Rozdział 5.

Wprowadzanie DNA do żywych komórek

Działania opisane w rozdziale 4 spowodowały, że biolodzy molekularni są w stanie stworzyć zrekombinowaną cząsteczkę DNA. Kolejnym krokiem jest wprowadzenie jej do komórki. Ściśle mówiąc klonowanie zaczyna się dopiero od procesów, które będą opisane w tym rozdziale.

Klonowanie ma dwie zasadnicze cechy: po pierwsze, z bardzo niewielkiej ilości początkowej materiału otrzymujemy ostatecznie nawet kilka mikrogramów DNA, gdyż kolonie ciągle się dzielą, kopiując i powielając materiał genetyczny.

Kolejna właściwość to oczyszczanie, a właściwie selekcja. Klonowanie pozwala oczyścić nasz pożądany materiał od innych elementów które mogą znaleźć się w mieszaninie startowej. Są tam oprócz zrekombinowanych cząsteczek DNA, o które nam chodzi, również:

• niezligowane wektory

• niezligowane inserty

• wektory które uległy autoligacji

• wektory które przyjęły zły insert

Klonowanie pozwala nam usunąć wszystkie te cząstki w trakcie procesu, lub po jego zajściu dzięki mechanizmom selekcji.

Niezligowane cząsteczki stanowią najmniejszy problem, gdyż praktycznie nigdy nie są replikowane przez bakterie. Enzymy zwarte w bakteriach po prostu degradują je usuwając problem. Nieco większe wyzwanie stanowi plazmidy autoligowane oraz „złe” rekombianty. One już podlegają replikacji przez bakterie i ich odróżnienie odbywa się dopiero po wysianiu na etapie selekcji i tez jest dość proste gdyż komórka z ich obecnością będzie różniła się właściwościami oraz wyglądem na płytce.

5.1 Transformacja - przyjęcie DNA przez komórkę bakteryjną

Większość bakterii przyjmuje obce DNA z medium w którym są hodowane. Często jest ono degradowane, lecz czasami staje się elementem komórki bakteryjnej. Dzieje się tak zwłaszcza wtedy gdy wprowadzany plazmid ma miejsce ori rozpoznawane przez komórkę bakterii.

5.1.1 Nie wszystkie bakterie przyjmują DNA tak samo chętnie

W naturze, transformacja nie jest głównym procesem zmieniającym genom bakterii, świadczy o tym fakt, że w laboratorium tylko kilka gatunków przechodzi transformacje łatwo i bez przeszkód.

Większość bakterii, w tym E. Coli, potrafi przyjąć bardzo ograniczoną ilość materiału genetycznego, zatem aby móc tą ilość zwiększyć komórki muszą przejść traktowanie czynnikami fizycznymi i chemicznymi. Te które przejdą ten etap nazywamy kompetentnymi.

5.1.2 Przygotowywanie kompetentnych komórek E. Coli

W latach 70. gdy odbyło się wiele przełomowych odkryć dla genetyki, zaobserwowano również że komórki E. Coli chętniej przyjmują obce DNA, gdy są zanurzonej w lodowato zimnym roztworze soli. Od tamtego czasu tradycyjnie 50mM dodatek CaCl₂ jest używany, chociaż inne sole są również efektywne jak choćby chlorek rubidu.

Nie wiadomo jednak dokładnie, czemu tak się dzieje. Przypuszcza się jedynie, że CaCl₂ powoduje wytrącanie dużych ilości DNA poza komórkę, lub że jego obecność zmienia strukturę ściany komórkowej, tak że jest ona podatna na wiązanie się z DNA. W każdym razie traktowanie solą jest efektywne tylko dla wiązania się DNA ze ścianą, natomiast nie ma wpływu na samo przejście DNA do komórki. Przejście do środka jest uzyskiwane poprzez szokowe zwiększenie temperatury do 42 ^OC, i tu ponownie nie wiadomo czemu ten zabieg jest tak skuteczny.

5.1.3 Selekcja transformantów

Mimo prowadzenia tych zabiegów kompetentne komórki nadal przyjmują niewiele obcego DNA. 1 ng plazmidu zwanego pUC8 doprowadza do udanej transformacji zaledwie 1000-10000 komórek, co stanowi tylko 0,01% ilości, która mogłaby być transformowana, gdyby transformacja zachodziła ze 100 % skutecznością. Owe 10 000 transformantów to jedynie niewielka ilość w całej populacji komórek stanowiących jedną kolonię wysianą na płytce, jasne jest więc że trzeba było wymyślić sposób odróżnienia komórek transformowanych od tych które transformacji nie uległy.

