Rola fosforanu pirydoksalu PLP- koenzymu aminotransferaz w procesach biochemicznych i jego występowanie w produktach naturalnych (witamina B6)

Fosforan pirydoksalu (PLP, pochodna witaminy B6) jest grupą prostetyczną wielu enzymów katalizujących procesy transformacji aminokwasów (aminotransferazy, syntazy, karboksylazy, racemazy) zarówno w bakteriach jak i w organizmach wyższych.

W ostatnich latach enzymy zależne od fosforanu pirydoksalu wzbudziły zainteresowanie biotechnologów, ponieważ znajdują one zastosowanie przede wszystkim w biosyntezie aminokwasów i ich pochodnych, w produkcji różnego rodzaju farmaceutyków oraz w ochronie środowiska. Naukowców ciekawi także to, że pomimo podobnej struktury enzymy zależne od PLP katalizują reakcję o różnym mechanizmie i należą od różnych klas enzymów. Ustalenie pokrewieństwa pomiędzy tymi białkami pozwoliło by zrozumieć ich ewolucję oraz lepiej poznać szlaki metaboliczne z ich udziałem. Enzymy PLP-zależne uczestniczą w procesach życiowych komórek roślin, zwierząt i mikroorganizmów. Biorą one bezpośredni udział w metabolizmie aminokwasów i ich pochodnych, a także uczestniczą w szlakach przemian aminocukrów oraz innych metabolitów zawierających grupę aminową. Selektywne zahamowanie aktywności niektórych enzymów PLP-zależnych u mikroorganizmów pozwoliłoby na skuteczniejszą walkę z patogenami. W związku z tym enzymy te stanowią coraz częściej cząsteczki docelowe dla farmaceutyków. Mutacje i defekty w strukturze enzymów PLP-zależnych mogą powodować poważne zakłócenia szlaków metabolicznych i choroby warunkowane genetycznie.

Fosforan pirydoksalu posiada dwie cechy, dzięki którym może katalizować szereg reakcji związanych z metabolizmem aminokwasów: za pośrednictwem swojej grupy aldehydowej może tworzyć wiązanie kowalencyjne z aminokwasami oraz, jako związek silnie elektrofilowy (dzięki obecności atomu azotu w pierścieniu aromatycznym), posiada zdolność przyciągania elektronów stabilizując w ten sposób ujemnie naładowane produkty pośrednie powstające podczas katalizy.

Enzymy zależne od fosforanu pirydoksalu, katalizują szereg różnych reakcji, takich jak: przekształcenie łańcucha bocznego przy zachowaniu ugrupowania α-aminokwasowego, dekarboksylacja i transaminacja do α-ketokwasów. Z teoretycznego punktu widzenia reakcje te polegają na przegrupowaniach elektronów w cząsteczce zasady Schiffa, która jest wspólnym produktem pośrednim tych procesów. Grupa aldehydowa PLP tworzy zasadę Schiffa z grupą ε aminową lizyny znajdującej się w centrum katalitycznym enzymy pod nieobecność substratu. Atom azotu w pierścieniu pirydynowym ma ładunek dodatni i dlatego powoduje przegrupowanie elektronów w cząsteczce. Wynikiem tego jest stan mezomerii, który jednakże może nastąpić tylko wtedy, gdy któryś z podstawników przy atomie węgla w pozycji α aminokwasu zostaje odłączony jako kation. Tym podstawnikiem może być reszta aminokwasowa R lub grupa karboksylowa (dekarboksylacja). Przejściowy stan materii ulega stabilizacji przez addycję protonu do atomu węgla α i następnie hydrolizę zasady Schiffa do aminy pierwszorzędowej. Podstawnikiem tym może być także (i jest w większości przypadków) atom wodoru przy atomie węgla w pozycji α.

Odłączenie protonu stabilizuje podwójne wiązanie przy atomie węgla w pozycji α, a powstały produkt przejściowy rozpada się hydrolitycznie na fosforan pirydoksaminy i α-ketokwas. Jest to reakcja polegająca na przeniesieniu grupy aminowej na koenzym, przy jednoczesnej zmianie stopnia utlenienia węgla α cząsteczki aminokwasu (zmiana pojedynczego wiązania na podwójne w aminokwasie i podwójnego na pojedyncze w cząsteczce koenzymu).

