7. PODSTAWY IMMUNOHISTOCHEMII
Najwyższą swoistością charakteryzują się te oddziaływania między związkami chemicznymi, które polegają na wzajemnym "dopasowaniu" przestrzennym wiążących się ze sobą cząsteczek. Są to tzw. oddziaływania stereospecyficzne, w wyniku których nie tworzą się wiązania kowalencyjne, natomiast cząsteczki łączą się ze sobą za pośrednictwem słabych, lecz licznych wiązań wynikających z bliskości atomów "dopasowanych" do siebie cząsteczek (wiązania wodorowe, elektrostatyczne, siły van der Waalsa). W ten sposób dochodzi do połączenia między antygenem i przeciwciałem, między zasadami purynowymi i pirymidynowymi w kwasach nukleinowych, czy między cukrowcami i niektórymi glikoproteidami. Techniki histochemiczne wykorzystujące ten charakter połączeń noszą zbiorczą nazwę histochemii powinowactwa i cechują się najwyższym stopniem specyficzności spośród wszystkich metod histochemicznych. Do histochemii powinowactwa należą: immunohistochemia, histochemia lektyn i hybrydocytochemia (p. rozdz. 8).
Immunohistochemia zajmuje się wykrywaniem w komórkach (immunocytochemia) i tkankach substancji o charakterze antygenowym za pomocą znakowanych przeciwciał.
7.1. Antygen i przeciwciało
Antygen jest to substancja (zazwyczaj białko, gliko-, lipo- lub nukleoproteid, rzadziej związek o niższej masie cząsteczkowej), wykazująca:
• zdolność do wywołania produkcji swoistych przeciwciał przez system immunologiczny organizmu (immunogenność);
• zdolność do swoistego wiązania wytworzonych przeciwciał i do tworzenia z nimi kompleksów (antygenowość).
Przeciwciało jest to białko należące do klasy immunoglobulin, wytwarzane przez system immunologiczny organizmu i mające zdolność swoistego wiązania się z antygenem. Cząsteczka przeciwciała ma kształt litery Y i składa się z 2 ciężkich i 2 lekkich łańcuchów polipeptydowych. W wyniku trawienia enzymem proteolitycznym papainą, cząsteczka przeciwciała rozpada się na fragment Fc oraz dwa jednakowe fragmenty Fab, które zawierają miejsca wiążące antygen (ryc. 7.1).
Fragmenty Fab rozpoznają i wiążą się jedynie z niewielkim fragmentem cząsteczki antygenu (kilka-kilkanaście aminokwasów w przypadku białek), który nazywamy determinantą antygenową. Wynika z tego, iż:
• jedna cząsteczka przeciwciała może związać dwie determinanty (ma dwa fragmenty Fab)
• cząsteczka typowego antygenu (np. białka o dużej masie cząsteczkowej) ma wiele różnych determinant antygenowych, z którymi mogą się wiązać różne przeciwciała.
7.2. Otrzymywanie i oczyszczanie przeciwciał do badań immunohistochemicznych
Z uwagi na międzygatunkowe zróżnicowanie układu immunologicznego, antygenem wywołującym tworzenie przeciwciał może być prawie każde białko osobnika innego gatunku. W warunkach fizjologicznych układ immunologiczny reaguje na "obce" antygeny, które dostały się do organizmu w sposób naturalny (infekcja bakteryjna, wirusowa, pasożytnicza, itp.). Należy jednak pamiętać, że układ immunologiczny zareagowałby podobnie na dowolne białko obcego gatunkowo (a niekiedy nawet osobniczo) organizmu, gdyby się z nim zetknął - przykładem jest chociażby odrzucenie przeszczepu. Wynika stąd, iż każda struktura komórkowa czy tkankowa, w skład której wchodzą białka (lub inne substancje zdolne do wywołania odpowiedzi immunologicznej) ma potencjalne własności antygenowe i to właśnie wykorzystuje immunohistochemia.
Immunohistochemiczne uwidocznienie antygenu w materiale biologicznym wymaga uzyskania go w czystej postaci, a następnie otrzymania swoistych dla tego antygenu przeciwciał. Wyizolowany metodami preparatyki biochemicznej antygen służy do immunizacji (pobudzenia układu immunologicznego) zwierząt laboratoryjnych, które będą później stanowić źródło swoistych przeciwciał.
7.2.1. Otrzymywanie przeciwciał poliklonalnych
Immunizacja zwierzęcia polega na kilkakrotnym podaniu antygenu (dożylnie, dootrzewnowo lub podskórnie) w kilkudniowych lub kilkutygodniowych odstępach czasu. Kolejne dawki antygenu wzmagają odpowiedź immunologiczną organizmu zwierzęcia i doprowadzają do intensywnej produkcji oraz nagromadzenia w jego osoczu swoistych przeciwciał, mieszczących się we frakcji gamma-globulin białek osoczowych.
