J.Gołębiowska „Mikrobiologia rolnicza.”

A.A.Slayers, D.D.Whitt „Mikrobiologia” (Różnorodność, chorobotwórczość i środowisko).

W.J.H.Kunicki-Goldfinger „Życie bakterii.”

Udział drobnoustrojów w obiegu azotu w przyrodzie

Drobnoustroje wiążące azot atmosferyczny przy udziale roślin motylkowych Drobnoustroje prokariotyczne są zdolne do wiązania azotu cząsteczkowego oraz do jego magazynowania we własnych ciałach jak również nagromadzenia go w podłożu. Wyróżnia się dwa rodzaje drobnoustrojów wiążących azot: asymilatory N₂ wolno żyjące w glebie oraz asymilatory N₂ zdolne do wiązania azotu tylko przy udziale roślin motylkowych. Spotyka się wśród nich chemoorganotrofy tlenowe jak i beztlenowe oraz bakterie i sinice należące do autotrofów. Łączy je obecność w komórce enzymu- nitrogenazy - jest on czynny w procesie wiązania azotu atmosferycznego.

Podział Rhizobium na gatunki; stadia rozwoju symbiozy Rhizobium z roślinami motylkowymi

Rhizobium to pałeczki g-, urzęsione monotrichalnie. Podział tego rodzaju bakterii na gatunki oparty jest na zdolności ich współżycia z różnymi rodzajami roślin motylkowych. R.leguminosarum- groch, wyka, peluszka, bobik; R.trofolii- różne kończyny; R.phaseoli- fasola; R.meliloti- lucerna, nostrzyk; R.lupini- łubin, seradela; R.japonicum- soja; R. z grupy „Cow pea”- Arachis, Vigna (Cow pea) i inne. Cztery pierwsze bakterie należą do grupy bakterii brodawkowych, szybko rosnących i wytwarzających duże ilości śluzów. Pozostałe rosną wolniej. Niektóre bakterie mogą krzyżowo zakażać rośliny. R.leguminosarum może zakażać groch i kończynę. Podobnie zachowują się R.lupini oraz R.japonicum Rząd Leguminosae czyli rośliny motylkowe, rodzina Papilionaceae to główne rośliny współżyjące z bakteriami Rhizobium. Rhizobium przechodzą swoisty cykl rozwojowy, który jest charakterystyczny dla bakterii żyjących w symbiozie z roślinami. W hodowli na podłożach sztucznych i w glebie nie obserwuje się zmiany form charakterystycznych dla Rhizobium w tkance narośli korzeniowych. Wyróżnia się formy wegetatywne i bakteroidalne Rhizobium. Formy wegetatywne występują w glebie, w hodowlach na podłożach sztucznych i w pierwszych stadiach symbiozy. Są to krótkie ruchliwe pałeczki gramm-ujemne, często zawierające charakterystyczne granule wewnątrz plazmy. Występowanie tych granul zależy od wieku hodowli i warunków środowiska. Formy bakteriodalne wytwarzają się wyłącznie w tkance bakteroidalnej, wykształcającej się w naroślach korzeniowych. Charakteryzują się one zmiana kształtu i wielkości komórek. W zależności od gatunku Rhizobium i rośliny z którą współżyją mogą one tworzyć formy cytrynkowate lub też w kształcie liter Y,T. U niektórych bakterii np. u R.lupini nie ma wyraźnej zmiany kształtu, dochodzi jedynie do powiększenia objętości komórek. Struktura wewnętrzna komórek wegetatywnych oraz bakteroidów również zasadniczo się od siebie różni. Np. u R.trofolii w bakteroidach nie obserwuje się charakterystycznej dla komórek wegetatywnych granulacji plazmy. Stadium przejściowe stanowią formy bardzo drobne, które uwalniają się z rozkładających się narośli mi dają początek nowym komórkom wegetatywnym. Rhizobium to bakterie heterotroficzne. Rozwijając się wewnątrz rośliny otrzymują od niej węgiel oraz materiał energetyczny potrzebny do budowy własnych komórek. Korzystają przy tym z azotu asymilowanego z powietrza udostępniając go roślinie. Gdy Rhizobium nie żyje w symbiozie z roślinami, ale w glebie lub na pożywkach sztucznych wykorzystuje ona do wzrostu proste węglowodany oraz mannitol jako źródła węgla i energii. Nie wykazuje ona w tych warunkach zdolność do redukcji i wiązania azotu, pobiera ona go z podłoża, przy czym najłatwiej asymiluje azot amonowy. Rhizobium nie posiadając enzymów proteolitycznych nie mogą przyswajać azotu białkowego, jedynie R.meliloti potrafi korzystać z tej formy azotu.

Rozwój symbiozy która czasami może graniczyć z pasożytnictwem bakterii na roślinie, zależy od wielu czynników:

-wirulencja i aktywność szczepu Rhizobium,

-właściwości współżyjącej rośliny,

-warunki ekologiczne środowiska (gleby).

Szczepy wirulentne to takie które z łatwością wnikają do korzeni roślin i wchodzą z rośliną w symbiozę. Szczepy aktywne to te które we współżyciu z rośliną zdolne są do wiązania azotu w ilościach wystarczających dla zaspokojenia potrzeb własnych oraz potrzeb rośliny. Jeżeli szczep jest wirulentny i nieaktywny, dochodzi do pasożytnictwa ponieważ bakterie korzystają ze składników wytwarzanych przez rośliny nie dając nic w zamian. Nawet w obrębie tych samych rodzajów roślin możemy wyróżnić gatunki lub odmiany mniej lub bardziej podatne na symbiozę. Są to cechy uwarunkowane genetycznie. O podatności na symbiozę może decydować skład chemiczny roślin. Obecność kumaryny u nostrzyków może wpływa hamująco na współżycie tych roślin z bakteriami. Aby roślina mogła dostarczać bakteriom węglowodanów, nie ograniczając przy tym własnego zapotrzebowania na produkty fotosyntezy, musi znaleźć się w warunkach korzystnych dla jej rozwoju.

