BIOCHEMIA - SPRAWOZDANIE

Temat: właściwości aminokwasów i białek

Cele:

Celem tego ćwiczenia jest poznanie niektórych reakcji charakterystycznych stosowanych w wykrywaniu aminokwasów i białek. Umożliwiają one:

* odróżnienie aminokwasów od innych związków organicznych

* odróżnienie białek od wolnych aminokwasów

* wykrywanie aminokwasu zawierającego grupę hydrosuflidową (- SH)

* wykrywanie aminokwasów aromatycznych

* poznanie właściwości białek np. wytrącanie się ich z roztworu pod wpływem różnych czynników (denaturalizacja)

Potrzebne odczynniki:

1. 1-proc. roztwór glicyny

2. roztwór białka kurzego (białko z jednego jaja rozpuścić w 100 ml

2-proc. roztworze chlorku sodowego)

3. roztwór białka kurzego - białko (2) dwukrotnie rozcieńczyć 2-proc.

roztworze chlorku sodowego

4. 0,1 proc. acetonowy roztwór ninhydryny

5. 6-molowy roztwór NaOH

6. 0,5-proc. roztwór siarczanu miedziowego

7. stężony kwas azotowy

8. 1-proc. roztwór octanu oławianego

9. 10-proc. roztwór kwasu trichlorooctowego

10. nasycony roztwór siarczanu amonowego

11. krystaliczny siarczan amonowy

12. 1-proc. roztwór kwasu octowego

Szkło i inne pomoce:

* statyw z probówkami

* pipeta serologiczna 1ml

* pipeta serologiczna 5 ml

* zlewka na 400 ml

* kolby stożkowe na 100 ml (2 szt.)

* lejek

I. Reakcja ninhydrynowa

Za pomocą tej reakcji możliwe jest odróżnienie wolnych aminokwasów od innych związków organicznych. W obecności wolnego aminokwasu i ninhydryny po podgrzaniu powstaje niebieskofioletowy produkt kondensacji. W reakcji bierze udział grupa
2-karboksylowa i 2-aminowa.

Do jednej probówki wlewamy za pomocą pipety serologicznej 1 ml glicyny, do drugiej zaś wlewamy 1 ml rozcieńczony roztwór białka kurzego. Do obu probówek należy dolać po 1 ml ninhydryny i ogrzewać mieszaniny przez 3 min. we wrzącej łaźni wodnej. Po upływie wyznaczonego czasu w pierwszej probówce możemy zaobserwować powstanie barwnego ciemno-fioletowy produktu kondensacji. Natomiast w drugiej probówce widzimy brązową ciecz z osadem, osadzonym na ściankach szkła.

Wnioski:

W reakcji z ninhydryną roztwór z wolnym aminokwasem powstaje produkt o barwie ciemnego fioletu. Wolny aminokwas znajduje się w probówce pierwszej. W drugiej probówce znajduje się inny związek organiczny (białko), ponieważ wytrąca się osad.

II Reakcja biuretowa Piotrowskiego

Reakcja ta pozwala wykryć obecność wiązania peptydowego w białku lub peptydzie zawierającym przynajmniej dwa takie wiązania.

Do jednej probówki wlewamy za pomocą pipety serologicznej 1 ml glicyny, do drugiej zaś wlewamy 1 ml rozcieńczony roztwór białka kurzego. Do obu probówek należy dolać po 2 ml NaOH i jedną kroplę siarczanu miedziowego. Następnie trzeba wymieszać i dodać pozostałe 0,5 ml siarczanu miedziowego.

W probówce z białkiem obserwujemy barwny produkt reakcji z Cu⁺² o kolorze fioletowym. W probówce z glicyny obserwujemy niebieskie zabarwienie, które jest wynikiem obecności Cu⁺² w roztworze.

Wnioski:

W probówce drugiej znajdują się białka bądź peptydy ponieważ jon miedziowy tworzy, w środowisku zasadowym, z wiązaniami peptydowymi kompleks o zabarwieniu fioletowym. W probówce pierwszej również możemy zaobserwować zmianę barwy, jednak jest ona skutkiem występowania miedzi w roztworze - jest to barwa odczynnika.