W celu uzyskania czystej frakcji przeciwciał, po pobraniu krwi zwierzęcia wytrąca się z niej immunoglobuliny (np. siarczanem amonu lub sodu), a następnie oddziela się je na drodze dializy i dodatkowo oczyszcza poprzez rozdział chromatograficzny.
Przy zastosowaniu tej metody uzyskuje się zawsze kilka różnych odmian przeciwciał, z których każda skierowana jest przeciw innej determinancie antygenu użytego do immunizacji. Zostały one wyprodukowane przez różne populacje (klony) komórek plazmatycznych, i dlatego nazywa się je poliklonalnymi. Z uwagi na swą niejednorodność, przeciwciała poliklonalne mogą niekiedy wiązać się z innymi antygenami, posiadającymi fragment cząsteczki o zbliżonej konfiguracji przestrzennej do jakiejś determinanty antygenu użytego do immunizacji (tzw. reakcje krzyżowe), co zmniejsza ich specyficzność.
7.2.2. Otrzymywanie przeciwciał monoklonalnych
Przeciwciała monoklonalne wytwarzane są przez jeden klon komórek, czyli przez populację wywodzącą się z jednej komórki macierzystej. Przeciwciała te są idealnie jednorodne pod względem ich struktury molekularnej, a co za tym idzie swoistości wobec jednej determinanty antygenowej. Redukuje to do minimum możliwość wystąpienia reakcji krzyżowych.
Przeciwciała monoklonalne uzyskuje się poprzez immunizację zwierzęcia (najczęściej myszy), i pobranie ze śledziony limfocytów B produkujących przeciwciała. W hodowli przeprowadza się fuzję tych komórek z nowotworowo zmienionymi komórkami plazmatycznymi (komórkami szpiczaka). Powstałe w wyniku tego procesu hybrydy komórkowe (p. rozdz. 10.8) charakteryzują się zdolnością do produkcji przeciwciał i nieograniczonej liczby podziałów (limfocyty w hodowli szybko giną). Przeprowadza się następnie selekcję komórek produkujących pożądane przeciwciała, a wyselekcjonowane komórki namnaża się w celu otrzymania klonów. W trakcie hodowli komórki produkują przeciwciała i wydzielają je do środowiska hodowlanego (pożywki), skąd można je wyizolować (ryc. 7.2).
7.3. Znakowanie przeciwciał
Uwidocznienie miejsca wiązania się przeciwciała z antygenem zlokalizowanym w komórce czy tkance możliwe jest jedynie pod warunkiem odpowiedniego znakowania przeciwciała. Przeciwciała mogą być znakowane:
• fluorochromami, czyli barwnikami fluorescencyjnymi (preparat ogląda się w mikroskopie fluorescencyjnym);
• enzymami (badania na poziomie mikroskopu świetlnego i elektronowego)
• metalami (badania na poziomie mikroskopu elektronowego).
7.3.1. Znakowanie fluorochromami
Metody immunohistochemiczne wykorzystujące przeciwciała znakowane fluorochromami noszą nazwę immunofluorescencji. W praktyce stosuje się najczęściej następujące fluorochromy:
• izotiocyjanian fluoresceiny (FITC) - zielona fluorescencja,
• tetrametylo-izotiocyjanian rodaminy (TRITC) - czerwona fluorescencja,
• czerwień teksańska (Texas Red, TR) - czerwona fluorescencja,
• aminometylokumaryna (AMCA) - niebieska fluorescencja.
Jedna z grup chemicznych barwnika (np. grupa izotiocyjanianowa) wiąże się w sposób trwały z resztami aminowymi przeciwciała. Po sprzęgnięciu przeciwciała z fluorochromem konieczne jest oddzielenie nie związanego fluorochromu oraz chromatograficzne wyizolowanie znakowanych przeciwciał. Otrzymana w ten sposób czysta frakcja znakowanych przeciwciał nadaje się do badań immunofluorescencyjnych.
7.3.2. Znakowanie enzymami
Metody korzystające z przeciwciał znakowanych enzymami cieszą się szczególnie dużą popularnością i noszą nazwę metod immunoenzymatycznych. Są one bardziej skomplikowane niż metody immunofluorescencyjne, gdyż po wykonaniu reakcji immunohistochemicznej (wiązanie przeciwciała z antygenem), należy dodatkowo przeprowadzić reakcję histochemiczną uwidaczniającą aktywność enzymu, którym znakowane było przeciwciało. Jednak w wielu przypadkach, zwłaszcza przy śladowych ilościach antygenu w tkance, metody immunoenzymatyczne umożliwiają bardziej wyraziste uwidocznienie miejsca wiązania znakowanego przeciwciała, ponieważ odpowiednio przeprowadzona końcowa reakcja histochemiczna prowadzi do nagromadzenia znacznych ilości barwnego produktu reakcji.
Do znakowania przeciwciał używa się kilku enzymów, z których najpowszechniej stosowane to peroksydaza i fosfataza zasadowa.