Jedną z reakcji katalizowanych przez enzymy zależne od fosforanu pirydoksalu, wspomnianą przeze mnie jest transaminacja. Jest to reakcja, w której może uczestniczyć wiele naturalnych aminokwasów i ma ogromne znaczenie w przemianie materii, ponieważ pozwala organizmowi oszczędnie gospodarować azotem i wytwarzać aminokwasy z odpowiadających im szkieletów węglowych. Transaminacja jest katalizowana przez enzymy zwane transaminazami (aminotransferazami) i polega na przeniesieniu grupy aminowej z aminokwasu na szkielet węglowy, występujący w formie α-ketokwasu, zgodnie z reakcją:

Badacze Braunstein i Kritzman, jako pierwsi wykazali duże znaczenie transaminacji uzyskując w homogenatach tkanek zwierzęcych przeniesienie grupy aminowej z szeregu aminokwasów na α- etoglutaran, w wyniku czego tworzył się glutaminian. Później wykazano w tej przemianie udział fosforanu pirydoksalu jako koenzymu. W 1953r. Snell przeprowadził reakcję analogiczną przeniesienia grup NH₂ z alaniny, asparaginianu i glutaminianu na kwas glioksylowy w obecności fosforanu pirydoksalu. Aminokwas wchodzi z związanym z enzymem fosforanem pirydoksalu w połączenie typu zasady Schiffa, po czym następuje przegrupowanie utworzonego wiązanie podwójnego, a następnie jego rozerwanie. W wyniku takich przemian wydziela się pozbawiony grupy aminowej α-ketokwas oraz fosforan pirydoksaminy, który z innym α-ketokwasem wchodzi w analogiczną, lecz w odwrotnym kierunku przebiegającą reakcję. Po przejściu przez stadium zasady Schiffa wydziela się wolny aminokwas i regeneruje fosforan pirydoksalu. Wszystkie stadia reakcji są odwracalne, a co za tym idzie cała reakcja jest w pełni odwracalna. Fosforan pirydoksalu o jego pochodne w trakcie reakcji są stale połączone z katalizującą te reakcję aminotransferazą.

Inną reakcją katalizowaną przez enzymy zależne od fosforanu pirydoksalu jest dekarboksylacja aminokwasów. Polega ona na rozerwaniu wiązania między grupą karboksylową i resztą cząsteczki, w wyniku czego wydziela się CO₂ i powstaje amina. Enzymy katalizujące odłączenie grupy karboksylowej od aminokwasów, zwane dekarboksylazami aminokwasowymi, są rozpowszechnione zwłaszcza wśród bakterii, choć są również spotykane w innych organizmach. Enzymy te nie występują stale w komórkach bakterii, ale są wytwarzane w przypadku, gdy organizmy te bytują na pożywce bogatej w odpowiedni aminokwas, a więc ich synteza ma charakter procesu indukowanego przez obecność substratu w podłożu. Specyficzność dekarboksylaz w stosunku do określonego aminokwasu jako substratu jest bardzo duża. Dzięki niej oczyszczone preparaty dekarboksylaz są stosowane do manometrycznego oznaczania zawartości poszczególnych aminokwasów w ich mieszaninie na zasadzie wydzielanego CO₂. Dekarboksylazy aminokwasowe, podobnie jak aminotransferazy, wymagają współdziałania fosforanu pirydoksalu, z którym aminokwasy wchodzą w połączenie typu zasady Schiffa. Dekarboksylacja aminokwasów prowadzi do wytworzenia tzw. biogennych amin, czyli związków o dużej aktywności fizjologicznej. W wyniku tej przemiany, obok ważnych biochemicznie produktów pośrednich w syntezie szeregu hormonów i innych związków czynnych powstają również substancji o własnościach toksycznych , charakterystyczne dla procesów gnicia. Do amin o charakterze hormonów lub produktów przejściowych przy ich powstawaniu należy mp. Histamina, która jest produktem dekarboksylacji histydyny, stymulująca wydzielanie soków trawiennych.

Witamina B6 znajduje się w wielu produktach żywnościowych. Najwięcej jest jej w mięsie, rybach, drobiu, jajkach, mleku i drożdżach. Dobrym źródłem tej witaminy są warzywa, takie jak kapusta, groszek zielony, kalafiory, marchew, szpinak, ziemniaki. Występuje w dużej ilości w zbożach (szczególnie kiełkach pszenicy), ziarnach soi, fasoli, orzeszkach ziemnych.

Bibliografia:

1. Kączkowski Jerzy, „Podstawy biochemii”, WNT Warszawa 1995

2. Bereta J. A. Koj, „Zarys biochemii”, Wyd E.J.B. 2009

3. Michał Woźniak, Maria Koziołkiewicz, „Enzymy zależne od fosforanu pirydoksalu - charakterystyka i zastosowanie w biotechnologii”, praca przeglądowa Wydział Biotechnologii i Nauk o Żywności, Instytut Biochemii Technicznej, Politechnika Łódzka, Łódź 2005

Magdalena Ryba, grupa 11B1, WIiTCh Politechnika Krakowska

---