Wykł.2

Biotechnologia- pochodzi z jęz. greckiego oznacza bios- życie, technos- technika, technologia; logos- myślenie. Połączenie biologii i technologii. Jest dziedziną nauki interdyscyplinarną wykorzystującą osiągnięcia genetyki, mikrobiologii, biochemii, nauk chemicznych, farmaceutycznych i medycznych.

Biotechnologia- jest to świadczenie, dobór usług z wykorzystaniem żywych organizmów i metod biologicznych.

GMO- genetycznie modyfikowana żywność

GMM- genetycznie modyfikowane mikroorganizmy głównie bakterie. Bakterie wykorzystane są do wytwarzania leków(insuliny).

GMP- genetycznie modyfikowane rośliny, wykorzystywane są do produkcji leków, interferonu, hormonów wzrostu.

GMA- genetycznie modyfikowane zwierzęta wykorzystywane transplantacji narządów.

W biotechnologii wykorzystujemy żywe organizmy lub ich fragmenty do celów gospodarczych - wytwarzanie nowych substancji, przetwarzanie określonych substancji, namnażania szybkiego roślin, wytwarzania i otrzymywania organizmów o ściśle określonych, pożądanych cechach.

Powszechnie wyróżniamy biotechnologie:

1. tradycyjną

2. nowoczesną

Tradycyjna- wykorzystuje do produkcji przemysłowo-spożywczej mikroorganizmy głównie bakterie, drożdże(niższe), enzymy roślinne i zwierzęce nie ingerując w ich DNA. Biotechnologia jest najstarszą dziedziną działalności człowieka, pomimo że termin biotechnologia pojawił się w literaturze naukowej dopiero w II połowie XX wieku (lata 70).

W historii biotechnologii wyróżnia się 3 okresy:

1. przedpasteurowski- od początku istnienia człowieka do połowy XIX w. człowiek aby mógł żyć musiał przetwarzać surowce pochodzenia roślinnego i zwierzęcego na żywność i napoje. Człowiek wypiekał chleb, ważył piwo a więc wykorzystywał mikroorganizmy nie wiedząc o ich istnieniu.

2. przejściowy- od połowy XIX w. do lat 70 XX w. w tym okresie Ludwik Paster odkrył nowe mikroorganizmy, opracował metody szczepień ochronnych, proces pasteryzacji i fermentacji.

3.Nowoczesna- zaczął się ten okres od odkrycia penicyliny w 1942 (przez Fleninga), a metody inżynierii genetycznej rozpoczęły się dopiero w latach 70 XX wieku.

Nowoczesna biotechnologia rozpoczęła się dzięki wykorzystaniu kultury invitro, diagnostyki molekularnej oraz techniki transformacji genetycznej, czego efektem są genetycznie modyfikowane organizmy.

Kultury in vitro(w szkle, probówce) uprawa części roślin, tkanek roślinnych, pojedynczych komórek na sztucznych pożywkach w warunkach naturalnych, sterylnych

In vivo- badanie, ocena całej rośliny w warunkach naturalnych

Diagnostyka molekularna- zajmuje się badaniem organizmów na poziomie DNA, jest to najbardziej, najszybciej wykorzystywany dział biotechnologii. Opiera się na markerach molekularnych.

Marker- jest to fragment DNA o określonej długości i określonej sekwencji nukleotydów, specyficzny dla danego gatunku, wykorzystywany metodami molekularnymi.

Inżynieria genetyczna- zespół technik pozwalających na manipulowanie DNA (genami). Te zmiany polegają na wyodrębnianiu cząsteczek DNA z bakterii, dzieleniu na fragmenty, łączeniu w określonym porządku, przenoszeniu na roślinę, aby na roślinie gen bakteryjny ulegał ekspresji. Technika ta pozwala na przeniesieni genów z odległych jednostek systematycznych np. przeniesienie genów zwierzęcych, bakteryjnych do roślin co byłoby niemożliwe zwykłymi metodami krzyżowania.

Kolory biotechnologii:

Rolnictwo, przemysł, medycyna oznacza się określonymi kolorami

- zielona biotechnologia- związana z rolnictwem, dotyczy roślin, zwierząt oraz przemysłu rolno-spożywczego. Działem biotechnologii rolniczej jest agrobiotechnologia, dotyczy ona roślin.

- czerwona biotechnologia- wykorzystywana w ochronie zdrowia- medycyna, farmaceutyka.

- biała biotechnologia- wykorzystuje metody biologiczne w produkcji przemysłowej i ochronie środowiska.

- fioletowa biotechnologia- dotyczy zagadnień społecznych, akceptacji społecznej, ochrony własności intelektualnej, zagadnienia etyczne i filozoficzne.

- niebieska biotechnologia- biotechnologia wód, jezior i oceanów.

Wykł 3

Kultury in vitro

Prowadzenie kultur in vitro jest możliwe, dlatego że komórki roślinne są totipotentne tzn. wykazują zdolność do podziałów, do odtwarzania poszczególnych organów i całej rośliny.

Totipotencja jest to zdolność odtwarzania całej rośliny z jednej komórki.

Kultury in vitro mają zastosowanie w badaniach podstawowych z zakresu genetyki, fizjologii, ale również mają zastosowanie w praktyce hodowli roślin uprawnych, hodowlanych, leśnych.

Dwa podstawowe cele prowadzenia kultur in vitro:

1. uzyskanie nowej zmienności, nowych genotypów, nowych form.

2. utrzymywanie istniejącej już zmienności czyli istniejących form genotypów.

Ad. 1

Uzyskanie nowej zmienności w kulturach in vitro jest możliwe poprzez mutacje punktowe(genowe) i chromosomowe dotyczące struktury i liczby chromosomów. Zmienność występująca w zregenerowanych roślinach z kultur in vitro, nazywają się zmiennością somakronalną. Częstotliwość mutacyjna w kulturach in vitro jest wyższa w porównaniu z występowaniem spontanicznych mutacji w warunkach polowych. Ponadto w warunkach in vitro mogą pojawić się takie zmiany mutacyjne, które nie występują w warunkach polowych. Obok mutacji spontanicznych in vitro mogą występować mutacje indukowane jeżeli potraktujemy materiał in vitro lub dojrzałe rośliny, z których materiał pobieramy, środkami mutagennymi.

Uzyskanie nowej zmienności:
-uzyskiwanie nowych zarodków w in vitro poprzez oddalone krzyżowanie (np.pszenica, żyto) i hodowla tych zarodków w kulturach in vitro

- Można również w warunkach in vitro zapylać zalążki, a więc kultury in vitro są wykorzystywane poprzez hodowle zarodków.

- Możemy również w kulturach in vitro otrzymywać mieszańce somatyczne, czyli wegetatywne polegające na fuzji czyli łączeniu protoplastów.

Protoplast jest to komórka pozbawiona ściany komórkowej.
Te protoplasty mogą pochodzić z odległych rodzajów, gatunków. Mieszańce somatyczne powstają zatem w wyniku łączenia komórek o niezredukowanej liczbie chromosomów.

