Zestaw 53.
Błonowe systemy enzymatyczne.
Kompleksy wieloenzymatyczne mogą występować we frakcjach rozpuszczalnych (kompleksy dehydrogenazy pirogronianowej i α-ketoglutaranowej, syntazy kwasów tłuszczowych, dezaminazy treoninowej) albo błonowych, m.in. enzymy łańcucha oddechowego i mikrosomalnego systemu transportu elektronów.
Enzymy łańcucha oddechowego są zanurzone w wewnętrznej błonie mitochondrialnej, wielce nieprzepuszczalnej (nawet dla protonów). Trzy kompleksy enzymatyczne (z czterech) podczas transportu elektronów powodują wypompowywanie protonów z matrix mitochondrialnej. Dzięki temu powstaje gradient protonowy w poprzek błony a to umożliwia dalszą oksydacyjną fosforylację.
Pierwszym kompleksem enzymatycznym jest dehydrogenaza NADH (reduktaza NADH-Q), białko zawierające przynajmniej 34 łańcuchy polipeptydowe. Następuje przeniesienie elektronów z NADH, poprzez FMN na ubichinon, powstaje ubichinol. Ten, dzięki długiemu hydrofobowemu ogonowi izoprenoidowemu (najczęściej 10) może łatwo przemieszczać się w błonie mitochondrialnej.
Ubichinon zabiera również elektrony z FADH2 wyprodukowanego w cyklu Krebsa (i nie tylko) przez dehydrogenazę bursztynianową, która stanowi część kompleksu reduktazy bursztynian-Q, II kompleksu łańcucha transportu elektronów i jest integralnym białkiem wewnętrznej błony mitochondrialnej. W związku z czym FADH2 nie opuszcza kompleksu, bo od razu są od niego odbierane elektrony na centra Fe-S a potem na ubichinon.
Reduktaza cytochromowa - kompleks III jest drugą pompą protonową. Zbudowany z cytochromów b i c1, a także centrów żelazo-siarkowych i kilku innych łańcuchów polipeptydowych. Jego funkcją jest katalizowanie przeniesienia elektronów z ubichinolu do cytochromu c, białka, które jest łatwo rozpuszczalne w wodzie.
Z cytochromu c, elektrony są przenoszone na tlen dzięki aktywności kompleksu IV - składającego się z 10 podjednostek, zawiera dwa hemy A i dwa jony Cu. Kompleks oksydazy cytochromowej jest trzecią pompą protonową.
Wypompowywanie protonów, podnosi ich stężenie po cytozolowej stronie wewnętrznej błony mitochondrialnej, co wytwarza potencjał elektryczny. Protony są wciągane z powrotem do matrix mitochondrialnej przez kompleks syntazy ATP. Jest on złożony z kanałowej podjednostki F0 (zanurzonej w wewnętrznej błonie mitochondrialnej) przewodzącej elektrony oraz katalitycznej podjednostki F1 (podjednostki α3β3γδε).
W błonie retikulum endoplazmatycznego znajdują się dwa systemy transportu elektronów, zależne od NADPH i NADH. Uczestniczą w reakcjach pierwszej fazy biotransformacji ksenobiotyków. I system transportu elektronów jest zbudowany z oksydoreduktazy NADPH:cytochrom P-450, przenoszącej elektrony z NADPH + H+ na cytochrom P-450, z cytochromu P-450, który wiąże substrat i cząsteczkę tlenu oraz katalizuje inkorporację tlenu do substratu, a także z fosfatydylocholiny, która zapewnia hydrofobowe środowisko umożliwiające utworzenie funkcjonalnego kompleksu oksydoreduktazy z cytochromem oraz ułatwia przyłączenie lipofilnych substratów do cytochromu.
II system transportu elektronów to oksydoreduktaza NADH:cytochrom b5 (przenosi elektrony z NADH na cyt. b5), cytochromu b5 (przenosi elektrony na czynnik wrażliwy na cyjanki) i z czynnika wrażliwego na cyjanki (katalizuje desaturację kwasów tłuszczowych).
Enzym związany z błonami siateczki śródplazmatycznej to także glukozo-6-fosfataza, takie jej umieszczenie pozwala na szybkie wytransportowanie wolnej glukozy poza obręb komórki.
Enzymy związane z błoną plazmatyczną to np. 5`nukleotydaza, cyklaza adenylanowa (receptory), pompa sodowo-potasowa.
Enzymy związane z aparatem Golgiego to np. galaktozylotransferaza.
Z wewnętrzną błoną mitochondrialną są związane enzymy przenoszące kwasy tłuszczowe z cytozolu do matrix mitochondrialnej, tzn. acylotransferaza karnitynowa I i II.
Alanina i mleczan jako substraty glukoneogenezy.
Wśród substratów glukoneogenezy można rozróżnić takie związki, które podlegają jej bez szczególnej recyklizacji (np. niektóre aminokwasy oraz propionian) i na takie, które są produktami częściowego przetworzenia glukozy w niektórych tkankach i są transportowane do wątroby i nerek, aby ulec resyntezie do glukozy.