Znakowanie przeciwciał enzymami polega na ich chemicznym sprzęganiu za pośrednictwem związków dwufunkcyjnych, czyli posiadających dwie grupy wiążące, z których jedna przyłącza się do cząsteczki enzymu, a druga do cząsteczki przeciwciała. Można również przyłączać enzymy do przeciwciał korzystając z wiązania immunologicznego (antygen-przeciwciało, p. str. 96).
7.3.3. Znakowanie ferrytyną
Ferrytyna jest to białko zawierające w swojej cząsteczce znaczną ilość (ok. 4000 atomów) żelaza i mające formę elektronowo gęstych ziaren o średnicy ok. 9 nm. Ta ostatnia własność pozwoliła na wykorzystanie ferrytyny jako znacznika do badań immunohistochemicznych na poziomie mikroskopu elektronowego. Znakowanie przeciwciał ferrytyną przeprowadza się również za pośrednictwem dwufunkcyjnych związków chemicznych.
7.3.4. Znakowanie koloidalnym złotem
W badaniach immunohistochemicznych na poziomie mikroskopu elektronowego najczęściej stosuje się przeciwciała znakowane koloidalnym złotem, czyli otrzymanymi poprzez odpowiednią preparatykę chemiczną (złoto wiąże się z hydrofobowymi obszarami cząsteczki przeciwciała) mikroskopijnymi ziarenkami metalicznego złota (średnica od 5 do 40 nm). Z uwagi na wysoką liczbę atomową złota są one widoczne w mikroskopie elektronowym w postaci kontrastowych, czarnych punktów, wyraźnie lokalizujących miejsce związania znakowanego przeciwciała z tkanką.
Znakowanie koloidalnym złotem można wykorzystać również na poziomie mikroskopu świetlnego - wykonuje się wówczas dodatkową reakcję redukcji soli srebra do srebra metalicznego przez związane już z tkanką złoto, uzyskując w miejscu reakcji czarny strąt (metoda złoto-srebro).
W praktyce rzadko uzyskuje się i znakuje przeciwciała samodzielnie - szeroki wachlarz przeciwciał znakowanych w różny sposób jest wytwarzany i oferowany przez wyspecjalizowane firmy produkujące odczynniki chemiczne
7.4. Przygotowanie materiału do badań immunohistochemicznych
Odpowiednie przygotowanie materiału jest kluczowym warunkiem dla pomyślnego przebiegu reakcji immunohistochemicznej. Poszczególne etapy przygotowania materiału (utrwalanie, odwadnianie, zatapianie) mogą zmieniać konformację determinant antygenowych (np. przez denaturację białek lub przyłączanie do cząsteczki antygenu nowych grup chemicznych) i w ten sposób uniemożliwiać jego swoiste rozpoznanie przez przeciwciało. Antygeny mają różną wrażliwość na czynniki stosowane w procedurach histologicznych, i dlatego przy opracowywaniu nowych metod immunocytochemicznych lub przy wykrywaniu nowych antygenów warunki przygotowania materiału trzeba dobierać doświadczalnie. Nie jest to konieczne w reakcjach stosowanych rutynowo - w opisie metody podany jest również sposób przygotowania materiału.
7.4.1. Utrwalanie
Utrwalacze, zwłaszcza o charakterze aldehydów, z reguły wywierają niekorzystny wpływ na antygenowość materiału. Często zaleca się krótkotrwałe utrwalanie w szybko penetrujących utrwalaczach precypitacyjnych (alkohole), niekiedy jedynym wyjściem jest przeprowadzenie reakcji immunohistochemicznej na materiale nieutrwalanym. Firmy produkujące odczynnki immunohistochemiczne mają jednak w swej ofercie również przeciwciała skierowane przeciw antygenom wstępnie traktowanym formaldehydem - nadają się one zatem do stosowania w materiale utrwalonym w formalinie.
7.4.2. Zatapianie
Aby uniknąć niekorzystnego wpływu zatapianie na antygenowość tkanki można stosować technikę mrożeniową, zarówno na poziomie mikroskopu optycznego jak i elektronowego. Obecnie istnieje jednak możliwość wykrywania wielu natygenów na skrawkach parafinowych (udało się uzyskać przeciwciała przeciw takim miejscom antygenowym, które nie ulegają deformacji pod wpływem procesu zatapiania w parafinie).
W przypadku mikroskopii elektronowej skrawki materiału zatopionego w żywicach epoksydowych zasadniczo nie nadają się do badań immunocytochemicznych. Natomiast w przypadku wielu antygenów dobre efekty można uzyskać na skrawkach z polarnych żywic akrylowych (Lowicryl K4M, LR Gold).
