Data wykonania: 28.11.2007

Wydział: Chemiczny

Kierunek: BIOTECHNOLOGIA

„Wyznaczanie aktywności Fosfataz”

Sławomir Szczotka

Damian Loska

I MATERIAŁY I ODCZYNNIKI:

• 16 probówek o pojemności 10ml

• - pipety automatyczne

• - wirówka

• - probówki plastikowe

• - roztwór Na₂CO₃

• - roztwór p-NPP-Na₂

• - roztwór 0.14m NaCl

• - spektrofotometr SPEKOL

• - osad czynny

II CEL ĆWICZENIA:

Celem ćwiczenia było oznaczenie aktywności fosfataz w osadzie czynnym.

III PRZEBIEG ĆWICZENIA:

Do 12 probówek ( po 2 na każdą próbę) odmierzono po 1 ml osadu czynnego, a następnie dodano do każdej po 1 ml roztworu p-NPP-Na₂. Odnotowano czas wykonania tej czynności i kolejno po 5, 10, 15, 20, 25 i 30 minutach przerywano inkubację kolejnych probówek (dodając po 1ml Na₂CO₃ w celu zatrzymania reakcji hydrolizy enzymatycznej).

Następnie probówki wirowano w ~ 3000- 3500 obr./min koło 2 minut.

Wykonano również 3 próby ślepe:

prob. nr 1 - 1ml NaCl + 1ml p-NPP-Na2 + 1ml Na₂CO₃

prob. nr 2 - 2ml NaCl + 1ml Na₂CO₃

prob. nr 3 - 1ml NaCl + 1ml osadu czynnego + 1ml Na₂CO₃

Pierwsza próba ślepa sporządzona została w celu wyzerowania spektrofotometru przy mierzeniu ekstynkcji prób właściwych, natomiast druga i trzecia pozwoliły wyznaczyć nam współczynnik korekcyjny.

Po wyznaczeniu współczynnika korekcyjnego i wyzerowaniu spektrofotometru, zmierzono ekstynkcje próbek.

Współczynnik korekcyjny = 0,028

Numer próbki	Ekstynkcja	Ekstynkcja pomniejszona o tło	Czas inkubacji (min.)	Stężenie y=24,224x+1,1663	Uśrednione stężenie nitrofenolu [mg/dm3]
1	0,066	0,038	5	2,086812	2,123148
		0,069		0,041			2,159484
	2	0,167		0,139		10	4,533436	4,448652
		0,160		0,132			4,363868
	3	0,170		0,142		15	4,606108	4,55766
		0,166		0,138			4,509212
	4	0,205*		0,177*		20	5,453948*	5,090588
		0,190		0,162			5,090588
	5	0,195*		0,167*		25	5,211708*	5,575068
		0,210		0,182			5,575068
	6	0,230		0,202		30	6,059548	5,998988
		0,225		0,197			5,938428

* W przypadku kiedy jedna z wartości w poszczególnej próbie była wartością odstającą w porównaniu do wcześniej uzyskanych, wartość tę odrzucono ( 0.205 w próbie 4 i 0.195 w próbie 5 )

Obliczenie aktywności fosfataz:

AF=Δp/Δt

Δp = y(30) - y(5) = 0,3327 *30+2,6359 - 0,3327*5 -2,6359 = 13,5893 [mg/dm³]

Δt=(30-5)/60= 0,42 [h]

AF=Δp/Δt=13,5893 /0,42 =32,3555 [mg/l*h]

IV WNIOSKI:

Na podstawie przeprowadzonego doświadczenia można wywnioskować, że reakcja hydrolizy p-nitrofenylofosforanu przebiegła tak, jak przewidywano, tzn. stężenie nitrofenolu rosło wraz ze wzrostem czasu inkubacji. Świadczy to o aktywności fosfataz w badanych próbkach. W zakresie czasu 30 minut można zauważyć prostoliniowy przyrost nitrofenolu.

---