Bakterie brodawkowe dla których normalnym siedliskiem jest gleba, gromadzą się wokół korzeni roślin motylkowych, które stymulują rozwój swoich symbiontów. Nawiązanie symbiozy przechodzi poprzez kolejne stadia:

-wniknięcie bakterii do korzenia poprzez włośnik, skręcający się przy udziale kwasu indolilooctowego,

-wytworzenie nici infekcyjnej, jako forma samoobrony rośliny przed wtargnięciem obcego organizmu do jej tkanek,

-rozmnażanie się bakterii, hipertrofia (przerost) komórek roślinnych i wykształcenie się narośli korzeniowych,

-przechodzenie komórek bakterii poza nić infekcyjną i rozmnażanie się ich w naroślach,

-zmiana formy wegetatywnej komórek Rhizobium w formę bakteroidalną,

-wytwarzanie przez roślinę błon kopertowych (membrane enveloppe) wokół pojedynczych lub zgrupowanych bakteroidów, co wiąże się z okresem aktywnej współpracy rośliny z bakteriami, wyrażającej się ilością związanego azotu,

-degeneracja i rozpad narośli korzeniowych, przechodzenie bakterii powrotem do gleby. W okresie aktywnego współżycia roślin z bakteriami narośle występujące na korzeniach rozmieszczone są przeważnie przy korzeniu głównym i osiągają dość znaczną wielkość oraz charakteryzują się czerwonawym zabarwieniem. Barwnik ten to leghemoglobina, jest to hemowy związek żelaza, podobnie jak hemoglobina krwi, stanowi ona świadectwo intensywnego przebiegu procesu wiązania azotu. Formy wegetatywne nie wiążą azotu atmosferycznego. Rośliny motylkowe wzbogacają glebę w azot, stanowią również niezbędny element płodozmianu dla zachowania urodzajności gleby. Rośliny motylkowe mogą we współżyciu z bakteriami wiązać rocznie do 100 kg N. Największą zdolnością wiązania azotu odznacza się lucerna , może ona związać 300 kg N/ha. Warunki środowiska a w szczególności warunki glebowe istotnie wpływają na aktywną symbiozę. Na ogół wymagania roślin motylkowych oraz wymagania Rhizobium pokrywają się. Bakterie oraz cały układ symbiotyczny są szczególnie wrażliwe na:

-odczyn gleby,

-obecność azotu mineralnego,

-warunki świetlne, zapewniające roślinie maksymalna intensywność fotosyntezy. Rhizobium nie rozwijają się w glebach silnie zakwaszonych, dlatego też rośliny motylkowe nie wytwarzają w tych warunkach brodawek i nie korzystają z azotu atmosferycznego. Wapnowanie gleby powoduje wzrost populacji bakterii brodawkowych i poprawia warunki symbiozy oraz wzrost roślin. Obecność azotu mineralnego w środowisku (duże ilości azotowych nawozów) hamuje wzrost symbiozy. Rośliny motylkowe dobrze reagują na startowe dawki azotu nie przekraczające 30 kg N/ha., wyższe dawki natomiast są niezwykle korzystne dla grochu, który nie tworzy wtedy układu symbiotycznego z bakteriami. Także lucerna może być żywiona azotem mineralnym, jest to jednak nieekonomiczne, łubin natomiast reaguje na nawożenie obniżeniem plonu.

Symbioza pomiędzy rośliną motylkową a bakteriami zachodzi gdy w glebie jest mało azotu, a dużo molibdenu, oraz przy obojętnym pH. Tryptofan jest substancją której roślina używa do stymulowania wzrostu bakterii wokół jej korzeni, przechodzi on w kwas indoliloctowy który powoduje skręcenie oraz uszkodzenie struktury włośnika. Przez te uszkodzone miejsca wnikają do wnętrza rośliny bakterie. Pod koniec okresu wegetacyjnego narośla korzeniowe pękają i powstają formy przejściowe bakterii dające początek formom wegetatywnym.

Kwas indolilooctowy (kwas indolilo-3-octowy, IAA z ang. indoleacetic acid) - organiczny związek chemiczny będący hormonem roślinnym z grupy naturalnych auksyn. Reguluje wzrost i rozwój roślin. Struktura IAA jest podobna do aminokwasu tryptofanu, z którego jest syntetyzowany przez rośliny. Fitohormon IAA jest syntetyzowany w merystemie wierzchołkowym pędu, liściach i nasionach.

Drobnoustroje wiążące azot atmosferyczny, pozostające w symbiozie z roślinami:

-Rhizobium, Sinorhizobium, Mesorhizobium symbioza z roślinami motylkowymi,

- Brodyrhizobium symbioza z soją i ryżem,

- Franka promieniowiec żyjący z symbiozie z korzeniami olszy i brzozy,

- Anabaenasinica żyjąca w symbiozie z roślinami należącymi do mchów właściwych.

Niesymbiotyczne wiązanie azotu atmosferycznego

Drobnoustroje heterotroficzne wiążące azot atmosferyczny

Następujące bakterie heterotroficzne posiadają zdolność do wiązania azotu atmosferycznego:

-tlenowce- Azotobacter, Azotomonas, Beijerinckia, Derxia, Achromobacter

-mikroaerofile- Pseudomonas, Arthrobacter, Flavobacterium, Mycobacterium, Aerobacter

-beztlenowce- niektóre gatunki Clostridium, np. Clostridium pasteurianum, Clostridium butyricum, Clostridium pectinovorum

Drobnoustroje autotroficzne wiążące azot atmosferyczny

Następujące bakterie autotroficzne posiadają zdolność do wiązania azotu atmosferycznego:

-bakterie fotosyntezujące- Rhodospirillum, Chlorobium, Chromatium,

-sinice- Nostoc, Cylindrospermum, Anabaena.

