Przedmiot: Kultury tkankowe zwierzęce i roślinne

Semestr 7, Laboratorium

Ćwiczenie 4. Ocena pęknięć pojedynczej i podwójnej nici DNA oraz uszkodzeń oksydacyjnych metodą elektroforezy pojedynczych komórek w żelu agarozowym, „metoda kometowa” (comet assay)

Uszkodzenia materiału genetycznego będące wynikiem ekspozycji organizmu (komórki) na endogenne i egzogenne czynniki genotoksyczne prowadzą do modyfikacji chemicznych DNA i stanowią potencjalne źródło mutacji. Obecność modyfikacji w cząsteczce DNA może mieć istotne znaczenie dla inicjacji i rozwoju procesów nowotworowych. Fizyczne lub chemiczne czynniki zdolne do modyfikacji struktury DNA mogą powodować następujące uszkodzenia: jednoniciowe i/lub dwuniciowe pęknięcia, powstawanie miejsc apurynowych i pirymidynowych (miejsc AP), wiązania krzyżowe DNA-DNA lub DNA-białko, produkty alkilacji, utlenianie zasad azotowych oraz inne zmiany w DNA określane wspólnym terminem „adduktów DNA” (nie zawsze ta nazwa jest prawidłowa). Zróżnicowanie uszkodzeń DNA wymaga różnorodnych technik badawczych. Np. pęknięcia DNA pojawiają się w wyniku działania promieniowania jonizującego, niektórych leków przeciwnowotworowych (cytostatyków), np. bleomycyny, działania wolnych rodników, lub jako etap przejściowy w procesach naprawy przez wycinanie zasad (base excision repair, BER) i nukleotydów (nucleotide excision repair, NER).

Elektroforeza pojedynczych komórek (single cell gel electrophoresis, SCGE), powszechnie znana pod nazwą comet assay pozwala na pomiary poziomu jednoniciowych i dwuniciowych pęknięć DNA, jak również wszelkich modyfikacji DNA możliwych do przekształcenia w pęknięcia na drodze chemicznej (miejsca AP, niestabilne addukty), lub enzymatycznej (głównie uszkodzenia oksydacyjne). Parametrem bezpośrednio mierzonym jest zmiana właściwości elektroforetycznych zmodyfikowanego kwasu nukleinowego obserwowanych w postaci wędrówki nici DNA w polu elektrycznym. Podczas elektroforezy, DNA pozostający w miejscu zatopionej komórki, częściowo zakotwiczony w opornych na warunki lizy resztkowych strukturach jądra, migruje w stronę anody z prędkością zależną od stopnia fragmentacji. Stopień migracji DNA przy zachowaniu stałych warunków procedury, pozostaje porcjonalny do stopnia fragmentacji jego łańcucha. Obraz mikroskopowy uszkodzonej komórki poddanej procedurze elektroforezy wyglądem przypomina kometę: „głowa” odpowiada miejscu, w którym unieruchomiono komórkę przed lizą, „ogon” stanowią pętle i fragmenty nici DNA zrelaksowane i uwolnione ze struktur jądrowych w wyniku pęknięć.

Zastosowanie metody kometowej: badania podstawowe nad mechanizmami uszkadzania i naprawy DNA, badania genotoksyczności, analiza uszkodzeń DNA powstałych in vivo w wyniku ekspozycji na czynniki zawodowe i środowiskowe, diagnostyka schorzeń wynikających z zaburzeń naprawy DNA (kseroderma pigmentosum, XP, Nijmegen breakage syndrome, NBS, ataksja teleangiektazja AT), badania z dziedziny eko-toksykologii itp.

Materiały:

1. Komórki nowotworowe z hodowli, np. komórki białaczki K562, czerniaka Me45, fibroblasty ludzkie NHDF, lub wyizolowane z krwi obwodowej limfocyty

2. Szkiełka mikroskopowe podstawowe i nakrywkowe

3. Agaroza o normalnej topliwości (normal melting point, NMP agaroze); r-r 0,5% (100 mg agarozy + 20 ml wody destylowanej, lub podwójne ilości)

4. Agaroza o niskiej temperaturze topnienia (low melting point, LMP agaroze); r-r 1% (200 mg agarozy plus 20 ml wody destylowanej)

5. Podłoże RPMI lub DMEM (z 10% surowicy do inkubacji naprawczej)

6. Roztwór lizujący: przygotowywany z roztworów stałych („stock solution” wg tabeli, (końcowe stężenia: 2,5 M NaCl (146,4 g/), 100mM Na₂EDTA (37,2 g/l), 10 mM Tris HCl (1,21 g/l), pH10; 1% Triton X-100 (10 ml/l), Triton X-100 dodawać bezpośrednio przed lizą!)