Wśród aminokwasów tansportowanych z mięśni do wątroby w okresie głodzenia dominuje alanina. Zaproponowano istnienie tzw. cyklu glukozowo-alaninowego: krążenie glukozy z wątroby do mięśni (jako glukozo-6-fosforan) z wytworzeniem tam pirogronianu (glikoliza) ulegającego transaminacji do Ala. W czasie głodu Ala jest ponownie transportowana z mięśni do wątroby i ulega glukoneogenezie (tzn. w wątrobie następuje transaminacja do pirogronianu i następnie jego przekształcenie do glukozy). W ten sposób następuje przenoszenie azotu aminowego z mięśni do wątroby, a swobodnej energii z wątroby do mięśni. Energia niezbędna do syntezy glukozy z pirogronianu w wątrobie pochodzi z utleniania kwasów tłuszczowych.
Mleczan jest zaś produktem utleniania glukozy w mięśniach szkieletowych i erytrocytach. Przy braku tlenu, a w dużym wysiłku fizycznym, NADH wytwarzany w wyniku glikolizy jest niedostatecznie szybko utleniany w łańcuchu oddechowym. Odtworzenie NAD+ zachodzi w wyniku przekształcenia pirogronianu do mleczanu (dehydrogenaza mleczanowa) - dzięki temu może dalej zachodzić glikoliza. Następuje nagromadzenie mleczanu, którego jedyną drogą dalszego metabolizmu jest przekształcenie go z powrotem w pirogronian. Mleczan dyfunduje z mięśni do krwi i dostaje się do wątroby. Tam dehydrogenaza mleczanowa katalizuje tą samą reakcję co wcześniej, tyle że w drugą stronę (przy czym NAD+ redukowany jest do NADH + H+). Pirogronian ulega glukoneogenezie. Jest to tzw. cykl Cori.
Rola polimeraz DNA w procesie replikacji.
Polimerazy DNA są enzymami odpowiedzialnymi za replikację DNA oraz naprawę nowo zsyntetyzowanej nici. Substratami do reakcji są nukleotydy trójfosforanowe, a podczas reakcji następuje odczepienie pirofosforanu (pirofosfataza rozszczepia PPi i uwalnia się energia potrzebna do procesu), więc do nici włączane są deoksyrybonukleotydy monofosforanowe. Większość polimeraz wymaga startera (RNA lub DNA), by móc rozpocząć syntezę DNA. Katalizują atak nukleofilowy końca 3`-OH startera (a potem końcowego nowo przyłączonego nukleotydu) na atom fosforu α deoksyrybonukleotydu. Polimerazy dostarczają jako produktu nić DNA, jako matrycy używają DNA lub RNA (mała wydajność - wyjątek to odwrotne transkryptazy - wynikiem przepisania RNA na DNA jest tzw. cDNA).
Oprócz aktywności polimerazy, enzymy te wykazują również aktywność egzonukleaz. Egzonukleaza 3`->5` sprawdza poprawność wprowadzonych nukleotydów i je usuwa w razie potrzeby. Egzonukleaza 5`->3` występuje znacznie rzadziej, może odrywać pojedyncze nukleotydy z końca 5` - bakteryjna polimeraza I dzięki tej zdolności usuwa primery i wypełnia po nich luki.
Polimerazy u Prokaryota:
Polimeraza DNA I: posiada wszystkie trzy aktywności. Jest monomerem, który można podzielić na mały fragment (o akt. egzonukleazy 5`->3`) i duży (egzonukleaza 3`->5` i polimeraza). Jest enzymem umiarkowanie procesywnym - przyłącza jednorazowo do 20 nukleotydów zanim się oderwie. To ona usuwa starterowy odcinek DNA.
Polimeraza DNA II: monomer o aktywności polimerazy i egzonukleazy 3`->5`; współdziała podczas naprawy DNA, ale nie jest potrzebna do replikacji.
Polimeraza DNA III: Zbudowana z wielu podjednostek (ok. 10), jest asymetrycznym dimerem (jeden dimer zajmuje się nicią wiodącą, drugi opóźnioną). Jest bardzo procesywna, odrywa się dopiero po zsyntetyzowaniu całej nici. Ma aktywność polimerazy i egzonukleazy 3`->5`
Polimerazy u Eucaryota:
Wyróżnia się pięć polimeraz, z czego cztery występują w jądrze komórkowym (α, β, δ, ε), a jedna -γ- w mitochonrium.
Polimeraza DNA α = wysokocząsteczkowa polimeraza, najważniejsza u Eucaryota, porównywana do Polimerazy III u bakterii. Wchodzi w skład kompleksu enzymatycznego z δ i ε. Z δ odpowiada za syntezę głównej masy DNA. Syntetyzuje nić opóźnioną.
Polimeraza DNA β: razem z ε zajmuje się naprawą uszkodzeń, przez co jest porównywana do Polimerazy II u bakterii. Działa wtedy, kiedy wystąpi konieczność naprawy, a więc poza fazą S cyklu komórkowego.
Polimeraza DNA δ: razem z α i ε syntetyzuje nić wiodącą.
Polimeraza DNA ε: działa razem z α i δ (kompleks enzymatyczny), zajmuje się syntezą nici wiodącej. Ma, razem z β aktywność egzonukleazy i naprawia błędy.
Polimeraza γ: syntetyzuje mitochondrialny, pozajądrowy materiał genetyczny. Jest aktywna cały czas, gdyż replikacja mitochondrialnego DNA zachodzi ciągle.