Różne gatunki bakterii wiążą różne ilości azotu. Zależy to od ich właściwości fizjologicznych, oraz warunków w których się rozwijają. Do najaktywniejszych asymilatorów zalicza się: Azotobacter, oraz Clostridium. Największe znaczenie przy uzupełnianiu azotu w glebie mają takie bakterie jak: Arthrobacter, oraz Aerobacter. Bakterie te zaliczane są do oligonitrofilów, czyli organizmów mało wymagających pod względem żywienia azotowego, ponieważ mogą ten składnik przyswajać z atmosfery.

Azotobakter- jest to bakteria właściwa (Eubacteriales). Jego komórki maja wielkość 2-3μm na 3-6μm. W glebie komórki są małe, w hodowlach laboratoryjnych znacznie większe. W obecności węglowodanów, zwłaszcza cukrów prostych azotobakter wytwarza otoczki i duże ilości śluzu. W obecności benzoesanu produkuje on ciemny barwnik, zbliżony do melanin. Komórki azotobakter izolowane z ryzosfery różnych roślin różnią się wyglądem. Azotobacter są bakteriami przystosowanymi bardziej do życia w glebie lub w wodzie. A.chroococcum, najczęściej spotykany jest w glebie, natomiast A.vinelandii czasem występuje w glebie jednak najczęściej w wodzie. W wodzie rozwija się gatunek A.agilis o urzęsionych komórkach nie wytwarzających cyst. Cysty wytwarzają gatunki żyjące w glebie, umożliwia to bakteriom przetrwanie długich okresów w glebach przesuszonych. Pokrewne azotobakterowi są takie gatunki jak Azotomonas, Azotomonas, Beijerinckia i Derxia występujące raczej w klimacie tropikalnym. Azotobacter wiąże najwięcej azotu ale zużywa przy tym dużo energii. Dla związania 5-20 mg N rozkłada on w podłożu doświadczalnym około 1 g cukru z czego 70% mineralizuje całkowicie i uwalnia w postaci CO₂, 12% asymiluje a z reszty wytwarza produkty uboczne np. śluzy. Azotobakter jest bezwzględnym tlenowcem co oznacza dużą wrażliwość na natlenienie środowiska. Innym czynnikiem mającym znaczenie dla jego wzrostu jest zakwaszenie podłoża. pH powinno dla niego wynosić 5-8, ale optimum jego wzrostu i rozwoju nie przekracza pH 7-7,5. Azotobakter jest też bardzo wymagający w stosunku do przyswajalnych związków fosforu. Dla 5 mg N zużywa on 1 mg P₂O₅. Dane te dotyczą hodowli omawianej bakterii w warunkach laboratoryjnych.

W glebie w warunkach naturalnych wzrost azotobaktera uzależniony jest od pracy całego zespołu drobnoustrojów glebowych, które mogą wytwarzać tzw. mikroklimat potrzebny tej bakterii. Bakteria ta może występować w glebach różnych stref klimatycznych. W 1g gleby liczba komórek tej bakterii wynosi do 10 000. W Polsce azotobakter występuje w 50% gleb uprawnych. Prawdopodobną przyczyna małej ilości tej pożytecznej bakterii w naszym kraju jest zakwaszenie gleb Polski. W glebie ważniejszy od stężenia jonów wodorowych jest odpowiedni dla tej bakterii potencjał oksudoredukcyjny. Wiąże się to z wrażliwością tej bakterii na natlenienie. Powodem ograniczenia wzrostu azotobaktera może też być azot. W obecności związków azotowych w podłożu bakteria ta traci zdolność do wiązania azotu atmosferycznego co może ujemnie wpływać na jej wzrost. W tych warunkach azotobakter korzysta z azotanów, azotu amonowego oraz aminokwasów jako źródeł N, nie posiada jednak enzymów proteolitycznych. Najważniejszą funkcją azotobaktera jest uzupełnianie w glebie rezerw azotu glebowego, wytwarza substancje melaninowe- prekursory związków humusowych. Również śluzy wytwarzane przez azotobaktera są substratem do powstawania związków humusowych. Syntezuje on substancje biologicznie czynne - witaminy, auksyny które stymulują wzrost roślin i innych drobnoustrojów żyjących w glebie.

Clostridium jest beztlenowcem z rzędu Eubacteriales wytwarzającym przetrwalniki. Może ona żyć jako mikroaerofil w warunkach ograniczonego dostępu tlenu. Jest to drobnoustrój szeroko rozpowszechniony w naszych glebach. W 1 g gleby ilość jej komórek może dochodzić do 100 000. Najczynniejsze przy wiązaniu azotu są tu: Clostridium pasteurianum, Clostridium butyricum oraz Clostridium acetobutylicum. Bakterie z tej grupy wykorzystują różne źródła węgla. Od azotobaktera bakterie te różnią się tym iż nie przyswajają kwasów organicznych, mogą natomiast asymilować pentozy słabo przyswajalne dla azotobaktera. Bakteria ta w przeciwieństwie do azotobaktera wymaga dodania do pożywki wyciągu z drożdży oraz/lub peptonu. Wykazuje ona dużą tolerancję na odczyn środowiska i rośnie w szerokich granicach pH. Można ją spotkać w glebach kwaśnych jak również alkalicznych. Clostridium jest beztlenowcem więc bakteria ta dobrze rozwija się na glebach źle przewietrzanych oraz podmokłych, występuje jednak w glebach przewiewnych żyjąc w mikrofiszach o ograniczonym dostępie tlenu.

Bakterie fotosyntezujące- częściej występują one w wodzie niż w glebie. Są to przeważnie zielone lub purpurowe bakterie siarkowe. Rosną one na świetle w warunkach beztlenowych i w tych warunkach wiążą azot. Ilości azotu asymilowanego przez bakterie są niewielkie. W warunkach glebowych nie stanowią one jednak istotnego czynnika w biologicznym wiązaniu i nagromadzaniu azotu w glebie.