7.4.3. Odsłanianie miejsc antygenowych
Utrwalenie i zatopienie materiału bardzo często powoduje zmiany w cząsteczkach antygenu (zmiany kształtu, dołączenie dodatkowych grup chemicznych), które utrudniają lub wręcz uniemożliwiają rozpoznanie determinant antygenowych przez swoiste przeciwciała. Uzyskuje się wówczas słabą intensywność lub nawet całkowity brak reakcji immunocytochemicznej. W takich sytuacjach po pokrojeniu materiału i ewentualnym usunięciu środowiska zatapiającego należy stosować metody przywracające antygenom ich pierwotne cechy, co określa się mianem odsłaniania lub odmaskowywania determinant antygenowych. Do najczęściej stosowanych należą:
• kontrolowane trawienie skrawków przy użyciu enzymów proteolitycznych (trypsyna, pronaza)
• działanie na skrawki mikrofalami.
Rodzaj postępowania i jego intensywność (rodzaj i stężenie enzymu, czas trawienia lub ekspozycji na mikrofale) zależą w szerokim zakresie od charakteru antygenu i materiału, należy je zatem w każdym przypadku dobrać doświadczalnie.
7.5. Wykonanie reakcji immunohistochemicznej
7.5.1. Mikroskopia świetlna
Na poziomie mikroskopu świetlnego reakcję immunohistochemiczną przeprowadza się na szkiełkach podstawowych, bądź nakrywkowych. Przed właściwą reakcją immunohistochemiczną wykonuje się tzw. blokowanie, polegające na inkubacji preparatów z nieaktywną immunologicznie (nie zawierającą swoistych przeciwciał) surowicą innego gatunku zwierzęcia niż to, od którego uzyskano przeciwciała (można też stosować roztwór albumin). Etap ten ma zablokować w badanym materiale wszystkie miejsca, które mogłyby nieswoiście (np. na drodze oddziaływań elektrostatycznych) wiązać białka osoczowe, a zatem również przeciwciała.
W przypadku stosowania przeciwciał znakowanych enzymami zawsze istnieje możliwość, że badana tkanka zawiera enzym o takiej samej aktywności, jak enzym znacznikowy (np. peroksydazę lub fosfatazę zasadową). Enzym tkankowy powodowałby nieswoiste, bo nie związane z antygenem zabarwienie w reakcji wykrywającej enzym znacznikowy. Z tego względu przed inkubacją z przeciwciałami unieczynnia się enzym tkankowy jego nieodwracalnym inhibitorem: peroksydazę przez inkubację w 0,3% nadtlenku wodoru, a fosfatazę zasadową przez dodanie 10 mM lewamizolu do roztworów przeciwciał.
Inkubacja ze znakowanymi przeciwciałami odbywa się zawsze w komorze wilgotnej, z reguły w temperaturze pokojowej. Przeciwciała rozpuszcza się w buforowanej soli fizjologicznej, niekiedy z domieszką detergentów (Triton X-100), które zwiększają przepuszczalność błon biologicznych dla dużych cząsteczek przeciwciał. Po inkubacji, nie związane z tkanką przeciwciała wypłukuje się buforowaną solą fizjologiczną. Skrawki można dodatkowo podbarwić barwnikami histologicznymi w celu skontrastowania pozostałych struktur, a następnie zamyka się je - zależnie od rozpuszczalności końcowego produktu reakcji (ważne zwłaszcza przy metodach immunoenzymatycznych) - w polarnych lub niepolarnych środowiskach. W przypadku reakcji immunofluorescencyjnych środowisko zamykające nie może wykazywać autofluorescencji, tu najczęściej stosuje się do zamykania preparatów sól fizjologiczną o pH > 8 (ogranicza zjawisko zanikania fluorescencji), glicerol, alkohol poliwinylowy lub dostępne komercyjnie środowiska (Vectashield).
7.5.2. Mikroskopia elektronowa
Istnieją dwie metody przeprowadzania reakcji immunohistochemicznych do celów mikroskopii elektronowej: przed zatopieniem materiału (preembedding) i na skrawkach ultracienkich, po zatopieniu tkanki (postembedding). Obie metody stwarzają szereg problemów technicznych związanych z ograniczonym przenikaniem wielkocząsteczkowych przeciwciał do komórek.
Reakcję przed zatopieniem materiału przeprowadza się na małych fragmentach tkanek, bądź na bardzo grubych skrawkach (p. rozdz. 6.2.3). W obu przypadkach istotnym warunkiem prawidłowego przebiegu reakcji jest wniknięcie znakowanych przeciwciał do komórek przez nienaruszone błony komórkowe. W normalnych warunkach cząsteczka przeciwciała jest zbyt duża i zostaje zatrzymana na granicy błony komórkowej. Stosuje się dwa sposoby przezwyciężania tej trudności. Można zadziałać na materiał substancjami zwiększającymi przepuszczalność błon komórkowych, np. detergentami (Triton X100, digitonina). Można również zmniejszyć rozmiary cząsteczek przeciwciała: w tym celu przeciwciało poddaje się enzymatycznemu trawieniu papainą, a następnie izoluje się i znakuje jedynie fragmenty Fab, które mają zdolność swoistego wiązania antygenu.