Nową zmienność uzyskujemy w wyniku wykładania na pożywki mikrospor, pylników i w ten sposób uzyskuje się haploidy, czyli komórki o gametycznej liczbie chromosomów. Haploidy są cennym materiałem wyjściowym w hodowli roślin. Kultury in vitro wykorzystywane są przy otrzymywaniu roślin transgenicznych.

Ad 2.

a)poprzez mikrorozmnażanie wegetatywne w kulturach in vitro(mikrorozmnażanie, mikropropagacje). Wykładamy np. łuski cebuli tulipanów, w warunkach in vitro następuje namnażanie na łuskach mikrocebulek

b) przechowywanie materiału genetycznego - czyli istniejące odmiany, zamiast przechowywania tych materiałów w kolekcjach polowych i przechowalniach co jest związane z kosztami, można przechowywać tkanki roślinne w kulturach in vitro w ściśle określonych warunkach: obniżona temperatura oraz odpowiednia pożywka z dodatkiem inhibitorów wzrostu. Wolno rosnące kultury truskawki, ziemniaka mogą być przechowywane w kulturach in vitro materiał w temp. ciekłego azotu -196^oC.

Prace techniczne w laboratorium:

1. uprawa roślin matecznych, z których pobiera się eksplantaty, części szybko rosnące roślin

2. mycie i sterylizacja szkła laboratoryjnego i narzędzi

3. przygotowanie i sterylizacja pożywek

4. przygotowanie i sterylizacja materiału siewnego

5. izolacja (wycinanie i wykładanie części roślin na pożywki)

6. pasażowanie i sterylizacja materiału siewnego

pasażowanie- przenoszenie eksplantatów na inne pożywki

7. przenoszenie zregenerowanych roślin do naturalnych warunków- hodowla poza kulturą (ex vitro - przenoszenie do środowiska)

co może być materiałem w kulturach in vitro:
-materiałem wyjściowym są tzw. eksplantaty pierwotne

eksplantat- to każda szybko rosnąca część rośliny, są to najczęściej merystemy czyli tkanki twórcze znajdujące się w wierzchołkach pędu, łodygi, korzenia, mogą to być ogonki liściowe, oczka bulw ziemniaczanych, pylniki, zalążki, mikrospory.

Materiał roślinny czyli eksplantaty wykładamy na odpowiednich pożywkach. Pożywki mogą być płynne lub w różnym stopniu zestalone.

Podstawowym składnikiem pożywki są: substancje mineralne (makro i mikroelementy) oraz substancje organiczne, cukry,witaminy, aminokwasy i regulatory wzrostu(auksyny, cytokininy, gibereliny). Pożywki oznaczone są symbolami literowymi pochodzącymi najczęściej od autorów pożywki.

Do najczęściej stosowanych pożywek należą:

- Murassige i Sorgo MS

Rośliny zregenerowane w kulturach in vitro oznaczamy jako R1 a kolejne R2, R3, R4

Wykł 4

Rodzaje kultur in vitro

Eksplantaty roślinne wyłożone na pożywkę w kulturach in vitro mają zdolność do regeneracji organów i całej rośliny. Proces formowania organów roślinnych, a w rezultacie kompletnych roślin bezpośrednio z eksplantatu pierwotnego lub z tkanki kalusa nazywa się organogenezą in vitro. Może ona być bezpośrednia tj. różnicowanie organów i regeneracja kompletnej rośliny bezpośrednio z eksplantatu pierwotnego. Rośliny powstałe z kultury organów bez fazy kalusa charakteryzują się większą stabilnością cytogenetyczną.

Organogeneza pośrednia - różnicowanie organów a następnie formowanie rośliny, ale poprzedzone kulturą kalusa. Rośliny powstałe z tkanki kalusa charakteryzują się mniejszą stabilnością genetyczną. Wykorzystując różne eksplantaty w kulturach in vitro stosuje się różne techniki (rodzaje) kultur in vitro.

Podstawowe rodzaje kultur in vitro:

1. kultura kalusa

2. kultury zawiesin komórkowych

3. kultury organów roślinnych

- kultura odciętych korzeni

- kultura wierzchołków pędów i pąków, bocznych pędów

Te eksplantaty są wykorzystywane do uzyskania roślin częściowo lub całkowicie wolnych od wirusów jak również do mikrorozmnażania.

4. kultury protoplastów

5. kultury pylników

6. kultury mikrospor

7. kultura niezapłodnionych zalążków

8. kultury zarodków mieszańcowych

Kultury Kalusa

Kalus- fragment tkanki roślinnej wyłożonej na pożywkę tworzy kalus (jest to ciągle dzieląca się tkanka, która ma wygląd bezpostaciowej masy). Do wytwarzania kalusa wykorzystuje się dowolny organ rośliny lub tkankę. Kalusy różnych gatunków mają różną zdolność do różnicowania organów i kompletnej rośliny.

Barwa kalusa może być jednolita lub zróżnicowana, od białej do różnych odcieni koloru żółtego i zielonego. Nie jest to tkanka stabilna, bowiem w czasie rozwoju kalusa następują zmiany dotyczące liczby i struktury chromosomów. Wobec tego rośliny zregenerowane z kalusa mogą być poliploidalne, aneuploidalne i mogą posiadać przebudowane chromosomy. Częstotliwość mutacji chromosomowych zależy od genotypu, eksplantatu pierwotnego, składu pożywki i czasu utrzymywania kalusa na pożywce- czas pasażu kalusa.

Pasażowanie tj. przenoszenie kultury kalusa na świeżą pożywkę. Kultury kalusa są wykorzystywane do badań podstawowych lub innych technik kultur in vitro.

Kultury zawiesin komórkowych- powstają one najczęściej z luźnej tkanki kalusa, mogą to być zmacerowane zarodki, zmacerowane stożki wzrostu, zmacerowana tkanka miękiszowa,. Kultury zawiesin komórkowych umieszcza się w kolbach stożkowych i wytrąca na wytrząsarkach, tworzą się agregaty komórkowe. Przy kulturach zawiesin komórkowych pasażuje się kalus stosunkowo częściej niż w innych kulturach.

Kultury kalusa mogą regenerować, tworzyć kompletne rośliny. Jednak regeneracja roślin jest wolniejsza niż w innych kulturach, stąd wykorzystywane są głównie do badań podstawowych.

Kultury organów roślinnych- mogą to być eksplantaty, odcięte korzenie, wierzchołki pędu i pąki boczne pędu. Eksplantaty pobrane z wierzchołka pędu mogą być wykorzystywane do otrzymywania roślin całkowicie lub częściowo wolnych od wirusów i do mikrorozmnażania.

Merystem wierzchołkowy może w ogóle nie zawierać wirusa albo posiadać minimalną ilość wirusów. Opracowano metody izolowania bardzo małych odcinków wierzchołku pędu o długości od 0,5 do 3 mm i wykładania ich na odpowiednich pożywkach np. u tytoniu znajdowano eksplantaty całkowicie wolne od wirusów. Z tych eksplantatów wyrastały wolne od wirusów rośliny. Ale merystemy licznych gatunków zawierają jednak wirusy, których nie da się wykryć metodami biologicznymi poprzez wykładanie na pożywki zawirusowanych eksplantatów. W wyniku intensywnych podziałów kalusa może maleć zagęszczenie wirusa w porównaniu z eksplatatem pierwotnym. U tytoniu stężenie wirusa mozaiki tytoniowej w kulturze kalusa wynosiło tylko 2-3% stężenia wirusa występującego w eksplantacie.

