STRONY 102-111

Eksperymenty klonowania z użyciem kosmidu

Kosmid jest otwierany przez restryktazy w konkretnym miejscu cieica , i wstawiany jest w niego insert. Powstałe DNA, ciete jest nastpenie wm iejscach cos, taka jak w przypadku zwykłego faga i pakowane in vitro. Pakowane są ponownie tylko te fragmenty który przyjęły insert, gdyż tylko one mają odpowedni rozmiar, co oznacza że już na tym etapie nastepuje generowanie tylko i wyłącznie samych rekombinantów. Tak otrzymane fagi transfekuje się do E. Coli, i otrzymuje kolonie zawieraja komórki które przyjęły faga i te które go nie przyjęły. Selekcja nastepnuje na medium z ampicyliną, gdyż jak wiadomo kosmid zawiera gen markerowy odpowedizalny za odporność na ampicylinę.

Typowy kosmid i jego użycie:

Wektory wielkopojemnosciowe do konstrukcji bibliotek genomowych:

Wektory λ mogą pomiescic duze inserty do 20 kb, a niektóre kosmidy nawet do 40 kb. Wektory M13 i plazmidy maja mniejszą pojemność która wynosi od 3 do 8 kb. Zdolnosc do przenoszenia tak dużych fragmentów jak np. w kosmidach powoduje ze można wygenerować biblioteke genomoą. Tabela pokazuje z ilu fragmentów o dlugosciach 17 i 35 kb, skladala by się taka biblioteka dla roznych gatunkow organizmow. Np. gdyby genom E. Coli pocieto na fragmenty 17kb, potrzeba by ich było 820, aby pokryc nimi caly genom.

Biblioteki genomowe powstaja przez iwwle lat, isa powielane w iwelu kopiach, tak aby każdy kto w danej chwili pragnie zbadać dowolny gen z np. E. Coli, miął do niego dostęp. Prawdopobienstwo że w danej bibliotece znajdziemy szukany przez nas gen, oblicza się z następującego wzoru:

p - prawdopobieństwo zanalezenia przez nas szukanego genu

N - wielkosc biblioteki genomowej, w której szukamy tego genu

a - średnia wielkosc fragmentów które były wstawiane(insertów), np. 25 - 40 - dla kosmidów, 3-8 - dla plazmidów

b - wielkość genomu danego organizmu

Jak widizmy dla czloweika potrzeba około pol miliona fragmentów, aby móc powieidzec ze w bibliotece jest caly jego genom. Trudno sobie wyobrazic istnienei takeij biblioteki i sposób jej przechowywania, jak również niemoliwe byloby przeszukiwanie tak duzej ilość fragmentów pod katem jednego przez nas szukanego. Nie istnieja jeszcze takie metody. Co wiecej genom żaby jelsi poddawalibysmy badaniu przez biblioteke musileibysmy liczyc się z przeszukanie blisko 2 milionów fragmentów wielkości 35 kb(czyli kosmidowych), co zajeloby wiele lat, zakaldajac ze taka biblioteka moglaby w ogole powstać i że istnialyby techniki na przeszukiwanie takiej ilości klonów. Oczywsicie caly czas prowadzone są badania które maja na celu redukcję tych liczb. Jednym ze spsobow, najoczywsotszym, jest zwiekszenie wielkości insertow, które moglyby być wklonowywane. Jednym z popularnych wielkopojemnosciowych wektorow do tego celu są sztuczne chromosomy bakteryjne (BACs).

Bazują one na plazmidize F, które może pomiescic wielkie inserrty do 300 kb, co zredukowaloby biblioteke dla człowieka do 30,000 klonów. Inne tego typu wektory oparte są na bakteriofagu P1, który mozep omiesicc inserty 75-100 kb, a jeszcze inne są hybrydą dwóch wyżej wymienionych i mieszcza fragmenty do 300 kb. Nazywaja się one pochodnymi P1 sztucznymi chromosomami (PACs).

6.5 Wektory dla innych bakterii

Poza E. Coli, znamy też wektory dzialajace w innych komorkach, jak streptomyes, bacillus czy pseudomonas. Wekotry dla innych bakterii opieraja się na plazmidach naturlanie wystpeujacych w tych organizmach lub na plazmidach które maja szeroki zakres gospodarzy. Kilka jest także pochodnymi bakteriofagów. Ich uzycie i wlaciwosci są podobne jak dla wektorów już wymienionych, zaiwerają również geny markerowe bazujace na odporności na antybiotyki.