Po przeprowadzeniu reakcji materiał zatapia się i kroi na ultramikrotomie. Podobnie do analogicznie przeprowadzanych reakcji histochemicznych, najbardziej intensywne wiązanie antygenu tkankowego z przeciwciałem zachodzi w najbardziej powierzchownych obszarach materiału i tylko skrawki z tych obszarów nadają się do analizy mikroskopowej.
Reakcja immunohistochemiczna na skrawkach ultracienkich jest teoretycznie łatwiejsza do wykonania, gdyż komórki są tu przekrojone, a miejsca antygenowe odsłonięte i dostępne dla przeciwciał. Z tak korzystną sytuacją spotykamy się jednak wyłącznie w przypadku ultracienkich skrawków mrożeniowych. Jeżeli natomiast materiał został zatopiony w spolimeryzowanej żywicy, może ona stanowić istotną przeszkodę maskującą miejsca antygenowe. Dotyczy to przede wszystkim żywic epoksydowych - na skrawkach z tak zatopionego materiału udają się tylko nieliczne reakcje immunohistochemiczne, i to pod warunkiem wstępnego "zmiękczenia" żywicy utleniaczami (np. 5% H2O2) lub jej częściowego usunięcia alkotlenkami. Polarne żywice akrylowe wykazują słabsze własności wiążące i maskujące miejsca antygenowe, a także pozwalają na swobodniejszą penetrację znakowanych przeciwciał w głąb skrawka. Z tego powodu używa się ich teraz powszechnie do zatapiania materiału, który ma być przedmiotem badań immunohistochemicznych w mikroskopie elektronowym.
Do reakcji immunohistochemicznych ultracienkie skrawki powinny być zbierane na siatki niklowe lub złote (nie miedziane). Siatki poddaje się inkubacji w komorze wilgotnej, gdzie skierowane skrawkami ku dołowi kładzie się je na powierzchni roztworu przeciwciał.
7.6. Typy reakcji immunohistochemicznych
7.6.1. Reakcja bezpośrednia
Reakcja bezpośrednia polega na inkubacji tkanki zawierającej antygen A ze znakowanym przeciwciałem anty-A. Schemat takiej reakcji przedstawia ryc. 7.3. Znakowane przeciwciało tworzy kompleks z antygenem obecnym w tkance i umożliwia jego mikroskopową lokalizację. Reakcja bezpośrednia ma dość istotną wadę: chemiczne połączenie przeciwciała ze znacznikiem za pośrednictwem wiązań kowalencyjnych z reguły zmienia kształt cząsteczki przeciwciała, co może utrudniać jego zdolność rozpoznawania i przyłączania antygenu, czyli obniży powinowactwo przeciwciała do antygenu. Ten typ reakcji jest obecnie rzadko stosowany, głównie przy rutynowym wykonywaniu bardzo licznych preparatów immunohistochemicznych (używa się wówczas przeciwciał o sprawdzonej uprzednio swoistości) oraz w przypadkach, gdy przeciwciało pochodzi od tego samego gatunku zwierzęcia, u którego wykrywamy antygen (p. dalej).
7.6.2. Reakcja pośrednia
Jest to bardziej złożony i trudniejszy technicznie wariant reakcji immunohistochemicznej, ale pozbawiony głównej wady reakcji bezpośredniej. Przeciwciało wiążące antygen tkankowy nie jest znakowane, a zatem unika się ewentualnych zmian struktury przeciwciała wynikających z jego chemicznej koniugacji ze znacznikiem.
Zasada pośredniej reakcji immunohistochemicznej została przedstawiona na ryc. 7.4. Na zawarty w tkance antygen A działa się najpierw nie znakowanym przeciwciałem anty-A uzyskanym od zwierzęcia X (np. królika, Xanty-A). W drugim etapie, wytworzone w tkance kompleksy A+(Xanty-A) wiążą się ze znakowanym przeciwciałem antyglobulinowym, czyli skierowanym przeciwko immunoglobulinom zwierzęcia X i wytworzonym na drodze immunizacji zwierzęcia Y innego gatunku (np. kozy, owcy, świni). Jest to możliwe, gdyż przeciwciała (immunoglobuliny) dzięki swemu białkowemu charakterowi same posiadają własności antygenowe, a występujące pomiędzy immunoglobulinami różnice międzygatunkowe pozwalają na wytworzenie np. u świni przeciwciał przeciw immunoglobulinom królika, itp. W wyniku takiej dwuetapowej reakcji, w miejscu występowania antygenu A tworzy się kompleks: A+(Xanty-A)+(Yanty-X). Znakowana antyglobulina Yanty-X uwidacznia miejsce lokalizacji antygenu A.
Pierwsze, nie znakowane przeciwciało nie powinno pochodzić od zwierzęcia tego samego gatunku, co zwierzę, na którego tkankach wykonywana jest reakcja. Zgodnie z podanym przykładem, jeżeli użyjemy przeciwciała królika do wykrycia antygenu w tkance królika, to użyta w drugim etapie reakcji antyglobulina będzie się wiązać nie tylko z pierwszym przeciwciałem w miejscu lokalizacji antygenu, ale również ze wszystkimi rejonami tkanki, w których znajdą się immunoglobuliny - co spowoduje wystąpienie nieswoiście dodatniej reakcji i uniemożliwi precyzyjne umiejscowienie wykrywanego antygenu.