Sinice- wiążą azot w ilościach znacznie mniejszych niż azotobakter. Są to bakterie autotroficzne, fotosyntezujące, nie korzystającymi z węgla organicznego. Są więc najdoskonalszymi autotrofami zadowalającymi się wyłącznie N₂, CO₂, H₂O oraz solami mineralnymi. Zdarzają się tu gatunki rosnące w ciemności i korzystające z energii zawartej w prostych związkach organicznych np. w glukozie, czy sacharozie. Sinice mogą żywić się również azotem mineralnym co ogranicza ich zdolność do wiązania azotu atmosferycznego. Bez ulegania lizie mogą one wydzielać zasymilowany azot do środowiska w postaci amoniaku, amidów, peptydów lub wolnych aminokwasów.

Przemiana azotu w glebie

Azot wiązany jest wyłącznie przez autotrofy. Azot wiązany jest przez sinice. Źródłem azotu w środowisku jest azot atmosferyczny (80% składu powietrza w postaci N₂). W warunkach naturalnych azot dostaje się do gleby poprzez bakterie, które jako jedyne organizmy potrafią go wiązać. Niewielkie ilości azotu dostają się do gleby dzięki opadom oraz wyładowaniom atmosferycznym. Przemiany azotu mają charakter cykliczny. Utrzymanie zawartości azotu w glebie na odpowiednim poziomie odbywa się dzięki procesom przeprowadzanym przez drobnoustroje. Do najważniejszych zaliczyć możemy: mineralizację azotu organicznego, oraz zbiałczanie azotu mineralnego, magazynowaniu go w ciałach drobnoustrojów a następnie akumulacji w wielkocząsteczkowych połączeniach humusowych. Zmiany zawartości azotu związane są z: wprowadzeniem azotu do gleby w nawozach mineralnych, pobieraniem azotu przez rośliny oraz z wymywaniem go. Regulacja polega na procesach kompensacji prowadzonych przez drobnoustroje. Drobnoustroje potrafią korzystać z różnych form azotu pochodzącego z gleby, niezależnie od jego stężenia. Jeżeli podaż form przyswajalnych azotu odpowiada jego popytowi (w szczególności formie najbardziej zmineralizowanej NO₃^-) to poziom azotu w glebie utrzymuje się na właściwym dla danej gleby poziomie. Jeżeli procesy mineralizacji, lub dopływ azotu wraz z nawozami będą przeważały nad asymilacją, wówczas zawartość NO₃^- w glebie ulegnie zwiększeniu. Zmniejszona mineralizacja przy podwyższonej asymilacji będzie sprzyjała ograniczeniu zawartości form przyswajalnych azotu w glebie. Przemiany azotu glebowego zachodzą z dużą szybkością. Jeżeli przychód azotu jest większy od rozchodu, dochodzi do zmagazynowania azotu np. w próchnicy.

Procesy:

Amonifikacja NO₃-------NH₃

Nitryfikacja NH₄⁺-------NO₂^- i NO₃^-

Denitryfikacja NO₃^--------N₂ N₂O NH₃

Amonifikacji

Wstępne stadium mineralizacji azotu organicznego z resztek roślinnych oraz zwierzęcych stanowi przede wszystkim proteoliza, ponieważ głównym składnikiem azotowym tej masy jest białko. Proteoliza to rozkład białka, przeprowadzają ją drobnoustroje posiadające enzymy proteoliczne. Białko ze względu na swoją wielkość musi być rozkładane poza komórką. Proteazy czyli enzymy proteoliczne są enzymami trawiennymi i wydzielane są przez komórkę do środowiska zewnętrznego. Są to enzymy hydrolityczne, powodują rozpad wiązań peptydowych (CO-NH), prowadząc do powstania peptonów, polipeptydów i peptydów. Dalszy etap rozkładu białek to uwolnienie cząstek aminokwasów z peptydów. Drobnoustroje proteolityczne stanowią liczną i zróżnicowana grupę. Enzymy proteoliczne są często indukowane i produkowane przez komórki drobnoustrojów gdy w środowisku brakuje prostszych form azotu. Zdolność do proteolizy posiadają bakterie oraz grzyby. Również niektóre promieniowce wykorzystują azot białkowy. Zdolność rozkładania kazeiny oraz rozpuszczania żelatyny uważana jest u bakterii za cechę taksonomiczną. Niektóre drobnoustroje rozkładają białko tylko w ilościach potrzebnych im do spożycia, inne prowadzą ten proces znacznie intensywniej pozostawiając duże ilości produktów rozkładu w środowisku. W związku z tym na zestalonym podłożu żelatynowym można zauważyć wzrost kolonii bakterii oraz grzybów lub też wzrost i rozpuszczanie żelatyny wokół kolonii w wyniku jej rozkładu pod wpływem aktywnych proteaz. Do typowych bakterii proteolitycznych należą te które rozkładają białko w dużym nadmiarze. Należą do nich liczne gatunki Pseudomonas i Bacillus. Możliwe jest iż proces rozkładu białek w glebie prowadzony jest etapami przez różne organizmy o różnych uzdolnieniach, produkujące różne enzymy. Nie wiadomo które drobnoustroje wykorzystują białko w glebie jako źródło energii, węgla i azotu a które korzystają wyłącznie z azotu białkowego. Dalszym etapem mineralizacji azotu organicznego jest amonifikacja, która prowadzi do powstania amoniaku- najbardziej zredukowanej formy azotu mineralnego. Amonifikatory podobnie jak drobnoustroje proteolityczne są grupą dość zróżnicowaną pod względem gatunkowym. Mogą one nie produkować proteaz, ale żywią się azotem aminokwasowym nagromadzonym w procesie proteolizy prowadzonym przez inne drobnoustroje. Amonifikatory mogą korzystać z różnych aminokwasów, a mogą też wykorzystywać jako źródło azotu tylko wybrane aminokwasy. Na przykład kwas glutaminowy jest szczególnie łatwo przyswajany przez amonifikatory glebowe. Amonifikacja może być procesem tlenowym lub beztlenowym. Działają przy tym bardzo różne enzymy uczestniczące w procesach dysymilacji. W zależności od rodzaju enzymów i sposobu ich działania w warunkach tlenowych oprócz amoniaku powstają jako produkty rozkładu ketokwasy, oksykwasy, lub lotne kwasy tłuszczowe. W warunkach beztlenowych pod wpływem dekarboksylaz produktami przejściowymi mogą być aminy, CO₂, oraz inne produkty procesów redukcji jak np. indol. Proces amonifikacji zachodzi w glebie niezależenie od warunków ekologicznych. Tłumaczy się to dużą różnorodnością grupy drobnoustrojów zaliczanych do amonifikatorów, wśród których można znaleźć tlenowce i beztlenowce, psychrofile, mezofile, oraz termofile, jak również organizmy przystosowane do rozwoje w środowisku kwaśnym i alkalicznym, w mniejszej i większej wilgotności. W glebie zależnie od warunków ekologicznych proces ten może przebiegać z różnym nasileniem. Znane jest pojęcie amonifikacji netto i amonifikacji brutto. Amonifikację brutto określa ta ilość azotu amonowego którą otrzymuje się z procesów mineralizacji substancji organicznej. Amonifikacja netto wyraża się natomiast ilością amoniaku powstającego przy rozkładzie związków organicznych z uwzględnieniem równocześnie zachodzących strat (nitryfikacja, ulatnianie się, asymilacja). Określanie wartości amonifikacji brutto możliwe jest jedynie przy zastosowaniu metod z użyciem azotu znakowanego.