ROZDZIAŁ 7

Wektory dla Eukaryotów

E. Coli to najpopularniejszy organizm jeśli chodzi o eksperymenty klonowania, uzywany jest najczesciej ze względu na latwosc badnaai podstawoych funkcji genów w tej bakterii oraz ze względu na szeroka wiedzę o niej. Jednakze czasmai zycie wymaga użycia innych gospodarzy do klonowania. Jest to szczególnie ważne w biotechnologii, gdzie nie chodzi nam o poznanie genu lecz o produkcje rezultatów jego ekspresji, czyli bialek. Zastosowanie takei jak wprowadzanie odpornosci na herbicydy u roslin, lub produkcja niebakteryjnych hormonów lub insuliny wymagaaj roszerzenia naszej wiedzy o innych gospodarzy dlaobcego materiału genetycznego.

7.1 Wektory dla drożdży i grzybów

Saccharomyces cerevisiae to niezwykle istotny organizm w oparciu o którego nie tylko wyrabia się chleb czy piwo, lae również uzywa się do produkcji farmaceutykow z wklonowywanych genów. Rozwoj tej galezi genetyki bly możliwy po odkryciu plazmidu który wystepuje w drozdzach , który od swego rozmiaru zostal nazwany plazmidem 2 µm.

Oto i on:

Plazmid 2 µm stanowi idelaną bazę do eksperymentu, wielkosc jego genomu to 6 kb, licza kopii waha się miedzy 70 a 200. Replikacja odbywa się dzięki miejscu ori, enzymom gospodarza i białkom kodowanym przez geny z tego plazmidu REP1 i REP2.

Niestety nic nie jest doskonałe - problemem są geny markerowe, które w wielu plazmidach tego tpyu nie wystepują, w praktyce uzwane są plazmidy maja gen LEU2, który koduje dehydrogenazę β-izopropylojabłczanową, która bierze udział w konwersji kwasu pirogronowego do leucyny. Aby eksperyment się powiodł konieczne są auksotroficzne komórki drożdży, czyli takie które normalnie nie są w stanie produkowac leucyny(maja uszkdozny wlasny gen LEU2). Po klonwaniu ich poprzez plazmid rekombinanty zyskują zdolnośc do produkcji leucyny, podczas gdy komórki niezrekobinowane nie. Slekcja odbywa się zatem na podłożu minimalnym, które nie zawiera leucyny i na którym wyrosną tylko rekombinowane drozdze.

Użycei LEU2 jako markera:

Wekotry w oparciu o plazmid 2 µm, noszą nazwe drozdozwych episomalnych plazmidów (YEPs). Zawieraja one cąły plazmid 2 µm, lub tylko jego miejsce ori. Przykladem jest YEp13. YEp13 ilustruje wszystkie cechy drozodwych wektorow. Zawiera ori z plazmidu 2 µm, gen markerowy LEU2 oraz cala sekwencje z pBR322, co czyni go wektorem zdolnym do replikacji zarówno w drozdzach jak i w E. Coli. Wektor którego można uzywac w wiecej niż jednym organizmie nazywamy wektorem transferowym. Istnieej kilka powodow użycia tkaich wektorow. Jednym z nich jest to że jest ciezko o oczyszczenie i wyizolowanie wektora z komórki drożdży, znacznie ciezej niż w przypadku komórki bakterii ponieważ wektor taki silnie integruje się z chromosomami drożdży. Niemozliwa jest slekcja wówczas drożdży które są zrekombinowane od tych zwykłych. Wektory transferowe uzywa się więc najpierw do klonwania i selekcji w E. Coli, a nastepnie dopiero uzywa się ich do klonowania drożdży, gdy już wiemy ze uzywamy samych rekombinantów.

Słowo episomalny w naziwe wektora oznacza zę może się on dzielic niezlaeznie od podzaiłu komórki, jak i może się integrowac z genomem gospodarza. YEp13 ma taka mozliwosc ze względu an to że jego geny są niezwykle pdoobne do genów drożdży. Rekombinacja homologiczna miedzy plazmidowym genem LEU2, a genem drożdży LEU2, prowadzi do insercji cąłego Yepa do chromosomu drożdzy. Plazmid może pozostac zintergowany, lub kolejna rekombinacja moe doprowadzic do jego kolejnego uwolnienia.

YEp13:

Klonowanie z użyciem YEp13:

Rekombiancja pomiedzy LEU2 plazmidu a LEU2 komórki drożdży:

Inne typy wektorow drozdzowych:

Znanae są dwa typy istotnych wektorow zdolnych do wklonowania się w s.cerevisiae

-integrujące plazmidy drożdzowe (YIps), są po prostu bakteryjnymi plazmidami niosącymi geny drożdzy. Przykładem jest YIp5, który jest plazmidem pBR322, niosacym gen URA3. Ten gen koduje dekarboksylaze orotydyno-5'-fosforanową, która jest enzymem bioracym udzial w slzaku biosyntezy pirymidyn i pełni taką samą funkcję markerową jak poznany przez nas wcześniej gen LEU2. YIp niem oze replikowac się jak plazmid, wiec integruje się z chrmosoammi drożdży tak jak YEp.

