Wpływ niektórych czynników na aktywność enzymów

(wpływ pH, temperatury, aktywatorów-jony Cl^- na szybkość procesu hydrolizy skrobi przez α- amylazę)

Enzymy są to białka proste lub złożone, które katalizują przemiany chemiczne przebiegające w organizmach żywych.

Enzymy jako białka są wrażliwe na działanie czynników niszczących ich strukturę (wyższa temperatura, skrajne wartości pH, jony metali ciężkich); odznaczają się one mniejszą lub większą specyficznością katalizowanych reakcji, wykazują specyficzność grupową (jeden enzym katalizuje pewien typ reakcji, np. katalizę estrów) lub specyficzność absolutną, np. ureaza katalizuje wyłącznie reakcję hydrolizy mocznika.

CEL PRACY:

Celem ćwiczenia jest poznanie wpływu pH, temperatury i jonów chlorkowych na aktywność amylazy w procesie hydrolizy skrobi.

ODCZYNNIKI:

1. Przygotowanie roztworu amylazy śliny:

• wodą ogrzaną do 40°C przepłukać usta.

• pobrać kilkanaście cm³ wody do ust i po kilku minutach wypluć do zlewki.

• czynność powtórzyć kilkakrotnie, aż do uzyskania wystarczającej ilości roztworu amylazy - ok. 400 cm³.

2. Roztwór amylazy po dializie (zostanie przygotowany w trakcie ćwiczenia)

3. Odczynnik Fehlinga

4. 0,005% roztwór J w KJ (jod w jodku potasu)

5. 0.1M NaOH

6. roztwory buforowe o pH = 3.0, 6.0, 10.0

7. 1% NaCl

8. 0,1% HCl

9. 1% roztwór skrobii

WYKONANIE ĆWICZENIA:

1. Stopniowy rozkład skrobi przez amylazę.

1. Przygotować 2 szeregi po 10 oznaczonych probówek. Do probówek w I szeregu wlać po 1 cm³ 0.005% roztworu J w KJ, do probówek II szeregu dodać po kilka kropli 0.1M roztworu NaOH. Do osobnej probówki odmierzyć 5 cm³ świeżo przygotowanego 1% roztworu skrobi i 5 cm³ roztworu amylazy śliny. Po dokładnym zmieszaniu wstawić probówkę z hydrolizatem do łaźni wodnej o temp. 40°C

2. W krótkich odstępach czasu (co 30 sek.) do probówek w obu szeregach wprowadzać próbki hydrolizatu o objętości 0.5 cm³. Obserwować przebieg reakcji barwnej z jodem. Do probówek w II szeregu dodać 2 cm³ roztworu Fehlinga. Probówki II szeregu wstawić do wrzącej łaźni wodnej. Zanotować spostrzeżenia. Skrobia ulega stopniowej hydrolizie tworząc produkty pośrednie: amylo- erytro- achro- i maltodekstryny. Zanik zabarwienia z roztworem J w KJ nosi nazwę punktu achromowego.

3. Wpływ pH:

1. Przygotować 3 probówki zawierające po 2 cm³ buforów uniwersalnych o pH=3.0, 6.0, 10.0. Do każdej probówki odmierzyć po 2 cm³ 1% roztworu skrobi i 2 cm³ roztworu amylazy śliny. Wstawić do łaźni wodnej (temp. 40°C)

2. Przygotować jednocześnie 3 zestawy po 5 probówek. Do każdej probówki odmierzyć 1 cm³ 0.005% roztworu J w KJ. W czasie 0, 10, 15, 20, 30 minut do probówek w szeregach wprowadzić próbki hydrolizatu o obj. 0,5 cm³. Próbki o pH=10 zakwasić na końcu 0,1% HCl.

3. Odwrotność czasu (1/t) potrzebnego do osiągnięcia punktu achromowego jest miarą szybkości reakcji. Sporządzając wykres zależności 1/t od wartości pH można wyznaczyć optymalną wartość pH dla tej reakcji.

2. Wpływ temperatury na aktywność amylazy:

1. Do 3 probówek wprowadzić po 3 cm³ buforu uniwersalnego o pH=6.0 oraz po 3 cm³ 1% roztworu skrobi, 3 cm³ roztworu amylazy i po 2 cm³ 0.005% roztworu J w KJ. Jedną probówkę wstawić do łaźni lodowej o temp. 0°C, drugą do łaźni o temp. 40°C, trzecią pozostawić w temperaturze pokojowej.

2. Ogrzać 3 cm³ roztworu skrobi razem z 3 cm³ buforu do temp. 80°C. Równolegle ogrzać do tej temperatury 3 cm³ enzymu. Zmieszać zawartość obu probówek i inkubować w temperaturze 80°C przez dłuższy czas o kilka minut od tego, który był potrzebny do odbarwienia się skrobi w temp. pokojowej. Po oziębieniu dodać 2 cm³ 0.005% roztworu J w KJ. Porównać szybkość reakcji w różnych temperaturach, zanotować wnioski.

3. Wpływ jonów chlorkowych na aktywność amylazy:

1. Do 4 probówek wlać roztwory odczynników według poniższego wykazu:

Odczynniki	Objętość [cm^3]
		Pr. 1	Pr. 2	Pr. 3	Pr. 4
woda	1	-	1	-
1% roztwór NaCl	-	1	-	1
1% roztwór skrobi	1	1	1	1
niedializowany roztwór amylazy	1	1	-	-
dializowany roztwór amylazy	-	-	1	1
0.005% roztwór J w KJ	0,5	0,5	0,5	0,5

1. Wstawić do łaźni wodnej o temp. 40°C i obserwować czas i kolejność odbarwienia się roztworów w poszczególnych probówkach.

LITERATURA:

1. Kłyszejko-Stefanowicz L. „Ćwiczenia z biochemii”

2. Murray R.K. “Biochemia Harpera”

WF - ćw.6

---