Biofizyka, wykład 8
Genom człowieka - 6 Gpz (wtf?, czemu nie 3,3 Gb? czy 3,3 Gb to haploidalny zestaw?)
da się ustalić sekwencję około 400 nukleotydowe, wiec genom człowieka trzebaby podzielić na 10 000 000 kawałków
WGS - whole genome shotgun
tnie sie restryktazami na przypadkowe kawałki, klonuje się w bakteriach I otrzymuje bibliotekę, potem się składa - kawałki te mają wspólne częsci - do składania wykorzystuje się zaawansowane techniki komputerowe
Sekwencjonowanie krótkich kawałków DNA:
chemiczna metoda Maxam-Gilberta (specyficzne z cięcie łańcucha oligonukleotydowego od końca 5' - selektywne cięcie na lewo od wybranej zasady
na końcu 5' sekwencjonowanego oligonukleotydu znakuje się fosforem radioaktywnym
nie widać po elektroforezie takich cząsteczek, które w wyniku cięcia zgubiły znakowany koniec
stosuje się żele rozdzielające oligonukleotydy z dokładnością do jednego nukleotydu
puszczamy żel w czterech liniach: G, A+G, T+C, C
odczytujemy od końca 5', czyli od dołu żelu (najkrótsze DNA)
trzeba zidentyfikować co jest pierwszym nukleotydem w inny sposób
sekwencjonowanie jednoranzowo do kilkudziesięciu nukleotydów
technika kontrolowanego przerwania replikacji (Sangera) - obecnie rutynowo stosowana, również zautomatyzowana
nie tnie się DNA, ale syntetyzuje
musimy uzyskać kawałki DNA różniące się o 1 nukleotyd
syntetyzujemy nić komplementarną na matrycy
wykorzystujemy polimerazę, warunki zautomatyzowane
polimeraza wymaga primera, jeśli tniemy restryktazami to są lepkie końce, które mogą być primerami
trzeba kilka nukleotydów określić na końcu 5' żeby zrobić primera
4 niezależne probówki, w każdej obok dNTPsów wprowadzamy modyfikowane nukleotydy - 2',3'-deoksynukleotydy - przyłączają się one do nowosyntetyzowanej nici, ale po ich przyłączeniu nie może już dojść do dalszej elongacji (brak grupy hydroksylowej przy węglu 3') - takich dideoksynukleotydów trzeba dodać około 1/100 tego, co nukleotydów zwykłych
otrzymujemy kawałki różnej długości kończące się na 2',3'-dideoksynukleotydach
każdy primer jest znakowany etykietą fluorescencyjną
Przykład sekwenatora - ABI PRISM 3000, wykorzystuje elektroforezę kapilarną (1,6*10^5 nk/dobę, genom w ciągu roku)
Solexa - technika sekwencjonowania z wykorzystaniem superkomputerów i jednoczesnym składaniem wielu kawałków
technika z zastosowaniem szczypiec optycznych (trzymają matrycę i polimerazę) i obserwacja jak porusza się polimeraza przy niedoborze jednego z nukleotydów (jak brakuje jednego nukleotydu to jak polimeraza musi go włączyć to jest przestój i można to za pomocą odpowiednich technik zaobserwować) - trzeba przeprowadzić 4 reakcje
Kwasy nukleinowe
DNA i RN różnią się bardzo długością (DNA 10^4-10^9 nk; RNA 20-4000 nk)
Na poziomie struktury II-rzędowej RNA różni się wyraźnie od DNA; jeśli chodzi o lokalne zwinięcie łańcucha, to jest ono bardzo podobne w RNA i DNA. Są oczywiście różnice.
Struktura II-rzędowa wynika przede wszystkim ze skłonności pojedynczych nukleotydów do przyjmowania określonych konformacji. Możliwości obrotów wokół wielu wiązań pojedynczych, syn/anti (zasada i cukier), C3'endo (N), C2'endo (S), konfiguracje wokół C4' i C5' (3 różne), konfiguracja fosforanu jedna preferowana.
Struktura II-rzędowa DNA i RNA
podwójne helisy (dupleksy)
helisy potrójne (tripleksy)
helisy poczwórne (tetrapleksy, kwadrupleksy)
pętle (róznego typu, np.: szpilka do włosów)
Helisy można przypisać do rodzajów (helisy klasyczne, kanoniczne, regularne - analizując helisy we włókanch nie udało się wejść w szczegóły, więc w modelach każdy nukleotyd jest opisany przez jeden zestaw kątów dwuściennych):
A
B
Z
Modele zaproponowane na podstawie badań krystalograficznych we włóknach kwasów nukleinowych. Na przełomie lat 80 kiedy udało się uzyskać monokryształy krótkich DNA i RNA - potwierdzenie struktur badaniami rentgenowskimi i NMR w roztworze.
DNA - może być B, A i Z
RNA - tylko A i Z - grupa -OH przy węglu 2' oddziałuje z fosforanem i destabilizuje helisę typu B
W przypadku Z helisy powtarzalnym elementem nie jest jeden nk tylko 2 nk, zestaw kątów dla G inny niż dla C, helisa lewoskrętna
rodziny helis
B - B, C, D i E
A - A i A'
Z - Z i Z'
nachylenie względem osi helisy - B i Z niewielkie, A - znaczne
helisa A trochę luźniejsza niż B
Rozejście od środka helisy - w B środek bp 0,5A od geometrycznego środka helisy, w A - 4,4 A
Z - połamanie fosforanowego szkieletu (ten typ helisy możliwy dla sekwencji bogatych w GC)
Czynniki stabilizujące strukturę helisy:
wiązania wodorowe komplemenarnych zasad
oddziaływania warstwowe (stacking)
oddziaływania z otoczeniem wodnym - obie nici są naładowane ujemnie, każdy nk wnosi jeden ładunek ujemny do cząsteczki - dlatego na fosforanach są zgromadzone kationy sodowe, potasowe, magnezowe - które neutralizują ten ładunek i pozwalaja na zbliżenie się dwóch nici i zadziałanie sił krótkozasięgowych i utworzenie helisy