Nitryfikacji

Jest to proces biologiczny prowadzony przez chemolitotrofy. Polega on na utlenianiu jonu amonowego do azotanów. Badania nad tym procesem pochodzą z prac Schloesinga i Müntza. Bakterie które nazywane są nitryfkarorami wyodrębnił Winogradski. Nitryfikacja jest to proces swoisty, przebiegający w dwóch etapach prowadzonych przez dwie różne grupy bakterii. Do pierwszej grupy utleniającej NH₄⁺ do NO₂^- określanej jako nitroso, należą rodzaje Nitrosomonas, Nitrosospira, Nitrosocystis i Nitrosoglea. Wszystkie te bakterie należą do bakterii właściwych i mają kształt drobnych pałeczek, niewiele różnią się morfologicznie między sobą. Rodzajem najbardziej rozpowszechnionym i najbardziej reprezentatywnym dla tej grupy jest Nitrosomonas. Do drugiej grupy nazywanej nitro i utleniającej NO₂^- do NO₃^- zalicza się rodzaj Nitrobacter. Należy tu również rodzaj Nitrocystis, który rzadko występuje w naszych glebach i nie odgrywa większej roli w procesie nitryfikacji. Energię potrzebną do asymilacji i redukcji CO₂ nitryfikatory czerpią z procesów utleniania formy amonowej azotu. Są to więc typowe chemolitotrofy. Oba te procesy są mało wydajne pod względem energetycznym, co pociąga za sobą praktyczne konsekwencje. Chcąc zdobyć dostateczną ilość energii potrzebną do własnych procesów metabolicznych, bakterie te zmuszone są do przerobienia dużych ilości materiału energetycznego, a więc do utleniania znacznych ilości NH₄⁺, a następnie NO₂^-. Z badań laboratoryjnych wynika że dla zasymilowania 1 mg węgla Nitrosomonas przerabia 30-70 mg N/NH⁺, a Nitrobacter 70-100 mg N/NO₂^-. Liczebność tych bakterii w normalnych warunkach w glebie nie przekracza 1000 komórek na 1 g gleby, tak więc wykonują one ogromna pracę, przetwarzając jon amonowy na azotanowy. Nitrosomonas i Nitrobacter wykazują znaczne różnice w swych wymaganiach w stosunku do środowiska. Obie te grupy bakterii są wrażliwe na zakwaszenie środowiska i ich optymalne pH waha się w granicach 6,8-9,0, a zahamowanie wzrostu następuj przy pH 5,0, przy czym Nitrosomonas ma pod tym względem większe zdolności przystosowawcze niż Nitrobacter. Azotany nawet jeżeli nie zostaną przyswojone przez rośliny, nie nagromadzają się w glebie, lecz szybko ulegają przemianom biologicznym i niebiologicznym. Denitryfikacja biologiczna i wymywanie prowadzą do trudnych do opanowania strat azotu z gleby. Dla zahamowania nitryfikacji która prowadzi do zbyt szybkiej produkcji tej labilnej formy azotu, próbuje się stosować inhibitory. Spośród inhibitorów syntetycznych stosowanych w doświadczeniach na uwagę zasługują dwucyjanodwuamid i 2-chloro-6-(trójchlorometylo)-pirydyna. Oba te związki jako substancje organiczne ulegają powolnemu rozkładowi i nie ma obaw by mogły akumulować się w glebie. Ponadto różne preparaty ochronne roślin mogą również hamować wzrost niektórych drobnoustrojów glebowych, miedzy innymi nitryfikatorów. Takimi substancjami są chloropikryna, bromek metylu, dwubromek etylenu, N-metylodwutio-karbaminian sodu (Vapam). Efektywność i słuszność stosowania inhibitorów nitryfikacji nie są do końca znane ponieważ mało jest roślin które chętniej korzystają z azotu amonowego niż azotanowego, a systematyczna produkcja tej formy azotu w glebie z punktu widzenia racjonalnego żywienia roślin ma ogromne znaczenie. Zabezpieczenie azotu przed stratami przez okresowe zbiałczanie azotanów i zatrzymywanie ich w ciałach drobnoustrojów oraz racjonalna sorpcja fizykochemiczna formy amonowej mogą mieć większe znaczenie praktyczne. Trudniejsze do opanowania są straty spowodowane wymywaniem azotanów wprowadzonych z dużymi dawkami nawozów mineralnych. Nadmierne stosowanie tych nawozów może być również niebezpieczne ze względu na nagromadzenie się w tych warunkach azotanów w tkankach roślinnych. Ta forma azotu jest toksyczna dla zwierząt. Również przejściowe zwiększanie zawartości azotynów w wyniku przemian azotowych w glebie może być szkodliwe nawet dla samych roślin.

