AIDS - diagnostyka immunoenzymatyczna i molekularna

Okienko serologiczne - okres od wniknięcia wirusa do wytworzenia przeciwciał.

• p24 - najważniejszy antygen we wczesnej diagnostyce

Rodzaje badań:

1. badania przesiewowe: ELISA, HIV-DUO

2. badania potwierdzające: Western blot

3. badania dzieci matek seropozytywnych

4. badania monitorujące przebieg zakażenia lub skuteczność terapii

Techniki badań:

1. wykrywanie przeciwciał

2. wykrywanie antygenu p24

3. wykrywanie wirusowego RNA

4. hodowla wirusa

Wykrywanie antygenów i przeciwciał

Metoda ELISA

• technika mikropłytek - płytki opłaszczone:

• p-ciałami - gdy szukamy antygenów

• antygenami - gdy szukamy p-ciał

• obecnie stosuje się testy III generacji - rekombinowane antygeny i syntetyczne peptydy o antygenowości białek wirusowych

Schemat:

• zamiast enzymu można użyć związku o właściwościach fluorescencyjnych

Metoda HIV-DUO

• pozwala na oznaczenie obecności przeciwciał przeciwko wirusowi i obecności antygenu p24 (co umożliwia skrócenie okienka serologicznego)

Western blot

• na pasek nitrocelulozowy naniesione są (fabrycznie) antygeny wirusowe

• pasek umieszcza się w surowicy

• obecne w surowicy przeciwciała wiążą się z antygenami

• związane przeciwciała wykrywa się np. metodą immunoenzymatyczną

• wynik testu jest (+) gdy obecne są przeciwciała przeciwko co najmniej 3 białkom produkowanym przez 2 geny lub gdy obecne są przeciwciała przeciwko produktom genów env, pol i gag

Przeciwciała należy oznaczać w odstępach 2-4 tygodniowych. 4x wzrost miana świadczy o ostrym zakażeniu.

Testy przesiewowe

1. test ELISA

2. test HIV-DUO

• (+) wynik testu przesiewowego → powtórka testu przesiewowego

• ponowny wynik (+) → potwierdzenie testem Western Blot

U dzieci kobiet seropozytywnych przeciwciała w surowicy mogą pochodzić od matki - należy założyć hodowlę komórkową limfocytów → po 2 tygodniach szukamy w nadsączu antygenów p24.

Wynik wątpliwy ((+) wynik testu przesiewowego i (-) WB) - powtórka testu po 3-4 miesiącach.

Hodowla komórkowa wirusa

• hoduje się komórki krwi obwodowej

• w płynie hodowlanym oznacza się HIV-RNA, rewertazę i antygen p24

• zastosowanie:

• u dziecka matki seropozytywnej

• po ekspozycji zawodowej

Techniki biologii molekularnej

• stosowane w okresie okienka serologicznego

• metody:

• PCR - reakcja łańcuchowej polimerazy

• NASBA - zależna od sekwencji amplifikacja kwasu nukleinowego

• bDNA - metoda rozgałęziania DNA

NASBA

• stosuje się w przypadku poszukiwania RNA

• polega na syntezie nici DNA na matrycy pierwotnej nici RNA, matrycowe RNA ulega rozłożeniu przez nukleazy, powstałe DNA jest matrycą do syntezy kolejnej nici DNA → powstaje dwuniciowy DNA → na matrycy DNA powstaje RNA

bDNA

• polega na amplifikacji sond przyłączonych do określonych miejsc w kwasie nukleinowym

PCR

• stosowana, gdy (+) wynik ELISA lub HIV-DUO i (-) WB

• metoda ta umożliwia poszukiwanie DNA/RNA wirusowego

• warunkiem jest znajomość sekwencji nukleotydów poszukiwanego kwasu

• używa się kilkunukleotydowych sekwencji - primerów (starterów) - komplementarnych do fragmentu poszukiwanego kwasu

• w przypadku obecności poszukiwanego kwasu następuje związanie primera z komplementarnym odcinkiem, co zapoczątkowuje polimeryzację DNA

Schemat:

DNA	← DNA ← odwrotna transkryptaza ← RNA
↓
denaturacja w 90^oC
↓
dodanie starterów i renaturacja (przez 2 minuty)		30x powtórzenie cyklu → powielenie materiału genetycznego około 1 mld. razy
↓
związanie starterów
↓
polimeraza DNA syntezuje na bazie starterów komplementarne nici z nukleotydów obecnych w roztworze

Do powielonych nici dodaje się znakowane sondy z enzymem i wykrywa je metodami immunoenzymatycznymi.

Zastosowanie PCR:

1. HIV

2. HBV

3. HCV

4. CMV

Cytometria przepływowa

• stosowana np. do oznaczania populacji limfocytów T (CD3+): TH (CD4+) i TC (CD8+)

2/3

AB

AG

AB

AG

płukanie

AB

E

przeciwciało z enzymem

substrat zmieniający kolor pod wpływem enzymu

odczyt fotometryczny

---