Aby zwiększyć skuteczność metod uwalniania roślin od wirusów stosuje się metody uzupełniające tj. chemoterapia i termoterapia.

Chemoterapia może być in vivo i in vitro. W warunkach in vivo należy opryskiwać rośliny, z których pobiera się eksplantat po to aby zniszczyć wektory wirusów(mszyce). Wirusy mogą być również przenoszone przez nicienie. Uprawa roślin matecznych, z których pobiera się eksplantaty w rejonach osłoniętych.

Chemoterapia in vitro polega na traktowaniu eksplantatów wyłożonych na pożywkę, głównie analogami puryn i pirymidyn. Bardzo skutecznym związkiem hamującym rozwój wirusa jest rybawiryna(wirazol). Związki chemiczne dodane do pożywki powodują zmiany w kodzie genetycznym RNA wirusa i następuje zahamowanie rozwoju wirusa.

Termoterapia in vivo - rośliny mateczne mogą być potraktowane podwyższoną temp. przez okres od 4 tygodni do 6 miesięcy. Terapii cieplnej poddaje się całe rośliny lub eksplantaty.

Termoterapia in vitro - eksplantaty wyłożone na pożywkę traktowane są podwyższoną temperaturą 36^oC w dzień i 30^oC w nocy przez okres 4-8 tygodni. (można stosować krioterapię - obniżona temp. do -40*C)

Wykł. 5

Rozmnażanie wegetatywne w warunkach in vitro nazywa się mikrorozmnażaniem.

Wyróżniamy 3 sposoby mikrorozmnażania:
- kultura pąków bocznych(pachwinowych)
- kultura pąków przybyszowych
- somatyczna embriogeneza

Kultura pąków bocznych
Kultura ta polega na pobudzaniu do rozwoju pąków bocznych eksplantatem w tej kulturze są wierzchołki pędów z pąkami bocznymi, fragment pędu z zawiązkiem liści, merystemy w kątach liści. Ta metoda stosowana jest do rozmnażania wegetatywnego roślin ozdobnych, drzew owocowych orzechów i krzewów jagodowych. Polska jest jednym z największych eksporterów sadzonek roślin ozdobnych rozmnażanych wegetatywnie. Do pobudzania rozwoju stosowane są substancje wzrostowe głównie cytokininy, które powodują rozwój i szybki wzrost istniejących na roślinie pąków bocznych, z których wyrastają pędy, z kolei te pędy są ukorzeniane w mnożarkach, aby przyspieszyć ukorzenianie roślin dodaje się głównie auksyny, z kolei ukorzenione pędy adaptuje się do warunków naturalnych poprzez wysadzanie ich w tunelach foliowych z regulowaną wilgotnością.

Kultura pąków przybyszowych.
Dotyczy formowanie pąków przybyszowych bezpośrednio na eksplantacie lub poprzez kallus. Eksplantatami w tej metodzie mogą być różne organy roślinne, a więc korzenie, łodygi, liście, łuski cebulowe, pędy kwiatowe. Kultury pąków przybyszowych stosowane są u tych gatunków, które z trudnością wytwarzają pąki boczne. Najpierw w tej metodzie następuje formowanie pąków przybyszowych, następnie one rozwijają się w pędy i z kolei są ukorzeniane. Pąki przybyszowe mogą powstawać bezpośrednio na eksplatacie lub rozwijają się z kallusa, na ich rozwój ma wpływ światło i temperatura. Optymalna temperatura do rozwoju pąków przybyszowych to jest od 20 do 28 stopni. U niektórych rodzajów gatunków np. cyklamena do regeneracji pąków i pędów potrzebne jest światło niebieskie. Są i takie gatunki które regenerują pędy przybyszowe i pąki w ciemności. Kultura pąków przybyszowych prowadzona jest w pożywkach płynnych lub półpłynnych, również można stosować zanurzanie eksplantatów w pożywkach płynnych co przyśpiesza indukcję(rozwój) pąków przybyszowych. Zanurzanie eksplantatów w pożywkach płynnych z dużym powodzeniem stosowane jest u cytrusów. Te 2 metody polegają na rozwoju pąków pachwinowych, tworzeniu pąków przybyszowych, rozwój pędu, tworzenie korzeni. Ta metoda stosowana jest bardzo często u roślin ozdobnych(głównie liliacae).

Somatyczne embriogeneza
Jest to proces formowania zarodków z komórek wegetatywnych. Somatyczne embriogeneza może być pośrednia poprzez kulturę kallusa lub bezpośrednia - zarodki somatyczne wyrastają na eksplantacje. Ten sposób rozmnażania można indukować właściwie z każdego eksplantatu zawierającego żywe młode i zdolne do podziału komórki. Najlepiej nadają się eksplantaty z młodych liści, liścienie siewek, nierozwinięte pąki kwiatowe. Zarodki somatyczne mogą powstawać na igłach roślin iglastych, wycinkach pędów.
Zarodek to struktura o wyraźnej biegunowości, z której powstaje pęd korzeń, a w konsekwencji cała roślina. W metodzie pośredniej po wyłożeniu eksplantatu embriogenne komórki dzielą się i powstają agregaty komórkowe, z których powstaje embriogenny kallus. W tej metodzie na kallusie tworzą się zarodki somatyczne.
Stadia rozwojowe zarodków:
-stadium globularne,
-sercowate
-torpedy.
Do rozwoju zarodka potrzebne są odpowiednie pożywki. Uzyskany zarodek rozwija się i wytwarza kompletną roślinę.
Rozwój zarodka w całą roślinę nazywa się konwersja.
Oprócz pośredniej produkcji zarodków możliwe jest również produkowanie zarodków na eksplantacie. Zarodki mają strukturę biegunową, posiadają stożek wzrostu korzenia i łodygi. Rozmnażanie wegetatywnie poprzez somatyczną embriogenezę jest znacznie wydajniejsze i skuteczniejsze, niż rozmnażanie poprzez pąki boczne i przybyszowe, np.z jednego pąka wierzchołkowego można uzyskać 20 pędów, natomiast z litry zawiesiny komórkowej marchwi można uzyskać aż 30 000 zarodków, stąd dla celów komercyjnych somatyczna embriogeneza odbywa się w bioreaktorach, z tych zarodków somatycznych bezpośrednio wyrastają rośliny, również po dokonaniu odpowiednich zabiegów z zarodków somatycznych uzyskuje się sztuczne nasiona (somatyczne nasiona), ten termin wprowadzono dlatego że przeznaczano tylko do tworzenia tych nasion zarodki somatyczne. Obecnie termin ten ma znacznie szersze znaczenie, bo obejmuje nie tylko zarodki somatyczne wysuszone lub zamknięte w kapsułce, ale również kallus embriogenny, pąki wierzchołkowe, boczne jak również fragment korzeni przybyszowych lub włośnikowych. Dlatego obecnie stosuje się określenie „nasiona sztuczne”.

