Podstawy biotechnologii żywności
MATERIAŁY DYDAKTYCZNE NR 6
Enzymy amylolityczne otrzymywane na drodze biotechnologicznej
Preparaty enzymatyczne
Znanych jest ponad 2 tys. enzymów, lecz przyjmuje się, że w komórce liczba enzymów może wynosić 2-10 tys. W chwili obecnej ze znanych enzymów tylko niewiele, bo ponad 100 znalazło zastosowanie w technologii żywności. W tej dziedzinie enzymy były używane od tysiącleci w formie nieoczyszczonych preparatów, roślinnych i zwierzęcych. Stosowanie enzymów pochodzenia roślinnego i zwierzęcego w produkcji żywności zapoczątkowano w Ameryce Płn. i Europie Zach., zaś w Azji stosowano enzymy pochodzenia mikrobiologicznego.
W 1990 r. spośród wyprodukowanych preparatów enzymatycznych 62% zastosowano w technologii żywności, 33% jako detergenty i 5% w przemyśle tekstylnym i skórzanym. Wśród preparatów użytych w technologii żywności 60% stanowiły proteinazy (z których większość to preparaty używane w serowarstwie), 30% amylazy i 3% lipazy.
Zastosowanie preparatów enzymatycznych w technologii żywności umożliwia:
pełniejsze wykorzystanie surowców,
podjęcie produkcji nowych półproduktów i produktów żywnościowych,
przyspieszenie procesów technologicznych produkcji żywności,
zmniejszenie kosztów produkcji żywności,
przedłużenie trwałości produktów żywnościowych,
poprawę cech organoleptycznych produktów,
wykorzystanie produktów ubocznych przemysłu spożywczego.
Procesy enzymatyczne przebiegają w łagodnych warunkach, co nie zmienia wartości żywieniowej innych składników surowców i żywności. Jednocześnie proces enzymatyczny może być łatwo kontrolowany i przerwany na określonym etapie.
Enzymy mogą być otrzymywane z tkanek roślinnych i zwierzęcych, jednak ze względu na ograniczenie źródeł produkcji tych enzymów coraz większego znaczenia nabiera produkcja enzymów przy użyciu wyselekcjonowanych drobnoustrojów. Obecnie większość stosowanych w technologii żywności preparatów enzymatycznych produkuje się metodami biotechnologicznymi. Dzięki rozwojowi biotechnologii istnieje możliwość otrzymywania nowych preparatów enzymatycznych, których nie można było dotychczas uzyskać ze źródeł tradycyjnych.
Pierwszy patent dotyczący otrzymywania preparatu enzymatycznego syntetyzowanego przez drobnoustroje uzyskał w 1894 r. w USA Japończyk Tokamine, który opracował technologię otrzymywania preparatu zawierającego głównie β-amylazę, przy użyciu Aspergillus oryzae. Stwierdzono, że drobnoustroje mogą syntetyzować enzymy o tej samej specyficzności, jednak znacznie różniących się parametrami optymalnej i maksymalnej aktywności. Synteza enzymów podczas hodowli danego drobnoustroju zależy od fizycznych warunków hodowli i składu pożywki. Dzięki mutagenizacji metodami fizycznymi lub chemicznymi, a zwłaszcza inżynierii genetycznej, istnieje możliwość uzyskania drobnoustroju wykazującego znaczną nadprodukcję pożądanego enzymu.
Bardzo dobrze oczyszczone enzymy, np. krystaliczne, są produkowane w niewielkiej ilości i są bardzo drogie. Enzymy stosowane w technologii żywności mogą być znacznie mniej oczyszczone, a tym samym znacznie tańsze. Należy jednak zaznaczyć, że muszą one spełniać określone wymagania użytkownika i uzyskać zgodę odpowiednich władz na stosowanie w danej gałęzi przemysłu spożywczego.
Preparaty enzymów amylolitycznych
Amylazami nazywa się wiele enzymów używanych do hydrolizy skrobi na cukry prostsze.
Od dawna amylazy pochodzenia roślinnego były używane w przemyśle spożywczym, a zwłaszcza w przemyśle piwowarskim i spirytusowym. Obecnie w przemyśle spożywczym są stosowane najpowszechniej amylazy otrzymywane przy użyciu drobnoustrojów [
Do grupy amylaz należą min.:
α-amylaza
β-amylaza
glukoamylaza
α-D-glukozydaza
pullulanaza
izoamylaza
transferaza glukozowa cyklodekstryn
Do amylaz atakujących wiązania α-1,4-glikozydowe skrobi należy: α -amylaza, β-amylaza, egzo- α -amylazy. Wiązania α-1,6-glikozydowe rozszczepia izoamylaza i pullulanaza. Glukoamylaza i niektóre pullulanazy mogą rozszczepiać wiązania α -1,4- i 1,6-glikozydowe. Biorąc pod uwagę położenie rozszczepianego wiązania w łańcuchu skrobi, rozróżniamy: 1) endo-amylazy, np. α -amylazy, 2) amylazy znoszące rozgałęzienia cyklodekstrynazy oraz 3) egzoamylazy, tj. glukoamylazy, β-amylazy, egzo-α-amylazy.