7. Bufor do elektroforezy, końcowe stężenia: 300mM NaOH (12 g/l), 1 mM Na₂EDTA (0,372 g/l); przygotowywać wg tabeli roztworów „stock”, nie wcześniej niż 1 godz. przed elektroforezą

8. Bufor neutralizujący: 0,4 m Tris-HCl (48,44 g/l), pH 7,5 (przygotowywać z roztworu „stock” na 1 godz. przed użyciem)

9. Aparat do elektroforezy poziomej z zasilaczem

10. Kuchenka mikrofalowa

11. Łaźnia wodna (temp.45^oC)

12. „Kominki” (naczynia do lizy i płukania szkiełek- neutralizacji)

13. R-r bromku etydyny lub innego fluorochromu (IP, DAPI), 2µg/ml w wodzie destylowanej

Przebieg doświadczenia:

1.Przygotowanie roztworów do metody „kometowej”:

Przed rozpoczęciem pracy z komórkami przygotować tylko r-r do lizy zgodnie z tabelką rozcieńczeń podaną na końcu protokołu.

Pozostałe roztwory przygotowujemy w odpowiednim czasie, nie wczesniej niż na 1 godz przed użyciem

2.Przygotowanie zawiesiny komórek, zawieszenie w agarozie LMP i naniesienie na szkiełko mikroskopowe powleczone agarozą (szkiełka przygotowane wcześniej przez prowadzacycch lub przez inne grupy)

1.Przygotować roztwór 1% agarozy LMP w PBS, rozdzielić po 100 μl do próbówek eppendorfa, wstawić do termobloku o temp 45 ^oC

2.Zebrać komórki z hodowli lub wcześniej wyizolowane limfocyty i zawiesić w medium hodowlanym w ilości ~800 tys/ml (policzyć w komorze Bürkera przynajmniej w jednym kwadracie)

3. Komórki rozdzielić po 1 ml do dwóch próbówek opisanych: K (kontrola) i H₂O₂ (woda utleniona indukuje uszkodzenia DNA). Do próbówki opisanej H₂O₂ dodać 100 µl r-ru 1mM wody utlenionej w PBS (końcowe stężenie 100 µM H₂O₂) i wstawić na 5 min do inkubatora. Uwaga: Zamiast wody utlenionej możemy zastosować inny czynnik indukujący pęknięcia DNA, np. promieniowanie UV

4. Szkiełka powleczone agarozą opisać ołówkiem:

„K czas 0”, „K czas 60 min”, „H₂O₂ czas 0”, „H₂O₂ czas 15 min”, „H₂O₂ czas 30 min”, „H₂O₂ czas 60 min”

5. Po 5 min inkubacji komórki traktowane wodą utlenioną odwirować (2000 rpm, 3 min) i zawiesić w 1 ml medium hodowlanego

6. Pobrać po 50 µl zawiesiny komórek (obu grup) do próbówek eppendorfa i dodawać do 100 µl roztworu 1% agarozy LMP o temp ok. 45^oC wymieszać przez pipetowanie i natychmiast nanosić po 100 µl próbki na szkiełko powleczone agarozą (odpowiednio opisane dla czasu 0) i natychmiast przykrywać szkiełkiem nakrywkowym i odłożyć na tacę (wstawić do lodówki)

7. Resztę komórek inkubować dalej, aby po 15 , 30 i 60 min pobrać kolejne próbki i po zmieszaniu z agarozą nanieść na szkiełka, przykryć szkiełkami nakrywkowymi i schłodzić

8. Po schłodzeniu zdjąć szkiełka nakrywkowe ze wszystkich próbek

3. Liza komórek

Wstawić ostrożnie szkiełka z zatopionymi komórkami do „kominka” z buforem lizującym. Lizować komórki w 4 ^oC (nowotworowe przez ½ godz, limfocyty przez 1 godz).

W czasie lizy przygotowujemy szkiełka dla następnych grup jak niżej:

- Przygotować 0,5% roztwór agarozy o normalnej topliwości (100mg/20 ml lub podwójnie). - Zagotować w kuchence mikrofalowej (ważyć i uzupełniać ubytek wody).