Istnieją 2 zasadnicze technologie produkcji sztucznych nasion:
1. Mokra. Uwodnione zarodki zamyka się w hydrożelach(kapsułkuje się), do produkcji hydrożeli stosuje się kwas alginowy uzyskany z glonów, sle potasowe, sodowe, agar,związki mineralne i środki grzybobójcze. Otoczka jest tak spreparowana,że pełni rolę sztucznego bielma i ochrania zarodki somatyczne przed niesprzyjającymi warunkami.
2. Sucha. W tym wypadku zarodki są odwadniane, podsuszane i pokrywane specjalną otoczką. Drugie rozwiązanie to odwodnione i wysuszone zarodki są bez otoczki. Ta metoda wykorzystania nasion podsuszonych znalazła zastosowanie w nasiennictwie roślin drzewiastych.
Sztuczne nasiona produkowane są szybko, wolne są od patogenów, nadają się do długotrwałego przechowywanie i są łatwe do transportu, istnieją gatunki np. koniczyna perska, lucerna gdzie trudno jest uzyskać nasiona normalne w warunkach naszego klimatu.
sztuczne nasiona wykorzystywane są w sadownictwie, leśnictwie u wielu roślin warzywnych: seler, papryka sałata winorośl, wykorzystywane w produkcji soji i ryżu.

Wyk 6

Kultury pylników, mikrospor, zalążków, zalążni i zarodków jako metody otrzymywania haploidów.

Haploidy - rośliny o gametycznej liczbie chromosomów.
Proces powstawania roślin haploidalnych nazywa się androgenezą.
Androgeneza jest to proces w którego czasie rozwój gamety męskiej zostaje zamieniony z gametofitowego, który prowadzi do powstania ziarn pyłku na sporofitowy, prowadzący do powstania zarodków i rośliny.

Po raz pierwszy proces indukowanej androgenezy opisano w 1964 w kulturze pylników u Dautria inoxia (pokrzyk wilcza jagoda.). W 1971 r. Prof. Zentkeler uzyskał rośliny haploidalne w kulturze pylników u Atropa belladonna (bieluń). Do indukcji androgenezy z odkażonych pąków kwiatowych z jednoliściennych, w przypadku dwuliściennych kłosów w pochwie, wycina się pylniki, w których znajdują się mikrospory . Najbardziej odpowiednie stadium to jednojądrowa mikrospora. Generalnie wykazują większą zdolność do androgenezy niż pylniki. Pylniki i mikrospory wykłada się na pożywkach agarowych. Istnieją poważne trudności techniczne przy pobieraniu pylników, a dotyczą one odpowiedniego stadium rozwoju mikrospor. Najlepsza jest mikrospora jednojądrowa. Próbowano wykładać na pożywki dojrzałe ziarna pyłku, ale metoda ta jest mało skuteczna. Przed wyłożeniem na pożywkę pylniki są oczyszczone, rozdrobnione i wirowane.
Są dwa sposoby powstania haploidów poprzez androgeneze. Sposób androgenezy ma istotne znaczenie dla poliploidalnośći danej rośliny jak i genotypu:

1. bezpośredni- mikrospory po wyłożeniu na pożywkę dzielą się i po przez stadium wielojądrowej mikrospory powstaje zarodek, a z zarodka rozwija się roślina. Tą metodą można w ciągu 4 do 6 tyg. otrzymać kompletne rośliny.

2. pośredni- po przez kallus. Mikrospora dzieli się i powstaje kallus. W kalusie może być brak zróżnicowania i zamiera, a może się on różnicować i tworzą się zarodki, w których w wyniku organogenezy powstają organy, a w końcu kompletna roślina . Rośliny powstałe tą drugą mają niestabiląa liczbę chromosomów. Mogą być haploidy diploidy, ponieważ klaus możę być niestabilny genetycznie.

Czynniki decydujące o wydajności androgenezy:

1. zdolność do androgenezy uwarunkowana jest genetycznie. Zależy od rodzaju, gatunku i od odmiany rośliny. Nie u wszystkich rodzajów i gatunków udało się dotychczas zainicjować androgenezę. Stosunkowo łatwo przebiega ona u gatunków dwuliściennych, kapustnych, psiankowatych i niektórych jednoliśćiennych - zwłaszcza u jęczmienia, pszenicy zwyczajnej, kukurydzy. Poważnym problemem przy otrzymywaniu haploidów drogą androgenezy u roślin liściennych są zaburzenia chlorofilowe, pojawia się dużo roślin albinotycznych. Np. u pszenicy zwyczajnej łatwiej jest indukować haploidy niż u pszenicy twardej. W obrębie gatunku można wyselekcjonować genotypy skłonne do androgenezy stosując zmodyfikowane warunki rozwoju roślin dawców i stosując zróżnicowane pożywki.

2. kondycja fizjologiczna, obawy związane ze zdrowotnością rośliny, stanem fizjologicznym rośliny.

3. Faza rozwojowa pylników i mikrospor. Najczęściej wykorzystuje się do anrgogenezy jednojądrowe mikrospory. Wybór odpowiedniej fazy ustala się drogą eksperymentu.

4. czynniki stresowe temp , pH, światło - tymi czynnikami mogą być traktowane rośliny dawcy lub czynniki stresowe można stosować w trakcie kultur in vitro,

5. skład pożywki

6. warunki prowadzenia kultury.

Proces powstawania w kulturach in vitro roślin haploidalnych z niezapłodnionych zalążków, zalążni nazywa się gynogenezą
Gynogeneza jest to proces analogiczny do androgenezy, z tym że zarodek rozwija się z gametofitu żeńskiego.
Gynogeneza jest mniej rozpowszechniona niż androgeneza ze względu na mniejszą wydajność. W zalążni jest bowiem mało zalążków i to powoduje małą liczbę uzyskanych roślin. Są bowiem gatunki u których androgeneza jest nie możliwa do przeprowadzenia. Wówczas do otrzymania haploidów stosuje się gynogenezę. Sposób ten stosowany jest powszechnie u buraka cukrowego, cebuli, ogórka, gerbera. Na pożywkę wykłada się niezapylone zalążki, zalążnie, całe słupki, pąki kwiatowe, woreczki zalążkowe.

Podobnie jak w przypadku androgenezy istnieją dwa sposoby otrzymywania roślin:
- po przez kalus - droga pośrednia i powstają rośliny o zróżnicowanej liczbie chromosomów
- bezpośrednia - zarodki haploidalne, a później rośliny bezpośrednio powstają z eksplantatów. Rośliny haploidalne powstałe w wyniku gynogenezy są raczej rzadko albinotyczne, częściej zaburzenia chlorofilowe występują w androgenezie. Proces gynogenezy podobnie jak androgenezy zależy od genotypu rośliny, rodzaju eksplantatu np. u buraka bardziej wydajne jest wykładanie zalążków, a u cebuli pąków kwiatowych.

Wykł.7

Invitro w komórkach generatywnych w komórkach nazywają się zmiennością gametoklonalną.

Zmiany w komórkach somatycznych w warunkach in vitro nazywamy zmiennością somaklonalną.