Z technologicznego punktu widzenia rozróżniamy:
1) amylazy upłynniające - izo- amylazy, α -amylazy, pullulanazy, cyklodekstrynazy oraz
2) scukrzające - niektóre α -amylazy, β-amylazy, glukoamylazy.
W przemyśle skrobiowym można stosować różne enzymy lub ich mieszaniny, co umożliwia uzyskanie różnych produktów spełniających określone wymagania odbiorców. Końcowe produkty hydrolizy skrobi są różne i zależne od użytego enzymu.
Podatność skrobi na działanie enzymów amylolitycznych jest zależna od jej pochodzenia. Zaobserwowano, że skrobia kukurydziana i sojowa ulega hydrolizie szybciej od skrobi ziemniaczanej.
Enzymy amylolityczne dzięki swoim właściwościom znajdują powszechne zastosowanie m.in. w przemyśle piwowarskim, w procesie zacierania słodu do upłynniania i scukrzania skrobi, w celu przygotowania jej do fermentacji przez drożdże, np. dzięki zastosowaniu enzymów amylolitycznych można obniżyć temperaturę kleikowania skrobi z ok. 75-80°C do temperatury maksymalnie 70°C. Preparaty amylolityczne pochodzenia mikrobiologicznego nabierają szczególnego znaczenia w tym przemyśle w związku ze stosowaniem do otrzymywania brzeczki niesłodowanych surowców (śruty jęczmiennej, ryżowej czy kukurydzianej, pszennej), w których proporcje związków białkowych do skrobi są inne aniżeli w słodzie jęczmiennym.
Amylazy pochodzenia mikrobiologicznego znajdują zastosowanie w gorzelnictwie rolniczym przy scukrzaniu skrobi ziemniaczanej lub zbożowej, umożliwiając częściowe lub całkowite wyeliminowanie słodu, co przynosi znaczne efekty ekonomiczne.
Zastosowanie preparatów amylolitycznych w piekarnictwie powoduje zwiększenie zawartości cukrów fermentowanych wykorzystywanych przez drożdże, co z kolei zwiększa pulchność ciasta.
Enzymy amylolityczne stosuje się także w:
przemyśle zbożowym - do produkcji dekstryn, krystalicznej glukozy, tzw. syropu zbożowego,
cukiernictwie - do odzyskiwania cukru z odpadów cukierniczych,
przemyśle ziemniaczano-krochmalniczym - do produkcji różnych preparatów: środków zagęszczających, dodatków do sosów, budyni, składników odżywek dla dzieci, do produkcji dekstryn i amylozy służącej jako materiał do opakowań środków spożywczych. Preparaty te stosuje się często przy produkcji glukozy i syropów dla przemysłu cukierniczego (do produkcji cukierków i chałwy), owocowo-warzywnego (do produkcji dżemów i marmolad), a także jako środek słodzący w przemyśle piekarniczym i piwowarskim.
W zakładach wytwórczych glukozy na całym świecie daje się zauważyć tendencję do coraz częstszego stosowania kwasowo-enzymatycznych i enzymatycznych metod hydrolizy skrobi zamiast hydrolizy kwasowej.
Enzym α -amylaza hydrolizuje wiązania a-1,4-glikozydowe wewnątrz łańcucha cząsteczki skrobi, co zmniejsza lepkość roztworu. W wyniku działania enzymu upłynniającego ze skrobi otrzymujemy syrop o DE 30 (równoważnik dekstrozowy, tj. liczba cukrów redukujących przypadająca na jednostkę suchej substancji produktu), zawierający glukozę, maltozę, maltotriozy, znaczne ilości oligosacharydów zawierających 6 reszt glukozowych oraz dekstryny graniczne.
W wyniku działania enzymów scukrzających na skrobię otrzymuje się cząsteczki zawierające 1-6 reszt glukozowych oraz α -dekstryny graniczne. W następstwie hydrolizy skrobi otrzymuje się syrop o DE 50.
Należy podkreślić, że α -amylazy grzybowe, w przeciwieństwie do α -amylazy bakteryjnej, wykazują większą aktywność w środowisku o niższej temperaturze i niższym pH.