Odbywa się ono poprzez obserwację ekspresji (bądź jej braku) genu, który jest zawarty w plazmidzie i zwany jest genem markerowym. Dla przykładu kolonie E. Coli są wrażliwe na ampicylinę i tetracyklinę, jednak plazmid pBR322, zawiera geny odporności na te leki. Jeden z nich koduje β-laktamazę, która konwertuje ampicylinę do formy nietoksycznej dla bakterii, drugi enzym postępujący tak samo z tetracykliną. Po eksperymencie transformacji, tylko te komórki który przyjęły plazmid z genami amp^Rtet^R są w stanie rosnąć na podłożu zawierającym oba antybiotyki. Nie-transformaty, nie będą generować kolonii na takim medium.

Większość wektorów ma co najmniej jeden gen odporności na antybiotyk. Sama obecność plazmidów w komórce bakterii nie wystarcza do nadania jej odporności, należy tu dodać że dopiero ekspresja genu z plazmidu powodująca enzym detoksyfikujący antybiotyk powoduje nadanie odporności. Ekspresja zaczyna się od razu po transformacji, ale potrzeba paru minut na to, by komórka zsyntetyzowała taką ilość enzymu, która pozwoli jej na przetrwanie w toksycznym środowisku. Co oznacza że po szoku cieplnym, komórki nie mogą być wysiewane od razu na podłoże selekcyjne z antybiotykami, lecz na około 1 h na podłoże zwykłe. Dopiero po godzinnej inkubacji na takim podłożu neutralnym można zacząć selekcję, która powinna ujawnić transformowane komórki, u których w tym czasie zdążyła się rozwinąć ekspresja genów odpowiedzialnych za oporność i enzymy mające tę odporność już zadziałały neutralizując toksyczne działanie antybiotyków.

5.2 Identyfikacja rekombinantów

Podłoże selekcyjne pozwala odróżnić komórki transformowane od nietransformowanych, lecz potrzeba użyć takiej metody, która pozwoli odróżnić komórki autoligowane od właściwych rekombinantów, które przyjęły nasz wklonowywany insert. W większości wektorów wklonowywany gen jest w stanie zniszczyć integralność jednego z genów markerowych. Rekombinanty zatem można odróżnić po tym, że nie ulega on u nich ekspresji. Ta technika nazywana insercyjną inaktywacją zostanie omówiona pokrótce na przykładach dwóch wektorów - pUC8 i pBR322.

5.2.1 Selekcja rekombinantów z pBR322 - insercyjna inaktywacja genu odporności na antybiotyk

pBR322 zawiera parę unikalnych miejsc restrykcyjnych które może być użyte do otworzenia wektora przed insercją fragmentu DNA, np. BamHI tnie pBR322 w tylko jednym miejscu, wewnątrz grupy genów nadających odporność na tetracyklinę. Zrekombinowana cząsteczka pBR322, która niesie z sobą dodatkowy materiał DNA w miejscu BamHI, nie jest już stanie nadawać gospodarzowi odporności na tetracyklinę, ponieważ jeden z niezbędnych genów został przerwany przez insert. Komórki zawierające rekombinant będą zatem odporne na ampicylinę, lecz wrażliwe na tetracyklinę.

Uwidacznianie tychże komórek odbywa się w następujący sposób. Po transformacji komórki są wysiewane na medium z ampicyliną, usunie to z ich grona wszystkie nietransformowane komórki i pozostawi transformanty oraz rekombinanty, gdyż oba są nadal na ampicylinę odporne. Aby zidentyfikowac rekombinanty wykonuje się replikę płytki na matrycy z drewna i umieszcza ją na medium z tetracykliną. Po inkubacji niektóre kolonie nadal rosną (transformanty, złożone z autoligowanych wektorów), a inne nie. Porównuje się obraz z płytki przed odciśnięciem i z tej na której odciśnięto replikę. Miejsca różniące się wskażą położenie kolonii rekombinantów na pierwotnej płytce. Innymi słowa miejsca gdzie rosły kolonie na pierwszej płytce, a których nie ma na płytce drugiej, są miejscami występowania kolonii rekombiantów (które jak już wiadomo nie są odporne na tetracyklinę).

---