7.6.3. Reakcja z mostkiem immunoglobulinowym i kompleksem enzym-antyenzym
Reakcja ta, powszechnie stosowana w badaniach immunohistochemicznych zarówno na poziomie mikroskopu świetlnego jak i elektronowego, uważana jest za czulszą od metody pośredniej, której jest bardziej skomplikowaną odmianą.
Enzymy używane do znakowania przeciwciał można również połączyć z cząsteczką przeciwciała na drodze reakcji immunologicznej, wykorzystując antygenowe własności białek enzymatycznych. Powstają wówczas kompleksy (ryc. 7.5) złożone z enzymu i swoistego dlań przeciwciała (antyenzymu). Najczęściej stosowane kompleksy to peroksydaza-antyperoksydaza (PAP) i fosfataza zasadowa-antyfosfataza (APAAP).
Reakcja z mostkiem immunoglobulinowym składa się z trzech etapów. Najpierw na zawarty w tkance antygen A działa się swoistym przeciwciałem anty-A uzyskanym od zwierzęcia X. Powstaje kompleks A+(Xanty-A). Kolejno nawarstwia się nieznakowane przeciwciało antyglobulinowe zwierzęcia Y skierowane przeciw immunoglobulinom zwierzęcia X - jest to tzw. mostek immunoglobulinowy. Wreszcie do powstałego kompleksu A+(Xanty-A)+(Yanty-X) przyłącza się kompleks enzym-antyenzym, przy czym jego związanie z mostkiem immunoglobulinowym jest możliwe tylko wówczas, gdy przeciwciało przeciw enzymowi pochodzi od zwierzęcia X. Cały kompleks: A+(Xanty-A)+(Yanty-X)+(Xantyenzym+enzym) uwidacznia miejsce lokalizacji badanego antygenu A, a antyglobulina Yanty-X pełni rolę mostka spinającego z jednej strony przeciwciało anty-A, a z drugiej antyenzym połączony z enzymem znacznikowym (ryc. 7.6). Ostatnim etapem procedury jest reakcja histochemiczna uwidaczniająca aktywność związanego z kompleksem enzymu.
Metoda ta, choć trudna technicznie, charakteryzuje się najwyższą swoistością i czułością, gdyż:
• na żadnym etapie nie stosuje się chemicznego znakowania, wprowadzającego wiązania kowalencyjne i przez to mogącego deformować cząsteczki przeciwciał, a wszystkie wiązania pomiędzy elementami składowymi mają charakter immunologiczny (antygen-przeciwciało);
• jedno miejsce antygenowe może wiązać wiele cząsteczek enzymu znacznikowego, przez co uzyskuje się znaczne wzmocnienie intensywności reakcji.
7.6.4. Reakcja z białkiem A
W reakcjach immunohistochemicznych można także stosować tzw. białko A, wyizolowane ze ściany komórkowej gronkowca złocistego. Białko to wykazuje zdolność wybiórczego wiązania fragmentu Fc prawie wszystkich immunoglobulin (klasy G) ssaków. Można nim zatem zastąpić antyglobulinę w reakcji pośredniej (białko A musi być wówczas znakowane), lub też można go użyć w charakterze mostka antyglobulinowego w reakcjach z kompleksem enzym-antyenzym. W praktyce najczęściej wykorzystuje się białko A znakowane złotem w reakcjach pośrednich na ultracienkich skrawkach przeznaczonych do badania w mikroskopie elektronowym.
7.6.5. Reakcja z awidyną i biotyną
Reakcja ta nie ma w pełni charakteru immunologicznego, ale jej mechanizm odpowiada reakcjom immunohistochemicznym i dlatego zalicza się ją do tego działu. Wykorzystuje się tu trwałe i bardzo swoiste połączenie tworzące się pomiędzy awidyną, glikoproteidem występującym w białku jaja (lub podobną streptawidyną wyizolowaną z paciorkowca Streptomyces avidinii), a biotyną, niskocząsteczkową witaminą (H) wyosobnioną z żółtka. Jedna cząsteczka awidyny przyłącza 4 cząsteczki biotyny. Biotynę można sprzęgać na drodze chemicznej z przeciwciałami, natomiast awidynę można znakować. W tej sytuacji wiązanie awidyna-biotyna pełni rolę łącznika pomiędzy przeciwciałem a znacznikiem. Reakcje z awidyną i biotyną przeprowadzane są przeważnie według schematu pośredniej reakcji immunohistochemicznej (antyglobulina sprzęgana jest z biotyną, czyli biotynylowana, a awidyna ze znacznikiem: enzymem lub złotem koloidalnym).