Denitryfikacji i zbiałczania azotanów

Redukcja azotanów to proces przeciwstawny nitryfikacji i polega on na przeprowadzaniu utlenionych związków azotu mineralnego do związków bardziej zredukowanych: NO₂^-, N₂O, N_2, NH₃. Można przy tym wyróżnić trzy różne procesy:

1. denitryfikacje właściwą - wymagającą warunków beztlenowych, w przebiegu której azotany lub azotyny redukowane są do produktów gazowych N₂, N₂O; cały azot redukowany w tych reakcjach ulatnia się z gleby,

2. denitryfikację do amoniaku- odbywającą się w warunkach względnie beztlenowych, podczas której powstający amoniak może ulotnić się lub ponownie wejść w obieg azotu glebowego,

3. zbiałczanie azotanów- kiedy jon NO₃^- zużywany jest do budowy komórek drobnoustrojów.

Układy enzymatyczne, biorące prawdopodobnie udział w reakcjach denitryfikacji, są złożone i znajomość ich nie jest jeszcze do końca znana. Przyjmuje się obecnie teorię Campbella i Leesa. Według niej produkty przejściowe w procesie nitryfikacji i denitryfikacji są jednakowe, w kluczowy związek stanowi nitrohydroksylamina może być również substratem dla reakcji tworzenia tlenku azotowego. Azot w formie gazowej powstaje w niektórych procesach chemicznych w glebie, np. w reakcjach aminokwasów z azotynami. Znane są i inne typy reakcji, w których uwalnia się tlenek azotawy NO. Najczęściej jednak gaz ten jest utleniany w glebie od razu do NO₃^-. Do denitryfikatorów zdolnych do prowadzenia denitryfikacji właściwej, tzn. do redukcji NO₃^- do N₂ lub N₂O należą liczne rodzaje. Są to głównie bakterie z rodzajów Bacillus, Pseudomonas, Achromobacter, Micrococcus i Spirillum. Zdolności denitryfikacji właściwej nie stwierdzono u promieniowców i grzybów pleśniowych. Bakterie denitryfikujące są najczęściej względnymi beztlenowcami. W warunkach względnie beztlenowych prowadzą one denitryfikację częściową, redukując azotany do amoniaku, który w przypadku dużej wartości stosunku C : N i przy większym natlenieniu środowiska jest przez te drobnoustroje asymilowany i zbiałczany we własnych komórkach. W warunkach bezwzględnie beztlenowych te same organizmy prowadzą denitryfikację właściwą. Wśród właściwych denitryfikatorów występują również chemolitotrofy, które dla procesów anabolicznych korzystają z energii chemicznej. Są to: Micrococcus denitrificans, który jest autotrofem względnym i może korzystać z substancji organicznych lub utleniać wodór kosztem tlenu azotanów, oraz Thiobacillus denitrificans, bezwzględny autotrof, utleniający tlenem pochodzącym z azotanów tiosiarczany lub inne częściowo zredukowane związki siarki. Siarka elementarna utleniana jest słabo. Jako związek przejściowy w tym procesie powstaje NO. Tlen hamuje denitryfikację. Doświadczenia wykazały że zawartość tlenu w hodowli Pseudomonas denitrificans nie może przekraczać 0,2 ppm (jednostka zawartości składnika stosowana w analizie śladowej, 10^-6). Przy większej zawartości tlenu reduktazy azotynowa i azotanowa ulegają utlenieniu i proces denitryfikacji zostaje zahamowany. W warunkach naturalnych o przebiegu denitryfikacji w glebie decydują:

1. Obecność azotu w formie azotynowej i azotanowej,

2. Warunki beztlenowe,

3. Dostateczna zawartość substancji będących donorami elektronów.

Przebieg denitryfikacji zależy również od składu i charakteru pokrywy roślinnej. Ogólnie ujmując wpływ rośliny na denitryfikację, trzeba zaznaczyć iż działa ona w dwóch przeciwnych kierunkach. Z jednej strony dostarcza ona materiału energetycznego w postaci obumarłych tkanek, a z drugiej strony zwalnia ten proces, pobierając azotany z gleby. Zwiększenie się w glebie ilości azotu w formie amonowej przypisuje się czasem procesom redukcji azotanów. W rzeczywistości jednak amoniak gromadzi się przede wszystkim w wyniku proteolizy i amonifikacji, które w przeciwieństwie do denitryfikacji, w warunkach tlenowych przebiegają szybko. Straty azotu z gleby na skutek denitryfikacji można więc podzielić na normalne, które na ogół nie przekraczają 10-15% rocznej produkcji azotu azotanowego, oraz straty okresowe spowodowane wytworzeniem się w glebie warunków sprzyjających denitryfikacji. Zazwyczaj wiąże się to z nadmiernym nawilgoceniem gleby i powstaniem warunków beztlenowych oraz nagromadzeniem azotanów i podwyższeniem temperatury. W tych warunkach straty azotu mogą znacznie przekraczać te, które normalnie występują w glebach uprawnych, nawet przy stosowaniu właściwych zabiegów agrotechnicznych.