- Czyste szkiełka podstawowe (wypłukane w etanolu lub metanolu, przetarte i wysuszone lub opalone nad płomieniem) zanurzyć w gorącym roztworze agarozy.

- wyjąć i wytrzeć do sucha jedną stronę (zaznaczyć ołówkiem stronę pokrytą agarozą, położyć na tacy (po wysuszeniu warstwa agarozy jest niewidoczna)

Przygotować także bufor do elektroforezy!

4. Denaturacja alkaliczna i elektroforeza

1. Po zakończeniu lizy szkiełka umieścić w aparacie do elektroforezy, zalać świeżo przygotowanym buforem do elektroforezy (pH 13) i inkubować w temp ~10-15 ^oC przez 15 min (następuje relaksacja nici i ekspresja uszkodzeń wrażliwych na działanie roztworów alkalicznych, tzw. „alkali-labile sites”)

2. Po 15 min przystąpić do elektroforezy: natężenie 300 mA, optymalne napięcie 0,8-1,0 V/cm. Ustalić napięcie, a natężenie regulować poziomem buforu do elektroforezy.

Uwaga: Powtarzalność metody zależy w dużej mierze od tego etapu , dlatego należy ściśle przestrzegać raz przyjętych warunków elektroforezy!

3. Elektroforezę prowadzić w temperaturze ~10-15 ^oC przez 25 min (w lodówce lub w szafie chłodniczej, osłonić od światła).

4. W tym czasie przygotować roztwór do neutralizacji.

5. Neutralizacja

Po wyjęciu z aparatu do elektroforezy szkiełka wstawić do schłodzonego roztworu neutralizującego na 5 min. Neutralizację powtórzyć jeszcze 2-krotnie (w świeżym buforze)

6. Utrwalanie i barwienie

Szkiełka po neutralizacji można bezpośrednio wybarwiać roztworem bromku etydyny (EB, ethidium bromie, Sigma) w stężeniu 2 µg/ml nanosząc kroplę barwnika na szkiełko i przykrywając szkiełkiem nakrywkowym. Wybarwione szkiełka oglądać w mikroskopie fluorescencyjnym przy odpowiednim filtrze. Analizować co najmniej 50 komet na każdym szkiełku (lepiej 100 komet). Wilgotne szkiełka umieszczone w wilgotnej komorze można przechowywać do 48 h.

Praktycznie jest jednak szkiełka utrwalić w 96% etanolu (lub metanolu). Można je wówczas przechowywać przez dłuższy okres (do następnego ćwiczenia, w którym dokonujemy obserwacji mikroskopowych). Przed analizą szkiełka utrwalone wybarwia się za pomocą EB jak wyżej.

Łączny czas wykonania ćwiczenia: 4 godz. zegarowe.

Bufory do metody kometowej (comet assay)

Lysis solution

Final concentration	Stock solution	Working volumes of lysis solution
				100 ml	150 ml	250 ml	300 ml	400 ml	650 ml	700 ml	850 ml
2.5 M NaCl	5 M	50	75	125	150	200	325	350	425
0.1 M EDTA	0.5 M	20	30	50	60	80	130	140	170
10 mM TrisHCl	1 M	1	1.5	2.5	3	4	6.5	7	8.5
	H2Obidist	29	43.5	72.5	87	116	188.5	203	246.5

Notes: To be prepared 1 h before using, mixed carefully in cylinder

Store at +4^oC (on ice)

Buffer for electrophoresis

Final concentration	Stock solution	Working volumes of buffer
				350 ml	700 ml	1050 ml
300 mM NaOH	10 M	10.5	21	31.5
1mM EDTA	0.5 M	0.75	1.4 ml	2.1 ml
	H2Obidist	338.75	677.6	1016.4

Notes: To be prepared 1 h before using, mixed carefully in cylinder

Check pH (13)

Store at +4^oC (on ice)

Buffer for neutralization

Final concentration	Stock solution	Working volumes of buffer
				100 ml	600 ml	1200 ml	1800 ml
0.4 M Tris-HCl pH 7.5	1 M Tris	40	240	520	720
	H2Obidist	60	360	680	1080

Notes: To be prepared 1 h before using, mixed carefully in cylinder

Store at +4^oC (on ice)

---