Istnieją dwie podstawowe odmiany reakcji z awidyną i biotyną (ryc. 7.7):
• reakcja LAB (ang. labeled avidin-biotin), w której awidyna znakowana jest chemicznie
• reakcja ABC (ang. avidin-biotin-enzyme complex), w której do biotynylowanej antyglobuliny przyłącza się uprzednio przygotowany, wielocząsteczkowy kompleks awidyny, biotyny i enzymu znacznikowego. Wykorzystanie kompleksu awidyna-biotyna-enzym stwarza możliwość związania większej liczby cząsteczek znacznika z pojedynczą cząsteczką przeciwciała i tym samym podwyższenia czułości reakcji.
W powszechnym użyciu są obecnie firmowe zestawy do przeprowadzania wszystkich typów reakcji immunocytochemicznych (przede wszystkim PAP, APAAP i ABC). W zestawie znajdują się w oddzielnych pojemnikach roztwory do blokowania, unieczynniania endogennych enzymów, roztwory przeciwciał oraz płyny inkubacyjne do uwidaczniania aktywności enzymów znakujących przeciwciała. Wykonanie reakcji sprowadza się zatem do nakrapiania na preparat kolejnych roztworów z odpowiednich pojemników i płukania preparatów pomiędzy poszczególnymi etapami.
7.7. Reakcje kontrolne
Pomimo bardzo wysokiej swoistości reakcji immunocytochemicznych istnieje możliwość niespecyficznych oddziaływań pomiędzy tkanką i użytymi przeciwciałami. Oddziaływania te najczęściej polegają na reakcji krzyżowej przeciwciała z innymi niż wykrywany antygenami oraz na wytwarzaniu słabych wiązań (elektrostatycznych i hydrofobowych) między niektórymi składnikami materiału biologicznego i przeciwciałami. Z tego powodu każda reakcja immunohistochemiczna powinna być uzupełniona odpowiednio zaprojektowanym zestawem reakcji kontrolnych. Do najczęściej stosowanych reakcji kontrolnych należą:
• użycie do reakcji przeciwciał, które zostały uprzednio związane ze swoistym antygenem in vitro, w związku z czym ich fragmenty Fab są zablokowane (tzw. kontrola adsorbcyjna),
• blokowanie właściwej reakcji przez preinkubację ze swoistym, lecz nie znakowanym przeciwciałem (przy reakcjach bezpośrednich)
• inkubacja z immunoglobulinami (lub surowicą) nieimmunizowanego zwierzęcia gatunku, który posłużył do uzyskania przeciwciał, zamiast pierwszego przeciwciała, swoistego dla danego antygenu (przy reakcjach pośrednich),
• inkubacja bez mostka antyglobulinowego (w reakcjach immunoenzymatycznych z użyciem mostka),
• wykonanie reakcji histochemicznej wykrywającej aktywność enzymu znacznikowego z pominięciem poprzednich etapów procedury immunoenzymatycznej.
Wszystkie powyższe reakcje należą do tzw. kontroli negatywnych, tzn. wynikiem prawidłowym jest brak reakcji immunohistochemicznej. Wystąpienie dodatniej reakcji świadczy o nieswoistym wiązaniu się z tkanką jednego ze składników reakcji, lub (w ostatnim przypadku) o obecności w materiale enzymu identycznego lub zbliżonego do enzymu znacznikowego.
Istnieją również pozytywne reakcje kontrolne, które sprawdzają, czy zastosowane przeciwciało wiąże się z wykrywanym antygenem. Reakcję immunocytochemiczną przeprowadzamy wówczas na przebadanym już uprzednio materiale, w którym na pewno jest obecny wykrywany antygen, lub na skrawkach żelu nasyconego roztworem wyizolowanego i oczyszczonego chemicznie antygenu. Prawidłowym wynikiem jest dodatnia reakcja, jej brak świadczy o nieaktywnych przeciwciałach lub o błędach metodycznych.
7.8. Wykrywanie reszt cukrowcowych przy pomocy lektyn
Lektyny są białkami lub glikoproteidami mającymi własność wysoce swoistego wiązania się z określonymi resztami cukrowcowymi oligo- i polisacharydów. Występują w tkankach roślinnych i zwierzęcych, skąd można je wyizolować. Z uwagi na swoistość wiązania, znakowane lektyny stosuje się do wykrywania konkretnych grup cukrowcowych w preparatach mikroskopowych tak, jak znakowane przeciwciała do wykrywania ściśle określonych białek. Z tego względu opis tej metody znalazł się w rozdziale poświęconym immunohistochemii.
Firmy produkujące odczynniki oferują kilkadziesiąt rodzajów lektyn wiążących się z różnymi resztami cukrowcowymi (niektóre przedstawia poniższa tabela).