Chemizm wiązania azotu

Bilans azotu w okresie wegetacyjnym to:

N_g1+N_a+N_m+N_o=N_r+N_d+N_w+N_g2

z tego można obliczyć

N_g2=N_g1+N_a+N_m+N_o-N_r-N_d-N_w

gdzie:

N_g1 i N_g2 - początkowa i końcowa zawartość azotu w glebie,

N_a - azot związany przez drobnoustroje z powietrza,

N_m - azot wprowadzany do gleby z nawozami mineralnymi,

N_o - azot organiczny wprowadzany do gleby z resztkami roślinnymi i zwierzęcymi oraz nawozami organicznymi,

N_r - azot wyniesiony z plonem,

N_d - azot który się ulotnił na skutek biologicznej denitryfikacji i innych procesów fizycznych i chemicznych,

N_w - azot wymyty z gleby.

Mechanizm wiązania azotu cząsteczkowego

Jest to redukcja N₂ do NH₃ do przeprowadzenia której potrzebna jest energia rozszczepiająca i redukująca cząsteczkę N₂. W przemysłowej produkcji mineralnych nawozów azotowych zużywane są ogromne ilości energii elektrycznej. W biologicznym wiązaniu N₂ dzięki enzymom reakcja ta zachodzi znacznie prościej. Redukcję N₂ do NH₃ przeprowadzają dehydrogenaza pirogronianowa oraz nitrogeneza. Fizjologicznym donorem wodoru jak również substratem dla tworzenia ATP jest dla pirogronian na który działa dehydrogenaza. Wodór uwolniony z pirogronianu przenoszony jest na nitrogenezę za pomocą przenośnika- ferrodoksyny. Posiada ona niezwykle niski potencjał oksydoredukcyjny- 0,42V. Nitrogenaza jest enzymem składającym się przynajmniej z dwóch podjednostek z których jedna powiązana jest z molibdenem i żelazem, a druga tylko z żelazem. Związek tych dwóch części białkowych pozostaje w stosunku stechiometrycznym (ilościowym), żadna z części nie jest czynna bez drugiego komponenta. W centrum X aktywowane są elektrony, a w centrum Y katalizowane jest rozerwanie cząstki N₂ i redukcja azotu. Energia zmagazynowana w ATP odpowiedzialne są za aktywność nitrogenezy, a tym samym za aktywność wiązania N₂. Organizmy wolno żyjące w procesach oddechowych wytwarzają ATP i równocześnie dostarczają czynnika redukującego azot. Asymilacja azotu przez Rhizobium odbywa się na podobnej zasadzie, przy udziale nitrogenezy. Nitrogenaza wytwarzana jest wyłącznie w komórkach bakteroidów. Roślina motylkowa dostarcza z kolei węglowodanów potrzebnych do wytworzenia ATP. Jednym z wyznaczników aktywnej symbiozy jest obecność roślinnej hemoglobiny- leghemoglobiny. Występuje ona w rozwiniętych brodawkach korzeniowych, powodując ich zabarwienie na kolor różowy. Syntezowana jest ona przez roślinę, ale dopiero po kontakcie z Rhizobium. Jej działanie to odwracalne wiązanie tlenu w brodawkach korzeniowych. Pierwszym produktem wiązania azotu jest NH₃ który u obydwu symbiontów przechodzi w formę aminową NH₂ wbudowaną w glutaminę. Proces ten katalizowany jest przez syntetazę glutaminową i odbywa się przy udziale ATP. Przeniesienie grupy NH₂ z tego aminokwasu na ketokwas z udziałem syntetazy glutaminowej oraz NAD-NADR prowadzi do powstania glutaminianu, który w procesach transaminacji może dać początek innym aminokwasom niezbędnym do budowy białka bakteryjnego i roślinnego.

Zespoły symbiotroficzne

Wolno żyjące drobnoustroje, wiążące azot mogą przyswajać go w znacznie większych ilościach w zespołach z innymi drobnoustrojami. Azotobakter wiąże np. więcej azotu współżyjąc z pałeczką towarzyszącą lub Clostridium. Również oligonitrofile wykazują zwiększoną zdolność do wiązania azotu w naturalnych zespołach. Znaczenie takiego działania nie jest do końca znane, najprawdopodobniej największą role odgrywa tu obniżenie cząsteczkowego ciśnienia tlenu zużywanego na procesy metaboliczne drobnoustrojów towarzyszących. Tlen jest inhibitorem nitrogenezy- enzymu czynnego przy wiązaniu N₂. Stymulacja wiązania azotu przez współżyjące organizmy polega również na ich zdolności do produkowania witamin oraz na uprzystępnieniu przez nie dla asymilatorów substancji energetycznych w łatwiej przyswajalnych formach. Bakterie celulolityczne na przykład rozkładają celulozę do glukozy i czynią ją przyswajalną dla asymilatorów N₂, nie posiadających celulazy. Zespoły symbiotroficzne mogą tworzyć się w glebie, w ryzosferze, lub w fyllosferze. W ryzosferze na charakter zespołu mają wpływ rośliny, które stwarzają środowisko dla drobnoustrojów żyjących w pobliżu ich korzeni. Stosunki biocenotyczne w fyllosferze są mniej znane niż w ryzosferze. Azot prawdopodobnie mogą wiązać również drobnoustroje żyjące na liściach oraz niektóre naruszające strukturę liści. Porosty to również układy symbiotyczne. Grzyby współżyją tu z sinicami i korzystają z wiązanego przez nie azotu. Drobnoustroje niesymbiotyczne przysparzają glebie mniej azotu. Zależnie od warunków klimatycznych i glebowych do gleby może się dostać rocznie:

-około 30 kg N/ha związanego przez azotobakter i Clostridium,

- około 50-300 kg N/ha związanego przez bakterie współżyjące z roślinami.