Drobnoustroje używane do otrzymywania α -amylazy najczęściej hoduje się na pożywce zawierającej skrobię ziemniaczaną lub kukurydzianą z dodatkiem mąki sojowej i namoku kukurydzianego jako źródło azotu. Po pięciodniowej hodowli, przy optymalnym napowietrzaniu, pożywkę ochładza się i oddziela biomasę, a płyn pohodowlany zagęszcza i oczyszcza zgodnie z wymaganiami odbiorcy i warunkami zapewniającymi stabilność enzymu podczas przechowywania. Proteazy, które mogą się znajdować w płynie pohodowlanym i przez to ograniczać zastosowanie preparatu, można usunąć ogrzewając płyn, pod warunkiem, że α -amylaza jest termostabilna. Enzym α -amylaza jest stabilizowany jonami wapnia i w handlu najczęściej są dostępne preparaty płynne, zawierające około 2% enzymu lub też preparaty w proszku o znacznie większym stężeniu enzymu. Należy nadmienić, że dla każdego szczepu drobnoustroju należy dobrać optymalny skład pożywki i warunki hodowli.
W ostatnich latach w celu intensyfikacji biosyntezy α -amylazy geny odpowiedzialne za syntezę enzymu przez B. coagulans, B. licheniformis, B. stearothermophilus, metodą inżynierii genetycznej, przeniesiono do E. coli.
Należy nadmienić, że zarówno od dawna, jak i obecnie źródłem enzymów amylolitycznych, a zwłaszcza α -amylazy, dla przemysłu piwowarskiego jest słód otrzymywany z jęczmienia. Jęczmień o wyrównanej wielkości ziaren, sile kiełkowania większej od 95% i energii kiełkowania powyżej 80%, nawilża się do 40% zawartości wody i poddaje kiełkowaniu przez kilka dni w temp. do 16°C. W słodzie, po wysuszeniu, aktywność wymienionych enzymów znacznie maleje.
Enzym β-amylaza hydrolizuje co drugie wiązanie α -l,4-glikozydowe od końca nieredukującego łańcucha skrobi. Enzym ten hydrolizuje amylozę w 75-91%, a amylo- pektynę w 55-60%. Końcowymi produktami hydrolizy skrobi jest maltoza i dekstryny graniczne.
β-amylaza jest obecna w nasionach soi, jęczmienia, pszenicy i wielu warzyw. Obecnie duże przemysłowe znaczenie w otrzymywaniu hydrolizatów skrobiowych ma β-amylaza otrzymywana z jęczmienia lub słodu.
Dzięki rozwojowi biotechnologii preparaty β-amylazy można otrzymywać przy użyciu bakterii Bacillus polymyxa, B. circulans, B. cereus, B. megaterium. Podobnie jak w przypadku α -amylazy, optymalne warunki hydrolizy skrobi przez β-amylazę zależą od drobnoustroju użytego do jej otrzymywania.
Glukoamylaza hydrolizuje wiązanie α -l,4-glukozydowe od nieredukującego końca łańcucha skrobi, odszczepiając cząsteczki glukozy. Zdolna jest również do hydrolizy wiązania α -1,6-glikozydowego w amylopektynie, ale z wielokrotnie mniejszą szybkością niż wiązanie α -l,4-glukozydowe. Przy użyciu amyloglukozydazy rocznie produkuje się kilkanaście milionów ton hydrolizatów skrobiowych.
W 1947 r. wyizolowano szczep Aspergillus niger NRRL 337, który okazał się przydatny do biosyntezy amyloglukozydazy. W 1950 r., po mutagenizacji, szczep ten został użyty do przemysłowej produkcji amyloglukozydazy. Również szczepy gatunków A. awamori i A. foetidus są stosowane do produkcji amyloglukozydazy.
Jak w przypadku uprzednio omówionych enzymów amyloglukozydaza - w zależności od drobnoustroju - może wykazywać różnice co do optymalnych warunków hydrolizy skrobi. Amyloglukozydazę, zwłaszcza przy produkcji syropów wysoko fruktozowych ze skrobi, używa się często w mieszaninie z α -amylazą i izomerazą glukozową.
Pullulanaza (działa na oligosacharydy zawierające po dwie jednostki glukozy z każdej strony wiązania) i izoamylaza (działa na wiązanie zawierające co najmniej po trzy jednostki glukozy z każdej strony wiązania) hydrolizują wiązania α -l,6-glikozydowe w amylopektynie i umożliwia uzyskanie prostołańcuchowych maltodekstryn.
Izoamylazę otrzymuje się przy użyciu bakterii Cytophaga, Bacillus, Escherichia, Flavobacterium i drożdży Lipomyces.
Pullulanazę otrzymuje się z bakterii Klebsiella, Escherichia, Bacillus, Streptococcus.
Gen odpowiedzialny za syntezę pullulanazy ze szczepu Klebsiella przeniesiono do E. coli. Podczas hodowli E. coli syntetyzował wyłącznie zewnątrzkomórkową pullulanazę.
Izoamylazę uzyskano podczas hodowli szczepów rodzaju Pseudomonas na pożywce zawierającej maltozę. Dodatek glutaminianu w ilości do 0,4% intensyfikuje syntezę enzymu.
Również drożdże Lipomyces kononenkoae są zdolne do syntezy dużych ilości izoamylazy
Literatura:
Biotechnologia żywności. Włodzimierz Bednarski, Arnolda Reps. WNT. 2003 (wyd. 2)