Te dwa typy zmian najczęściej obserwujemy na etapie kallusa. Ziany te mogą być genetyczne i pozageneteyczne.
Zmiany genetyczne to: mutacje, głównie chromosomowe dotyczące liczby i struktury chromosomów oraz zmiany genowe dotyczące genów. Te zmiany są dziedziczne.

Zmiany pozagenetyczne. Warunki kultury, zwłaszcza dodatek regulatorów wzrostu powodują zmiany pozagenetyczne o charakterze fizjologicznym. One nie są przekazywane na potomstwo regenerantów u roślin rozmnażanych generatywnie. Zmiany o podłożu fizjologicznym mogą utrzymywać się w pierwszych pokoleniach zregenerowanych rośli i u gatunków rozmnażanych wegetatywnie mogą być wykorzystywane zwłaszcza w hodowli roślin ogrodniczych.

Kultura zarodków mieszańcowych.
Aby otrzymać rośliny haploidalne stosuje się krzyżowanie oddalone, to jest międzygatunkowe i międzyrodzajowe. Zarodki mieszańców oddalonych wykłada się na pożywkę, w zależności od wieku zarodka może on być haploidalny lub diploidalny. Zygota powstała w wyniku zapłodnienia jest początkowo diploidalna. Już w czasie pierwszej mitozy następuje eliminacja chromosomów formy ojcowskiej i regenerują rośliny mateczne o haploidalnej liczbie chromosomów. W ciągu 8 do 10 dni następuje w zygocie całkowita eliminacja chromosomów ojcowskich. Po raz pierwszy metoda ta została opisana u mieszańców jęczmienia uprawnego Hordeum vulgare z Hordeum bulbosum. W zarodku nastąpiła eliminacja chromosomów H. bulbosum i w ten sposób otrzymano haploidy jęczmienia uprawnego. Stąd metoda ta nazywa się bulbozową. Na zasadzie metody bulbozowej otrzymano haploidy i mieszańców Triticum aestivum x Zea mays.

Podział haploidów: dzielą się na dwie grupy:

1. monohaploidy - powstałe z osobników diploidalnych zawierają połowę liczby chromosomów osobnika diploidalnego czyli jeden genom

2. polihaploidy - mają połowę liczby chromosomów osobnika poliploidalnego, czyli są to haploidy roślin poliploidalnych

Haploidy uzyskane z roślin tetraploidalnych nazywają się dihaploidy.

Monohaploidy i polihaploidy różnią się między sobą pod względem cech morfologicznych, anatomicznych i biochemicznych. Otrzymane w wyniku kultur in vitro haploidy nie zależnie od sposobu powstania, muszą być sprawdzone pod względem liczby chromosomów. Ocenę stopnia poliploidalności można przeprowadzić na etapie kultur in vitro. Najczęściej wykorzystywana jest metoda cytometrii. Za pomocą cytometru, oznacza się zawartości DNA w pojedynczych komórkach haploidów oraz roślin kontrolnych diploidalnych. Metoda szybka i wydajna.
Ocena stopnia poliploidalności można przeprowadzić w okresie późniejszym poprzez liczenie liczby chromosomów w preparatach wykonanych z roślin haploidalnych przez pobieranie stożków wzrostu pędu i łodygi. Pośrednią metodą oznaczania stopnia poliploidalności to jest wielkości aparatów szparkowych i liczba chloroplastów w komórkach szparkowych, które są większe u diploidów niż haploidów. Haploidy są najczęściej sterylne i bezpośrednio nie są wykorzystywane w praktycznej hodowli roślin, mogą być natomiast wykorzystywane w badaniach podstawowych, do analizy genetycznej i mapowania genów. Po podwojeniu liczby chromosomów można uzyskać rośliny płodne, homozygotyczne, z których uzyskuje się linie a później odmiany. Rośliny haploidalne o podwojonej liczbie chromosomów nazywają się podwojonymi haploidami i oznaczone są skrótem DH. Podwojenie liczby chromosomów, może zachodzić spontanicznie już na etapie kallusa, skuteczność tego podwajania zależy od gatunku rodzaju kultury i składu pożywki. Sztuczne podwojenie liczby chromosomów ma miejsce najczęściej na skutek traktowania haploidów kolchicyną. Można również indukować haploidy w kulturach in vitro poprzez traktowanie kultur in vitro substancjami hamującymi podziały komórkowe. Podwojone haploidy mają praktyczne znaczenie w hodowli roślin, doskonale opracowana jest metoda otrzymywania haploidów i podwojonych haploidów u ryżu, jęczmienia, pszenicy, tytoniu i rzepaku.

Zalety haploidów i podwojonych haploidów.

1. Skrócenia czasu hodowli

2. Wysoki poziom homozygotyczności linii DH- podwojonych haploidów

Otrzymanie linii homozygotycznych w tradycyjnej hodowli roślin wymaga zapyleń wsobnych przez minimum 6 lat(pokoleń), u niektórych gatunków dochodzi nawet do 8 lub 10 lat, szczególnie dotyczy to roślin wieloletnich. Wykorzystanie podwojonych haploidów pozwala na wyraźna skrócenie tego czasu. Na otrzymanie plonu składającego się z kilku do kilkunastu roślin haploidalnych potrzeba około jednego roku, a wiec następuje wyraźna skrócenie czasu hodowli. Otrzymane rośliny muszą być sprawdzane pod względem homozygotyczności.

Ocena homozygotyczności polega na analizie potomstwa i wymaga kolejnego roku. W ciągu jednego do dwóch lat można przy pomocy kultur in vitro uzyskać wartościowe, w pełni homozygotyczne linie stanowiące materiał wyjściowy dla hodowli nowych odmian. U gatunków samopylnych np. jęczmienia, wartościowe linie podwojonych haploidów mogą być bezpośrednio wykorzystywane jako nowe odmiany.

Indukcja haploidów i otrzymanie podwojonych haploidów jest znacznie trudniejsza u gatunków obcopylnych, gdyż ze względu na depresję wsobną, trudniej jest uzyskać wartościowe linie podwojonych haploidów. Indukcja haploidów i utrzymanie linii DH jest łatwiejsza u form diploidalnych niż u poliploidalnych ze względu na duża liczbę heterozygot.

Wady podwojonych haploidów.

-Otrzymanie lini DH zależy w dużym stopniu od genotypu
-zmienność somaklonalnej i gametoklonalnej
-występowanie dodatkowej zmienności przez działanie kolchicyny
-brak naturalnej selekcji w procesie rozwoju haploidów oraz podwojonych haploidów. W warunkach in vitro trudniej jest ocenić wartość pojedynczych roślin, najlepiej jest to robić w warunkach naturalnych,. U zbóż częściej uzyskuje się haploidy metodą bulbozową nawet z pominięciem kultur in vitro, gdyż w czasie kultur in vitro bardzo często występują defekty chlorofilowe.

Wykł.8

Otrzymywanie mieszańców oddalonych poprzez kultury zarodków mieszańcowych i kultury protoplastów.

