Strony 69-78

Rzadziej stosowaną ale generalnie skuteczniejszą metodą ligowania lepkich końców jest ulice enzymów zwanych topoizomerazami. Używane są one w procesach obrotu podwójnej helisy po to, aby w procesie replikacji rozwinąć jedną z nici. Topoizomerazy są zdolne do rozwinięcia nici, bez konieczności wykonywana obrotów, a poprzez przecięcie jednej lub nitek i rozluźnienie w ten sposób ich struktury. Dlatego tez topoizomerazy maja zarówno aktywność ligazową jak i nukleazową.

Do ligowania tępych końców z użyciem topoizomeraz używany jest specjalny wektor. Topoizomerazy tną go rozpoznając sekwencje CCCTT. Po przecięciu enzym pozostaje kowalencyjnie związany z tępym końcem. Reakcja może być zatrzymana na tym punkcie Az wektor plazmidowy będzie potrzebny do dalszych działań. Ciecie topoizomeraza daje koniec 5'-OH i 3'-P. Dlatego inserty które chcemy wklonwywac musza mieć Konce 5' musza mieć grupę hydroksylową, a końce 3' - grupę fosforanową - dlatego używa się w celu przygotowania insertu alkalicznej fosfatazy. Dodanie takich insertów z grupą 5' OH spowoduje aktywacje topoiozmerazy zwianej kowalencyjnie z wektorem i jak dotąd „uśpionej” i spowoduje ligacje wektora z insertem. Zajdzie ona miedzy końcami 3'-P wektora i 5'-OH insertu. Tylko jedna z nici jest ligowana, co powoduje powstanie nieciągłości, lecz nie jest to problem, gdyż są one naprawiane przez enzymy w komórce gospodarza, czyli bakterii.

Działanie topoizomeraz:

Ligacja tępych końców z udziałem topoizomeraz:

Rozdział 5

Wprowadzanie DNA do żywych komórek

Działania opisane w rozdziale 4, spowodowały ze biolodzy molekularni są w stanie stworzyć zrekombinowaną cząsteczkę DNA. Kolejnym krokiem jest wprowadzenie jej do komórki. Ściśle mówiąc klonowanie zaczyna się dopiero od procesów które będą opisane w tym rozdziale. Klonowanie ma dwie zasadnicze cechy: po pierwsze z bardzo niewielkiej ilości początkowej materiału otrzymujemy ostatecznie nawet kilka mikrogramów DNA, gdyż kolonii ciągle się dzielą, kopiując i powielając materiał genetyczny. Kolejna właściwość to oczyszczanie, a właściwie selekcja. Klonowanie pozwala oczyścić nasz pożądany materiał od innych elementów które mogą znaleźć się w mieszaninie startowej. Są tam oprócz zrekombinowanych cząsteczek DNA, o które nam chodzi również:

• niezbigowane wektory

• niezbigowane inserty

• wektory które uległy autoligacji

• wektory które przyjęły zły insert

Klonowanie pozwala nam usunąć wszystkie te cząstki w trakcie procesu, lub po jego zajściu dzięki mechanizmom selekcji.

Wprowadzanie DNA do komórek:

Oczyszczanie mieszaniny dzięki klonowaniu:

Niezligowane cząsteczki stanowią najmniejszy problem, gdyż praktycznie nigdy nie SA replikowane przez bakterie. Enzymy zwarte w bakteriach po prostu degradują je usuwając problem. Nieco większe wyzwanie stanowi plazmidy autoligowane oraz „złe” rekombianty. One już podlega replikacji przez bakterie i ich odróżnienie odbywa się dopiero po wysianiu na etapie selekcji i tez jest dość proste gdyż Komorka z ich obecnością będzie różniła się właściwościami oraz wyglądem na płytce.

Rozdział poświecimy temu jak rekombinowane cząsteczki pochodzące z wektorów plazmidowych i fagowych SA wprowadzane do bakterii, ten rodzi al również opisze jak odróżnić kolnie bakterii które przyjęły autoligowany wektor od tych które przyjęły właściwa, zrekombinowaną cząsteczkę.

5.1 Transformacja - przyjęcie DNA przez komórkę

Większość bakterii przyjmuje obce DNA z medium w którym są hodowane. Czasami jest ono degradowane, lecz czasami staje się elementem komórki bakteryjnej. Dzieje się tka zwłaszcza wtedy gdy wprowadzany plazmid ma miejsce ori rozpoznawane przez komórkę bakterii.

Nie wszystkie bakterie przyjmują DNA tak samo chętnie

W naturze, transformacja nie jest głównym procesem zmieniającym genom bakterii, świadczy o tym fakt ze tylko kilka gatunków przechodzi transformacje łatwo i bez przeszkód. Wikeoszc bakterii, w tym E. Coli, potrafi przyjąć bardzo ograniczoną ilość materiału genetycznego, zatem aby moc te ilość zwiększyć komórki musza przejść traktowanie czynnikami fizycznymi i chemicznymi. Te które przejdą ten etap nazywamy kompetentnymi.