--------------------------------------------------------------------------------------
Źródło lektyny Wykrywana grupa
--------------------------------------------------------------------------------------
Concanavalia ensiformis (Con A) α-mannoza, α-glukoza
Rącznik (Ricinus communis) galaktoza
Groch (Pisum sativum) N-acetyloglukozamina, mannoza
Bób (Vicia faba) glukoza, mannoza
Soja (Glycine max.) N-acetylogalaktozamina
Soczewica (Lens culinaris) α-mannoza, α-glukoza
Kiełki pszenicy (Triticum sativum) N-acetyloglukozamina
Kolcolist zachodni (Ulex europeus) α-L-fukoza
Limax flavus (ślimak) kwas sialowy
Helix pomatia (ślimak) N-acetylogalaktozamina
---------------------------------------------------------------------------------------
Lektyny można znakować tak jak przeciwciała, i używać do reakcji bezpośredniej. Można również wykrywać cukrowce metodami pośrednimi: najpierw z tkanką wiąże się nieznakowana lektyna, która wykrywana jest w drugim etapie reakcji przy użyciu swoistego przeciwciała lub reakcji awidyna-biotyna (ryc. 7.8).
Podstawowa reakcja kontrolna (negatywna) polega na inkubacji preparatu w obecności cukru prostego, który wykrywa używana lektyna. Obecny w płynie inkubacyjnym cukier blokuje miejsca wiążące lektyny, które nie mogą już połączyć się z resztami cukrowcowymi w tkance (ryc. 7.9).
7.9. Przepisy praktyczne
Przedstawione poniżej przepisy przeznaczone są do samodzielnego wykonania reakcji immunohistochemicznej na poziomie mikroskopii optycznej. Nie uwzględniają one immunizacji, oczyszczania i znakowania przeciwciał, gdyż w rutynowej immunohistochemii stosuje się preparaty handlowe znakowanych przeciwciał. W przypadku firmowych zestawów do wykonania całej reakcji immunohistochemicznej, należy postępować zgodnie z dołączoną do zestawu instrukcją. Inkubacje z przeciwciałami przeprowadza się w komorze wilgotnej.
7.9.1. Bezpośrednia metoda immunofluorescencyjna
5% albumina z surowicy bydlęcej w buforowanej soli fizjologicznej 10-20 min
znakowane fluorochromem swoiste przeciwciało 10-60 min
buforowana sól fizjologiczna (PBS lub TBS) 2 x 5 min
woda dest. 3 x 2 min
zamknąć w roztworze glicerolu w buforowanej soli fizjologicznej (1:1, pH 8,4-8,6), oglądać w mikroskopie fluorescencyjnym.
7.9.2. Pośrednia metoda immunofluorescencyjna
5% albumina z surowicy bydlęcej w buforowanej soli fizjologicznej 10-20 min
nieznakowane swoiste przeciwciało 10-60 min
buforowana sól fizjologiczna 3 x 5 min
znakowana fluorochromem antyglobulina 30 min
buforowana sól fizjologiczna 2 x 5 min
woda dest. 3 x 2 min
zamykanie j.w.
Wynik: w obu metodach miejsca lokalizacji antygenu w tkance wykazują wyraźną fluorescencję.
Wg powyższych przepisów można również przeprowadzić reakcje z przeciwciałami znakowanymi peroksydazą - wówczas przed blokowaniem albuminą skrawki należy inkubować przez 10 min w 0,3% metanolowym roztworze H2O2, a po płukaniu w wodzie dest. należy przeprowadzić reakcję wykrywającą aktywność peroksydazy (rozdz. 6.10.9).
Podpisy pod ilustracje
Ryc. 7.1. Schemat molekularnej struktury cząsteczki przeciwciała. Gruba linia poprzeczna wyznacza miejsce działania papainy, która rozbija cząsteczkę przeciwciała na fragment Fc i dwa fragmenty Fab. Obok symbol cząsteczki przeciwciała, który będzie używany na następnych rycinach
Ryc. 7.2. Otrzymywanie przeciwciał monoklonalnych
Ryc. 7.3. Schemat bezpośredniej reakcji immunohistochemicznej
Ryc. 7.4. Schemat pośredniej reakcji immunohistochemicznej
Ryc. 7.5. Przykłady kompleksów peroksydaza-antyperoksydaza
Ryc. 7.6. Schemat reakcji z mostkiem antyglobulinowym i kompleksem enzym-antyenzym
Ryc. 7.7. Schemat reakcji awidyna-biotyna: LAB (A) i ABC (B). a - antygen, p - przeciwciało, b - biotyna, z - znacznik (enzym), aw - awidyna
Ryc. 7.8. Schemat reakcji wykrywających reszty cukrowcowe za pomocą lektyn: reakcja bezpośrednia (A), reakcja pośrednia (B), reakcja z udziałem awidyny i biotyny (C). c - reszta cukrowcowa, le - lektyna, p - przeciwciało, b - biotyna, a - awidyna, * - znacznik
Ryc. 7.9. A: Prawidłowa reakcja pomiędzy oligosacharydem (os) a lektyną (le). B: Reakcja kontrolna, w której cukier prosty (cp) blokuje miejsce wiążące lektyny i nie pozwala na jej związanie z oligosacharydem
121