Krzyżowanie międzygatunkowe i międzyrodzajowe nazywa się krzyżowaniem oddalonym, a uzyskane tą drogą mieszańce są to mieszanie oddalone. Mieszańce te można otrzymać poprzez krzyżowanie dwóch odległych rodzajów np. żyta i pszenicy, życicy z kostrzewą. Tą drogą powstają mieszańce generatywne, w przypadku krzyżowania rodzajów lub gatunków których nie da się skrzyżować stosuje się łączenie, czyli fuzję, komórek somatycznych. Mieszańce generatywne powstają poprzez łączenie komórek generatywnych(gamet) o zredukowanej liczbie chromosomów i mają cytoplazmę formy matecznej. Mieszańce somatyczne(wegetatywne) powstają przez połączenie komórek o niezredukowanej liczbie chromosomów i mają cytoplazmę obu form rodzicielskich. Generatywne: AAxBB ->gamety A i B -> F1 (AB)x2
somatyczne: AA+BB-> F1 (AABB)x4

O możliwości skrzyżowania dwóch odległych systematycznie form decyduje stopień homologii genomów(chromosomów). Formy o homologicznych genomach(krzyżowanie wewnątrzodmianowe, międzyodmianowe), krzyżują się łatwo. Przy przejściowej homologii chromosomów może to być krzyżowanie międzygatunkowe, ale najlepiej jak są to gatunki o tym samym poziomie poliploidalności, krzyżowanie jest trudniejsze.

Przy braku homologii nawet jeśli uda się uzyskać mieszańca to trzeba wówczas stosować kolchicynę do podwojenia liczby chromosomów. Uzyskanie mieszańców form oddalonych jest ograniczone poprzez bariery izolacyjne(krzyżowalności), te bariery mogą być prezygotyczne(przed zygotą), polegają one na tym że pomimo zapylenia nie dochodzi do zapłodnienia.

Podstawowe bariery prezygotyczne:
-brak kiełkowania pyłku, lub penetracji łagiewki pyłkowej na znamieniu słupka
-zatrzymanie wzrostu łagiewki pyłkowej w różnych miejscach szyjki słupka
-pojedyncze zapłodnienie, gameta męska nie łączy się z wtórnym jądrem woreczka zalążkowego i nie powstaje bielmo

Bariery postzygotyczne:
-zahamowanie w rozwoju zygoty, obserwuje się wówczas brak rozwoju bielma lub jego niedorozwój
-może nastąpić zamieranie zarodków i nie dochodzi do powstania nasienia.
-Nasiona mieszańcowe mogą kiełkować ale nie rozwija się mieszaniec
-mieszańce F1 są żywotne ale sterylne

Jeżeli przy krzyżowaniu oddalonym główną przyczyną jest obumieranie zarodków. Wówczas tę barierę postzygotyczną łamiemy poprzez stosownie kultury zarodków mieszańcowych in vitro. Przy tej metodzie jest bardzo ważne stadium rozwojowe zarodka, łatwiej regenerują rośliny z zarodków starszych, można również w warunkach in vitro przeprowadzić zapylenie zalążków i zalążni.

Otrzymywanie mieszańców somatycznych nazywane jest hybrydyzacją somatyczną

Etapy otrzymywanie mieszańców somatycznych:
-izolacja i prowadzenie kultur protoplastów
-fuzja, łączenie protoplastów
-identyfikacja protoplastów mieszańcowych tzw. heterokarionów
-regeneracja roślin

Protoplasty są to komórki somatyczne pozbawione ściany komórkowej, wykazujące zdolność do regeneracji. Najczęściej jako eksplantaty wykorzystuje się komórki miękiszowe liścia, komórki pędu korzeni i zawiesiny komórkowe.
Izolacja polega na wykorzystaniu, na stosowaniu odpowiednich enzymów, które rozkładają ścianę komórkową. Dobór enzymów zależy od genotypu rośliny i rodzaju tkanki.
Fuzja protoplastów może występować samorzutnie ale zdarza się to stosunkowo rzadko, proces ten można stymulować związkami chemicznymi lub działaniem pola elektrycznego. Do fuzji stosuję się najczęściej glikol polietylenowy PEG, obniża on napięcie powierzchniowe ściany komórkowej i to powoduję łączenie się protoplastów. Uzyskanie heterokarionów drogą fuzji jest stosunkowo trudne, bo najczęściej uzyskujemy tylko 10% heterokarionów. Fuzję protoplastów ułatwia również stosowanie zróżnicowanego pola elektrycznego. Intensywne pulsy elektryczne przyspieszają fuzję protoplastów. Połączone protoplasty dwóch różnych rodzajów zawierające różny materiał genetyczny nazywają się heterokarionem. Mogą chociaż nie powinny łączyć się w protoplasty należące do tego samego rodzaju i wówczas powstają homokariony. Do identyfikacji heterokarionów wykorzystuję się barwniki chemiczne lub fluorescencję. Najlepszą metodą sprawdzania krzyżowania oddalonego poprzez fuzję protoplastów są markery DNA.

Rodzaje mieszańców somatycznych:
-mieszaniec somatryczny jest to produkt fuzji protoplastów gdzie w jednej komórce znajdują się genomy obojga rodziców
-mieszaniec niesymetryczny, posiada genom jądrowy jednego rodziców i niektóre chromosomy drugiego rodzica
-cybrydy, zawierają genom jądrowy jednego z rodziców, a cytoplazma pochodzi od obojga rodziców

Wykł 9

Transformowanie roślin

Transformowanie komórek roślinnych i otrzymywanie roślin transgenicznych.

Zjawisko transformacji po raz pierwszy zaobserwowano w 1928r. u bakterii, a w 1944 wyjaśniono, że czynnikiem transformującym jest DNA. Zjawisko to polega na tym, że DNA szczepu dawcy jest pobierane przez szczep biorcę. Szczep biorca nabywa właściwości szczepu dawcy. W naturze może zachodzić przepływ materiału genetycznego, czyli DNA, pomiędzy różnymi gatunkami bakterii, jak i pomiędzy bakteriami i roślinami. W wyniku rozwoju genetyki molekularnej, szczególnie genetyki mikroorganizmów, w latach 70-tych XXw. rozwinęła się inżynieria genetyczna kierowana przez człowieka.
Inżynieria genetyczna jest to zespół technik pozwalających na manipulowanie DNA czyli pojedynczymi genami. Powstanie inżynierii genetycznej jest ściśle związane z odkryciem i wykorzystaniem enzymów restrykcyjnych.
Enzymy restrykcyjne występują w komórkach, zostały one wykorzystane do cięcia DNA na mniejsze fragmenty, tak pocięte fragmenty DNA można ponownie łączyć w kombinacje (układy) nieistniejące w naturze, a wiec można dzięki tym enzymom uzyskać zrekombinowane DNA. To zrekombinowane DNA czyli gen można wstawić do wektora i przenieść gen do rośliny biorcy lub bezpośrednio przenieść gen bez udziału wektora do rośliny biorcy. Podstawowym celem inżynierii genetycznej jest wprowadzenie do organizmu fragmentu DNA, czyli genu pociętego enzymami, do organizmu biorcy.Ten gen w organizmie dawcy warunkuje jakąś ściśle określoną cechę. Proces wprowadzania albo przenoszenia fragmentu DNA dawcy do genomu biorcy i stabilna integracja tego genu z genami biorcy nazywa się transformacją genetyczną albo transgenezą. Biorca nabywa cechę uwarunkowaną przez wniesiony gen dawcy. Biorca nazywa się organizmem genetycznie zmodyfikowanym lub organizmem transgenicznym. Fragment DNA (gen) przenoszony (wprowadzany) w procesie transformacji nazywa się transgenem. Za pomocą transformacji można przenosić geny zarówno z organizmów blisko ze sobą spokrewnionych, jak również z oddalonych jednostek systematycznych np. przenoszenie genów bakteryjnych lub zwierzęcych do genomu rośliny.