Przygotowywanie kompetentnych komórek E. Coli

W latach 70. gdy odbyło się wiele przełomowych odkryć dla genetyki, zaobserwowano również że komórki E. Coli chętniej przyjmują obce DNA, gdy są zanurzonej w lodowato zimnym roztworze soli. Od tamtego czasu tradycyjnie 50mM dodatek CaCl₂ jest używany , chociaż inne sole są również efektywne jak choćby chlorek rubidu. Nie wiadomo jednak dokładnie, czemu tak się dzieje. Przypuszcza się jedynie że CaCl₂ powoduje wytracanie dużych ilości DNA poza komórkę, lub że jego obecność zmienia strukturę ściany komórkowej, tak że jest ona podatna na wiązanie się z DNA. W każdym razie traktowanie solą jest efektywne tylko dla wiązania się DNA ze ścianą, natomiast nie ma wpływu na samo przejście DNA do komórki. Przejście do środka jest uzyskiwane poprzez szokowe zwiększenie temperatury do 42 C, i tu ponownie nie wiadomo czemu ten zabieg jest tka skuteczny.

Oba zabiegi:

Selekcja transformantów:

Mimo prowadzenia tych zabiegów kompetentne komórki nadal przyjmują niewiele obcego DNA. 1 ng plazmidu zwanego pUC8 doprowadza do udanej transformacji zaledwie 1000-10000 komórek, co stanowi tylko 0,01% ilości która mogłaby być transformowana, gdyby transformacja zachodziła ze 100 % skutecznością. Owe 10 000 transformantów to jedynie niewielką ilość w całej populacji komórek stanowiących jedna kolonie wysiana na płytce, jasne jest wiec ze trzeba było wymyślić sposób odróżnienia komórek transformowanych od tych które transformacji nie uległy. Odbywa się ono poprzez obserwację ekspresji (bądź jej braku) genu, który jest zawarty w plazmidzie i zwany jest genem markerowym. Dla przykładu kolonie E. Coli są wrażliwe na ampicylinę i tetracyklinę, jednak plazmid pBR322, zawiera geny odporności na te 2 leki. Jeden z nich koduje β-laktamazę ,która konwertuje ampicylinę do formy nietoksycznej i drugi enzym postępujący tak samo z tetracykliną. Po eksperymencie transformacji, tylko te komórki który przyjęły plazmid z genami amp^Rtet^R są w stanie rosnąć na podłożu zawierającym oba antybiotyki. Nie-transformaty, nie będą generować kolonii na takim medium.

Sama obecność plazmidów w komórce bakterii nie wystarcza do nadania jej odporności, należy tu dodać że dopiera ekspresja genu z plazmidu powoduje nadanie odporności. Co oznacza ze po szoku cieplnym, komórki nie mogą być wysiewane od razu na podłoże selekcyjne z antybiotykami, lecz na około 1 h na podłoże zwykle. Dopiero po godzinnej inkubacji na takim podłożu neutralnym można zacząć selekcję, która powinna ujawnić transformowane komórki, u których w tym czasie zdążyła się rozwinąć ekspresja genów odpowiedzialnych za oporność i enzymy mające tę odporność już zadziałały neutralizując toksyczne działanie antybiotyków.

Rysunki obrazują powyższe słowa:

Idenrtyfikacja rekombinantów

Podlzoe slekcyjne pozwala odroznic komórki transformowane od nietransformowanych, leczp otrzeba użyć takiej metody ktorap zowoli odroznic komórki autoligowane od lwasciwych rekombinantów, które przyjęły nasz wklonowywany insert.

Różnica miedzy autoligowanym wektorem(a), a wektorem z insertem(b):

W wiekszosci wektorów wklonowywany gen jest w stanie zniszyc integrlanosc jednego z genów markerowych. Rekombinanty zatme można odroznic po tym ze nie ulega on u nich ekspresji. Ta technika nazywana insercyjną inaktywacją zostanie omowiona pokrótce na przykladach dwóch wektorów, pUC8 i pBR322.

Insercyjna inaktywacja w pBR322:

pBR322 zaiera jedno uniklane miejsce od cieca restryktazą, które otwiera ten wektor dokaldnie w miejscu gdzie przebiega gen odpornosci na tetracyklinę. Zrekombinowana cząsteczka zatem dostarcz nadla odpronsci na ampicylinę, ale z powodu wstawienia insertu w miejsce po przecieciu BamHI już nie daje odpornosci na tetracyklinę, gdyż gen za to odpowiedizlany został uszkodozny. Komórki zaiwrające rekombinant będą zatem odporne na ampicylinę, lecz wrażliwe na tetracyklinę.

Uwidacznianie tychze kmorek odbywa się w nastepujacy sposób:

Po transformacji komroki są wysiewane na medium z ampicyliną, usunie to z ich grona wszystkie nietransformowane komórki i pozostawi transformanty oraz rekombinanty, gdyż oba są nadla na ampicylinę odporne. Aby zidentyfikowac rekombinanty wykonuje się replikę płytki na matrycy z drewna i umieszcza ją na medium z tetracykliną. Po inkubacji niektóre kolonie nadla rosną (transformanty, złożone z autoligowanych wektorów), a inne nie. Porównuje isę obraz z płytki przed odcsinieciem i z tej na której odcisnięto replikę. I miejsca rózniace się wskaza polozenei kolnii rekombinantów na pierowtnej płytce. Innymi słowa miejsca gdzie rosly koolnie nap ierwszej płytce, a których nie ma na płytce drugiej, są miejscami występowania kolonii rekombiantów (które jak już wiadomo nie są odporne na tetracyklinę).

Tę technikę obrazuje rysunek:

---