopteryna, ametopteryna

• Metotreksat H₂H₄ -folian, hamuje reduktazę dihydrofolianową

• Antagoniści witaminy B- pirytiamina, oksytiamina

• Kwas metylopantotenowy, deoksypirydoksyna

• Fizostygmina- hamuje hydrolizę Ach katalizowaną przez acetylocholinesterazę

• Acetazolamid= diamox (efekt: wzmożone wydalanie wodorowęglanu i fosforanów przez nerki, lek moczopędny)- silny inhibitor anhydrazy węglowej

• Benzimidazol

• Leki mające w składzie D-aminokwasy- hamują rozwój bakterii(antybiotyki peptydowe)

Inhibicja niekompetycyjna:

-inhibitor nie jest podobny strukturalnie do substratu

-wiąże się z enzymem poza miejscem aktywnym i tak zniekształca cząsteczkę enzymu, że zmniejsza jego aktywność katalityczną

-nie zmienia powinowactwa enzymu do substratu, stała Michaelisa się nie zmienia

-obniża prędkość maksymalną reakcji

-inhibicji nie da się odwrócić poprzez zwiększenie stężenia substratu

-inhibitor niekompetycyjny nie konkuruje z substratem o miejsce aktywne enzymu, enzym może wiązać jednocześnie substrat i inhibitor

-działają poprzez modyfikację białka enzymatycznego, np. poprzez przyłączanie metali ciężkich do grupy SH cysteiny, albo fosforylację grupy OH seryny

- inhibitor wiąże się z kompleksem E-S, a nie ze substratem, powstaje kompleks E-I-S (enzym-inhibitor-substrat), który jest nieaktywny, reakcja zostaje zatrzymana!

-dotyczy enzymów złożonych z wielu podjednostek

Antidota inhibitorów niekompetycyjnych

Znoszą działanie inhibitorów niekompetycyjnych, mają większe powinowactwo do inhibitora niż do enzymu

• BAL: 2,3-dimerkaptopropanol-lek stosowany w zatruciach m.in. związkami arsenu, antymonu, rtęci, złota i miedzi

• EDTA- etylenodiaminotetraoctan,wersenian, hamuje enzymy zależne od jonów Ca²⁺ i Mg²⁺, poprzez tworzenie z tymi jonami niedysocjujących związków (inhibitor w tym przypadku wiąże się z jonami metali, które są niezbędne do funkcjonowania danego enzymu); odblokowuje enzymy, podawany jest w zatruciach niektórymi metalami ciężkimi np. Pb, ma właściwości helatujące metale

3. INHIBICJA MIESZANA:

-oddziałują zarówno na wiązanie substratu, jak i na jego przekształcanie

-zwiększają Km i Vmax

Hamowanie szybkości reakcji enzymatycznej

Hamowanie allosteryczne dzięki enzymom allosterycznym:

• 2 centra: katalityczne (wiąże substrat) i allosteryczne usytuowane niezależnie (dołącza się do niego efektor allosteryczny, dodatni lub ujemny)

• Budowa tetrameryczna

• Są to enzymy regulatorowe, od ich aktywności zależy ciąg przemian enzymatycznych

• Katalizują jedną z pierwszych reakcji danego ciągu reakcji

Efektory allosteryczne DODATNIE lub UJEMNE:

- enzymy allosteryczne wymagają do swojej aktywności efektorów

• Homotropowe- cząsteczka substratu jest jednocześnie efektorem

• Heterotropowe- efektor jest inny od substratu

• Homo-heterotropowe

Efektory DODATNIE:

• Powinowactwo do enzymu rośnie, centrum katalityczne się otwiera

• Przebieg reakcji jest sigmoidalny, zmniejsza się sigmoidalność

• Wartość S_0,5 maleje

• Np. cAMP jest efektorem kinazy białkowej

Efektory UJEMNE:

• Wykazują podobieństwo do inhibitorów kompetycyjnych, przez to że zmniejszają powinowactwo enzymu do substratu

• Centrum katalityczne się zamyka

• Rośnie sigmoidalność, wartość S_0,5 i Km, ale nie wpływają na Vmax, nie wykazują podobieństwa do substratu!

• Powinowactwo do substratu maleje

Kinetyka allosteryczna wskazuje na:

1. „kooperatywność pozytywną”

• Przyłączenie 1 cząsteczki substratu do jednej z podjednostek tak zmienia konformację sąsiednich podjednostek enzymu, że następne cząsteczki wiążą się do z większym powinowactwem, np. hemoglobina

1. „kooperatywność negatywną”,

• np. dehydrogenaza aldehydu 3-fosfoglicerynowego

Karbamoilotransferaza asparaginowa: najlepiej poznany mechanizm enzymu allosterycznego

- 2 podjednostki katalityczne (K), 4 podjednostki regulatorowe (R)

Klasy enzymów (skrypt)

1. Oksydoreduktazy

2. Transferazy

3. Hydrolazy

4. Liazy

5. Izomerazy

6. Ligazy

Podział diagnostyczny(skrypt)

1. Enzymy sekrecyjne (wydzielnicze)

2. Enzymy indykatorowe (wskaźnikowe)

3. Enzymy ekskrecyjne (wydalnicze)

• dehydrogenaza mleczanowa LDH

(w warunkach normalnych aktywność LDH-1 jest niższa niż LDH-2, u chorych z zawałem mięśnia sercowego aktywność 1 przewyższa 2)

• aldolaza (jej brak wywołuje nietolerancję na fruktozę- fruktozemia, jest to enzym rozwojowy)

• fosfataza zasadowa

• amylaza (jej aktywność wzrasta w zapaleniu trzustki)

• kinaza fosfokreatynowa

Enzymy jako leki:

• tkankowy aktywator plazminogenu i urokinaza (choroba zakrzepowa)

• asparaginaza (rozkłada asparaginazę, leczenie białaczki)- asparagina jest niezbędna do wzrostu komórek nowotworowych

• lipaza (enzym hydrolizujący tłuszcze, użyteczny w leczeniu zaburzeń wydzielniczych trzustki)

• pepsyna- jej r-r wspomaga trawienie

• pankreatyna- wspomaga trawienie w środowisku zasadowym

Defekty enzymatyczne:

• bielactwo wrodzone (albinizm)- brak tyrozynazy- brak produkcji melanin

• fenyloketonuria- niedobór hydroksylazy fenyloalaniny, która umożliwia przejście Phe w Tyr

• galaktozemia- choroba spowodowana mutacją punktową blokującą aktywność enzymu rozkładającego galaktozę do glukozy, w efecie gromadzi się galaktoza: niedorozwój fizyczny i psychiczny, utrata wzroku

• methemoglobinemia- genetycznie uwarunkowany niedobór układu reduktazy methemoglobiny

7

---