Do transformacji używa się konstruktów genowych, w konstrukt genowy wbudowany jest wektor. Budowa konstruktu: transgen wycięty przez nożyce > sekwencja promotorowa > sekwencja terminatorowa > gen markerowy > gen reporterowy

Transgen jest połączony z sekwencją promotorową i terminatorową. Transgen jest pomiędzy nimi. Sekwencja promotorowa jest odpowiedzialna za inicjację transkrypcji genu wprowadzanego do gospodarza. Sekwencja terminatorowa jest odpowiedzialna za zakończenie procesu transkrypcji. Geny markerowe pozwalają już wyselekcjonować transformowane komórki, genami markerowymi, najczęściej są geny warunkujące odporność na antybiotyki i herbicydy. Geny reporterowe umożliwiają wczesne wykrycie transformowanych komórek. Te geny dają efekty barwne, co świadczy o włączeniu i funkcjonowaniu transgenu w roślinie biorcy. Konstrukt może być wbudowany w wektor, lub bezpośrednio umieszczony w roślinie biorcy.

Etapy wytwarzania roślin transgenicznych:
1. identyfikacja genu kodującego określone białko pochodzącego od dawcy,
2.wyizolowanie tego genu, namnożenie genu (klonowanie jest obecnie metodą rutynową dzięki reakcji PCR),
3. opracowanie metody wprowadzenia transgenu
4. wprowadzenie genu (w konstrukcie) do komórek biorcy w postaci konstruktu do protoplastów rośliny biorcy, za pomocą konstruktu lub bezpośrednio
5. integracja tego genu z genomem biorcy, w ten sposób aby gen działał i był przekazywany na kolejne pokolenia.

Metody transformacji
Wprowadzenie DNA do rośliny biorcy odbywa się w warunkach kultur in-vitro, transgen jest wprowadzany do pojedynczych protoplastów lub do innych eksplantatów pochodzących z różnych części roślin. Metody transformacji dzielą się na wektorowe i bezwektorowe.

T-DNA odcinek
agrobacterium tumefaciens zawieta plazmid TI tumor inducing

agrobacterium risogenes zawiera plazmid RI roots inducing

wykł 10

Rośliny transgeniczne powstają w wyniku transformacji genetycznej czyli transgenezy.

Do otrzymywanie roślin transgenicznych człowiek wykorzystał naturalną zdolność bakterii glebowych (Agrobacterium tumefaciens i Agrobacterium risogenes) do infekowania roślin w miejscach zranień i uszkodzeń i przekazywania własnego(bakteryjnego) DNA roślinie. To przekazane DNA ulega integracji czyli włączeniu w genom rośliny. Naturalna infekcja bakterii glebowych i przekazywanie roślinie własnego DNA nazywa się agroinfekcją. Efektem agroinfekcji w naturalnych warunkach z udziałem Agrobacterium tumefaciens jest tworzenie się rakowatych narośli, guzów, tumorów w miejscach infekcji,

Agrobacterium risogenes - powstanie dużej liczby włośnikowatych korzeni.

Metody wektorowe otrzymywanie roślin transgenicznych.

Wektor służy do przenoszenia DNA z bakterii do rośliny.

Wektor to odcinek DNA zdolny do autonomicznej(niezależnej) replikacji, pośredniczący w przenoszeniu fragmentu DNA(genu). Wektorami mogą być plazmidy, wirusy oraz bakterie. Najczęściej stosowanymi wektorami są plazmidy występujące w komórkach Agrobacterium tumefaciens(Ti) oraz plazmid Ri (agrobacterium risogenes).

Plazmid jest to kolista cząsteczka DNA zawieszona w cytoplazmie komórki bakteryjnej replikująca niezależnie od chromosomu bakteryjnego. Z punku widzenia transformacji najważniejszym elementem plazmidów jest odcinek T-DNA, składający się z 23 tys. par zasad. Ten odcinek DNA zawiera geny odpowiedzialne za syntezę regulatorów wzrostu, cytokinin i auksyn, oraz wydzielanie opin.

Opiny są źródłem węgla i azotu dla bakterii żyjących w przestrzeniach międzykomórkowych tworzących się po infekcji rakowatych narośli, guzów.

Naturalna infekcja (agroinfekcja)

Bakteria atakuje roślinę, z plazmidu wycinany jest odcinek T-DNA, w którym znajdują się geny odpowiedzialne za syntezę regulatorów wzrostu(cytikinin i auksyn) oraz wydzielanie opin. Odcinek T-DNA wnika do rośliny i jest w sposób naturalny wbudowany do chromosomu rośliny. Po infekcji następuje zmiana metabolizmu komórek. Geny odpowiadające za syntezę regulatorów wzrostu nazywane są onkogenami. Te onkogeny stymulują podziały komórkowe i na korzeniach tworzą się narośla i guzy. Komórki guzów wydzielają opiny, które są potrzebne do funkcjonowania bakterii i w ten sposób bakteria rozwija się w naroślach.

Własności plazmidu Ti pozwoliły żeby wykorzystać go jako wektor do przenoszenia obcych genów do roślin. Stało się to możliwe dzięki odkryciu enzymów restrykcyjnych.

Warunki sztuczne

Enzym wycina, izoluje gen, następnie inny enzym tnie plazmid i z odcinka T-DNA wycina onkogeny stymulujące podziały komórkowe aby nie powstawały narośla. W miejsce onkogenów wstawiany jest konstrukt z obcym genem. Bakteria ze zrekombinowanym plazmidem atakuje komórki tkanki protoplastu. Jest to pierwszy etap transformacji.

Połączenie zrekombinowanego plazmidu z eksplantatem tworzy kokulturę. Odcinek T-DNA wnika do komórek roślinnych i powstają transformanty z wbudowanym genem. Z uzyskanych transformantów po odpowiednich zabiegach regenerują rośliny transgeniczne. Początkowo stosowano Agrobacterium tylko do otrzymywania transgenicznych roślin dwuliściennych. Dopiero w latach 90-tych XXw wykazano możliwość infekowania przez Agrobacterium tumefaciens roślin jednoliściennych.

Jako wektorów do transformacji używa się rzadziej wirusów(mozaiki kalafiora), kosmidów powstałych w wyniku połączenia plazmidu z wirusem.