III Reakcja ksantoproteinowa

Dzięki tej reakcji możemy wykryć obecność aminokwasów zawierających grupę aromatyczną zarówno wolnych jak i wchodzących w skład białek i peptydów.

Do jednej probówki wlewamy za pomocą pipety serologicznej 1 ml glicyny, do drugiej zaś wlewamy 1 ml rozcieńczony roztwór białka kurzego. Do obu probówek należy dolać po 1 ml stężonego kwasu azotowego. Następnie ogrzewamy mieszaniny przez ok 5 min. we wrzącej łaźni wodnej, studzimy i bardzo ostrożnie dodajemy, do każdej probówki, po 3,5 ml NaOH.

W probówce z rozcieńczonym roztworem białka kurzego możemy zaobserwować jak powstaje barwny (pomarańczowy) produkt reakcji. W probówce z glicyny nie widać żądnej zmiany, roztwór pozostaje bezbarwny.

Wnioski:

W probówce drugiej (rozcieńczony roztwór białka kurzego) znajdują się aminokwasy posiadające grupę aromatyczną, ponieważ powstają, pod wpływem kwasu azotowego, nitrowe pochodne pierścieni aromatycznych, mające zabarwienie pomarańczowe w środowisku zasadowym.

IV Reakcja mająca na celu wykrycie grupę hydrosuflidową (- SH)

Do jednej probówki wlewamy za pomocą pipety serologicznej 1 ml glicyny, do drugiej zaś wlewamy 1 ml rozcieńczony roztwór białka kurzego. Do obu probówek należy dolać po 2 ml NaOH oraz 0,5 ml octanu ołowianego. Następnie ogrzewamy mieszaniny przez 3-5 min. we wrzącej łaźni wodnej i studzimy.

W probówce z rozcieńczonym roztworem białka kurzego możemy zaobserwować wytrącenie się ciemnoszarego osadu. Natomiast w probówce z glicyną nie widać żadnych zmian.

Wnioski:

Aminokwasy zawierające grupę -SH reagują w podwyższonej temperaturze z wodorotlenkiem sodu dając sole ołowiane w tym nierozpuszczalny siarczek ołowiany mający postać ciemnoszarego osadu. Takie aminokwasy znajdują się w probówce z rozcieńczonym roztworem białka kurzego.

Denaturalizacja (reakcje V, VI, VII)

Denaturalizacja - określenie nieodwracalnych zmian w strukturze i utraty biologicznych właściwości białka, na skutek działania różnych czynników.

V Koagulacja cieplna białka

Próbka białka, zostaje poddana działaniu wysokiej temperatury.

Do probówki odmierzamy 1 ml rozcieńczony roztwór białka kurzego, następnie podgrzewamy nad palnikiem (w naszym doświadczeniu zamiast palnika użyliśmy wrzącej łaźni wodnej). Roztwór pod wpływem wysokiej temperatury mętnieje oraz wytrącają się drobinki białego osadu.

VI Wytrącanie białka kwasem

Do probówki odmierzamy 1 ml rozcieńczony roztwór białka kurzego, a następnie dodajemy do niego 1 ml roztworu kwasu trichlorooctowego.

Roztwór pod wpływem zmiany stężenia jonów wodorowych mętnieje oraz wytrącają się drobinki białego osadu.

VII Wytrącanie białka solami metali ciężkich

Do probówki odmierzamy 1 ml rozcieńczony roztwór białka kurzego, a następnie dodajemy kroplami 1 ml octanu ołowianego.

Roztwór pod wpływem wysokiego stężenia soli metalu ciężkiego mętnieje oraz wytrącają się drobinki białego osadu.

Wnioski (V, VI, VII): W skutek wysokiej temperatury, zmiany stężenia jonów wodorowych lub wysokiego stężenia soli metalu ciężkiego, wtórna struktura (słabe wiązania wodorowe oraz oddziaływania hydrofobowe) białka ulega zniszczeniu, natomiast struktura pierwotna (mocne wiązania peptydowe) pozostaje bez zmian. Białko traci swoje biologiczne właściwości.

---