Promieniowce tworzą symbiozę z korzeniami olchy, Klebsiella natomiast z roślinami tropikalnymi.

Mineralizacja azotu organicznego

Azot w glebie znajduje się głównie w związkach organicznych, stanowiąc ok. 95% azotu ogólnego. Pierwiastek ten jest niezwykle dynamiczny a proporcje pomiędzy poszczególnymi jego formami nieustannie się zmieniają. Do gleby azot trafia w postaci związków organicznych i nieorganicznych. Azot organiczny znajduje się w resztkach pożniwnych, wprowadzany jest z nawozami organicznymi i wiązany jest z powietrza przez drobnoustroje. Azot nieorganiczny nie licząc tego który dostaje się do gleby wraz z opadami, dostarczany jest do gleby w postaci nawozów mineralnych. W warunkach naturalnych drobnoustroje wykorzystują azot z soli amonowych, soli azotanowych, azotu zawartego w związkach humusowych i z azotu świeżej masy organicznej, który ulega mineralizacji i stałym przemianom.

Rozkład kwasów nukleinowych

Są to organiczne związki azotu dostające się do gleby z resztkami roślinnymi oraz zwierzęcymi i nagromadzających się ciała drobnoustrojów. Są one zbudowane z polinukleotydów, które najpierw pod wpływem nukleaz (rybonukleazy, dezoksyrybonukleaz) ulegają rozkładowi na oligonukleotydy. Te z kolei są rozkładane na mononukleotydy, a następnie na zasady i pentozy z uwolnieniem jonu fosforanowego:

kwas nukleinowy mononukleotyd

(zasada-pentoza P)n------(zasada-pentoza-P)

mononukleotyd-------zasada purynowa lub pirymidynowa +pentoza+P

Zasady purynowe i pirymidynowe rozkładane są na kwasy organiczne, mocznik, aminokwasy i amoniak tak więc i ten proces kończy się amonifikacją z uwolnieniem jonu amonowego. Rozkład kwasów nukleinowych do zasad azotowych przeprowadzają liczne bakterie, grzyby i promieniowce, np. Achromobacter, Bacillus, Streptomyces, Aspergillus i Penicillium. Zasady purynowe i pirymidynowe rozkładane są przez: Pseudomonas, Micrococcus, czy Corynebacterium. Znane są również akie jak Clostridium posiadające enzymy umożliwiające pełny rozkład kwasów nukleinowych, przy czym powstającego amoniaku nie zużywają całkowicie w procesach własnego metabolizmu część jego pozostaje w podłożu. Kwasy nukleinowe podobnie jak białka mogą być rozkładane w dwóch etapach przez różne drobnoustroje, lub też od początku aż do uwolnienia amoniaku przez jeden rodzaj. W tym ostatnim przypadku drobnoustroje rozkładające kwasy nukleinowe zaliczane są również do amonifikatorów. Kwasy nukleinowe bardzo często tworzą związki kompleksowe w postaci nukleoproteidów. Wówczas etapem wstępnym jest rozbicie takiej cząstki na białko i kwas nukleinowy.

Rozkład mocznika i cyjanamidu wapnia

Mocznik trafia do gleby różnymi drogami. Drobne jego ilości nagromadzają się w wyniku rozkładu kwasów nukleinowych, znaczniejsze dostają się do gleby z obornikiem lub w postaci nawozów sztucznych, to jest tego samego mocznika lub cyjanamidu wapnia. Cyjanamid wapnia jest podstawowym składnikiem powszechnie stosowanego azotniaku, który w procesie hydrolizy biologicznej przechodzi w mocznik. Mocznik z kolei ulega ostatecznie amonifikacji. Ureaza to enzym katalizujący ten proces jest często wytwarzana przez rośliny wyższe. Nie tylko więc drobnoustroje przeprowadzają w glebie ten typ amonifikacji. Bardzo dużo drobnoustrojów glebowych może wykorzystywać mocznik jako źródło azotu, czerpiąc węgiel i energię z innych źródeł. Rozkład mocznika przebiega wówczas stosunkowo powoli. Znacznie energiczniej uwalniają amoniak nieliczne właściwe bakterie mocznikowe, wyspecjalizowane w rozkładzie mocznika. Do takich bakterii zalicza się Urobacterium i Urobacillus oraz gatunki Sporosarcina ureae i Micrococcus ureae. Poszukuje się aktualnie nawozów azotowych, z których azot w formie przyswajalnej dla roślin uwalniałby się stopniowo, tak jak z substancji organicznych. Pewne nadzieje wiąże się ze związkami mocznikowymi o przedłużonym okresie rozkładu, w postaci np. oksamidu lub połączeń mocznika z formaldehydem, które są znacznie słabiej rozkładane przez drobnoustroje niż sam mocznik. Końcowym produktem rozkładu organicznych związków azotowych w glebie jest zawsze amoniak. Oprócz amonifikacji biologicznej zachodzi czasem uwalnianie amoniaku pod wpływem przesuszenia gleby, nasłonecznienia i niektórych reakcji chemicznych. W klimacie tropikalnym i śródziemnomorskim ta forma amonifikacji odgrywa dużą rolę, natomiast w naszych warunkach klimatycznych wobec rozmiarów amonifikacji biologicznej nie ma prawie żadnego znaczenia. Losy azotu amonowego w glebie są różne. Amoniak NH₃ lub jon amonowy NH₄⁺ stanowią materiał pokarmowy dla drobnoustrojów i roślin, a także podlegają różnym procesom fizycznym i chemicznym. Straty azotu amonowego przez wymywanie z gleby są bardzo niewielkie. Znacznie większe straty są spowodowane utlenianiem się amoniaku w formie gazowej z prądem powietrza lub w strumieniu pary wodnej. Bardzo istotne też dla bilansu azotowego gleby są procesy prowadzone przez drobnoustroje, a zwłaszcza nitryfikacja.

1

---