Metody bezwektorowe:
- wprowadzenie obcego DNA do protoplastów biorcy z wykorzystaniem czynnika chemicznego(glikol polietylenowy PEG), powoduje on niszczenie błony komórkowej i w ten sposób umożliwia wniknięcie cząsteczek DNA do wnętrza protoplastu.
- elektroporacja: wprowadzenie obcego genu do komórek biorcy, następuje w wyniku działania pola elektrycznego, które uszkadza błony komórkowe protoplastów
- makro i mikroiniekcja: DNA jest wstrzykiwane do komórek protoplastów przy użyciu odpowiednich pipet
- mikrowstrzeliwanie, mikrobombardowanie, metoda biobalistyczna. Metoda to polega na wstrzeliwaniu do protoplastów tak zwanych mikronośników. Są to cząsteczki o średnicy 0,36 do 6mm wykonane z metali szlachetnych, złota, wolframu lub z odpowiednio przygotowanych tworzyw sztucznych na które wcześniej naniesione jest DNA

Wykład 11

Przykłady roślin transgenicznych.

Pierwszą modyfikowaną genetycznie rośliną był pomidor. W USA w 1994 znalazła się w sprzedaży odmiana pomidora Flavr Savr. Odmiana ta charakteryzowała się wolniejszym dojrzewaniem i owoce były stosunkowo miękkie, przez co dłużej zachowywały świeżość i lepiej nadawały się do transportu. Te dwie właściwości zostały osiągnięte poprzez zmniejszenie aktywności genu kodującego enzym odpowiedzialny za rozkład ściany komórkowej. Ta odmiana jest przykładem, że genetyczne modyfikacje dotyczą nie tylko wprowadzania nowych genów z różnych rodzajów, ale również na modyfikacji składników genów, które występują w danym organizmie. Ponieważ odmiana ta nie była najlepsza pod względem innych cech nie odniosła oczekiwanego sukcesu komercyjnego i została wycofana ze sprzedaży.

Najbardziej powszechne modyfikacje roślin dotyczą następujących cech:

• odpornośc na owady

• tolerancja na herbicydy

• odporność na choroby

• odporność na wirusy

• ulepszanie cech jakościowych

Roślina może wyprodukować każde białko jeżeli tylko zostanie do niej wprowadzona informacja genetyczna.

Odporność na szkodniki owadzie.

Pierwszym zastosowaniem biotechnologii w hodowli roślin uprawnych było wprowadzenie genu odporności na szkodniki owadzie. Geny z batterii Bacillus thurginensis- Bt zostały przeniesione do roślin jako transgeny przeciwko owadom. Bacillus thurginensis jest bakterią występującą w glebie oraz w pyle i kurzy magazynów zbożowych. Kultury tych bakterii od lat 30 XXw. Były wykorzystywane do opryskiwania roślin jako biologiczny insektycyd. Geny Bt kodują toksyczne białko Cry. Toksyczność białek Cry polega na tym, że po zjedzeniu przez owada rośliny w przewodzie pokarmowym białko rozpuszcza się, z kolei łączy się ze specyficznymi receptorami błon przełyku pokarmowego owada, następuje obumieranie komórek i śmierć owada. W modyfikowanej genetycznie roślinie stężenie toksyn jest niewielkie i nie ma niebezpieczeństwa dla ssaków. Dotychczas poznano około 130 genów Bt. Białko Cry kodowane przez Bt mają działać specyficznie tzn. działają na pewną grupę owadów. Ta duża specyficzność toksyn białek Cry jest z jednej strony korzystna, ale z drugiej strony nieefektywna w polu gdzie mamy do czynienia z bardzo dużą liczbą szkodników owadzich. Stąd do transformowania roślin używa się kilka genów Bt, które jednocześnie są szkodliwe dla kilku grup owadów. Stwierdzono, że lepiej jest wprowadzać geny Bt do chloroplastów zamiast do jądra komórkowego. Geny Bt zostały wprowadzone do wielu roślin: kukurydza odporna na omacnicę prosowiankę, ziemniak na stonkę ziemniaczaną. Brak stosowania insektycydów zmniejsza zanieczyszczenia gleby i wód gruntowych, nie zmniejsza a nawet w niektórych przypadkach podwyższa plon.

Tolerancja na herbicydy, głównie na roundup.

Substancją czynną jest glifosat. Wprowadzenie do rośliny genu odporności na glifosat pozwala na zniszczenie całej roślinności na danym polu poza transgeniczną rośliną uprawną. Glifosat jest inhibitorem enzymu EPSPS. Enzym ten odgrywa istotną rolę w biosyntezie aminokwasów aromatycznych, witamin, i różnych metabolitów. Działanie glifosatu polega na zahamowaniu syntezy aminokwasów aromatycznych, co z kolei blokuje biosyntezę białka i w końcu śmierć rośliny.

Są 2 moliżwości uzyskania odporności na glifosat:

• wprowadzenie genu odpowiadającego za syntezę enzymu EPSPS odpornego na glifosat

• wprowadzenie genu kodującego enzym GOX, który rozkłada glifosat.

Gen kodujący enzym EPSPS wyizolowano z bakterii glebowej Agrobacterium, natomiast kodujący GOX wyizolowano z bakterii Achromobacter. W związku z tym pojawiły się obawy czy transgen nie będzie przenoszony przez pyłek na chwasty w wyniku naturalnego krzyżowania i powstaną tzw. superchwasty. Ryzyko przekrzyżowania może być zmniejszone poprzez działanie innego herbicydu. Jest mniejsze prawdopodobieństwo u roślin samopylnych, stosowanie odpowiednich płodozmianów.

Odporność na choroby grzybowe i bakteryjne.

Grzyby np. Fusarium produkują szkodliwe mykotoksyny, które są rakotwórcze, są przycztną wielu zatruć. Porażenie roślin przez choroby obniża plon rośliny. Aby teg uniknąć wprowadza się poprzez transgenezę geny kodujące enzymy hitynazy i glukanazy, które niszczą ściany komórkowe patogena.

Odporność na wirusy.

Do roślin wprowadza się geny z wirusem np. geny płaszcza wirusa. Te geny kodują odpowiednie białka. Białka te nie wywołują choroby u roślin ale wręcz przeciwnie indukują odporność. Mechanizm odporności polega na tym, że zainfekowane przez wirusa komórki nie ulegają powtórnej infekcji przez patogena i są traktowane już jako zainfekowane. GMP odporne na wirusy to głównie ziemniaki i dynie.

Ulepszenie cech jakościowych.

Przykład pomidor. Podobnie zablokowano działanie genów biorących udział w biosyntezie kofeiny i otrzymano transgeniczną kawę zawierającą do 70% mniej kofeiny. Można zmienić skład aminokwasów- uzyskano kukurydzę o zwiększonej zawartości lizyny. Bardzo ważnym osiągnięciem było otrzymani złotego ryżu. Genetycznie zmodyfikowany ryż koduje beta karoten, który jest prowitaminą witaminy A. Brak witaminy A powoduje upośledzenie wzroku a w końcu może prowadzić do ślepoty. Gen ten wprowadzono żonkila. Dzięki wprowadzeniu tego genu złoty ryż miał uchronić dzieci azjatyckie przed ślepotą. W pierwszym etapie otrzymywania złotego ryżu produkcja beta karotenu była za mała, aby w pełni zaspokoić zapotrzebowanie na witaminę A. W ostatnich latach po modyfikacji trasgenu uzyskano złoty ryż, który posiadał o 25% więcej karotenu.

2

---