-plazmidy replikacyjne drożdzy(YRps), są zdolne do niezalezenj replikacji, gdyż posaiadają miejsce ori. Ori jest zlokalizowane blisko genów markerowych. Przykładem jest YRp7, który jest plazmidem pBR322 z dodanym genem TRP1. Ten gen zaangazowany jest w produkcje biąłek bioracych udział w syntezie tryptofanu. Jest on zlokalizowany tuz przy miejscu ori.

YIp i YRp:

Trzy czynniki decyduja o przydatnosci konkretnego wektora do danego eksperymentu klonowania. Pierwszym jest czestotliwosc transformacji która okresla ile powstaje komórek ztransformowanych z mikrograma plazmidowego DNA. Wysoka czestotliwosc jest wymagana jeśli potrzeba uzyskac duza ilość rekombinantów lub jeśli dostarczno niewle materiału genetycznego. YEps maja najwyzszy wspolczynnik dajacy około 10 000-100 000 transformowanych komórek, YRps są średnio produktywne i daja miedzy 1 000 a 10 000 transforantów , najgorzej wypadaja YIps, które maja ponizej 1 000 transformantów z 1 µg DNA. Niska czestotliwosc u YIps odzwierciedla fakt ze czesta integracja z chormosomem drozdzy wplywa na zywotnosc materiału przechowywanego w komorce. Drugim czynnikeim jest ilość kopii, niezwykle ważna, gdy chcemy otrzymać lub badac produkty białkowe genów.

YEps i YRps mają najwyższe wspolczynniki odpowednio: 20-50 i 5-100. Najslabszy wynik uzyskuje YIp - tylko jedna kopia na jedną komórkę. Dlaczego wiec w ogóle uzywamy YIp?

Ponieważ YIps dają najbardziej stabilne rekombinanty, YIp który się integruje ma bardzo niewielkie straty. Dal porownania YRps generują bardzo niestabilen rekombinanty, zaś YEp nie są tak nieposłuszne, lecz powoduja kilka problemów. Niemniej jednak, YIp jest wektorem koniecznym, jeśli potrzeby eksperymentu stanowią, że rekombinowane komórki drożdży muszą zachować sklonowany gen na długich czas w kulturze drożdży.

Sztuczne chromosomy:

Zaistniała potrzeba, aby inserty wklonowywane do komórek drożdży mialy coraz wiekszy rozmiar. Dlateog zaczeto badac morfologie chormosomu, aby stworzyc cos na ksztaąłt sztucznego chormosomu, mogacego pomiescic olbrzymie ilości informacji. Sztuczne chromoosmy drożdżowe (YAC) stanowią fundamenty rozwoju nowych badań nad klonowaniem i są obecnie najbardziej inwestowaną dziedizną w dziale inzynierii genetycznej.

Kluczowe komponenty chromosomu to:

• Centromer - który jest wymagany do poprawnego podzialu do siostrzanych komórek podczas podzialu komórki

• Telomery - struktury na koncu chromosomu, niezbedne do wlasciwej replikacji oraz chroniące chromosom przed caiglym skracaniem przez restryktazy

• Miejsca startu replikacji (origin) - lokacje w których nasteopuje inicjacja replikacji DNA, podobne do miejsc ori w plazmidize.

Kiedy zdefiinujemy tka strukture chormosomu, nic nie stoi na przeszkdozie aby poszczegolne jej komponenty stworzyc sztucznie, a ponieważ chormosomy z reguly przechowują duze ilości DNA, inserty do nich wklonowywane mogą osiagac niebotyczne rozmiary

Struktura chromosomu:

Wektory YAC:

W podobny spsosob skonstruowaną cąła linie wektorów YAC, której przykładem jest pYAC3. Choć na pierwszy rzut oka, pYAC3 nie wyglada na sztuczny chromosom, pewne jeco cechy są wyraznie unikalne. pYAC to w rzeczywsitstosci plazmid pBR322, w którym znajduje się mnostwo insertów drożdżowych. Dwa z nich TRP1 i URA3 znamy już jako geny markerowe w YIpach i YRpach. Rózcach polega na tym iż regiony zawierające te geny są bardizej rozszerzone YAC niż w YIp lub YRp. Zawieraja m.in. sekwencję CEN4, która jest centromoerowym regionem chormoosmu 4. Zatem TRP1-origin-CEN4 to fragment który zaiwiera już 2 z 3 komponentów chormosomu. Trzeci, czyli telomery, jest dostarczany przez sekwencje nazywaną TEL. Nie są to pelne sekwencje telomerów, lecz fragmenty z których telomery normalnie się skladają. Pozostaje jeszcze jeden element - SUP4, który jest genem markerowym, w którego srodku wprowadzany jest insert.

Strategia klonowania z YAC wyglada następująco:

Wektor najpierw jest traktowany restryktazami BamHI i SnaBI, przez co powstaja 3 fragmenty. Fragment pocohdzacy z ciecia BamHI jest odrzucany, a pozostale dwa mają na koncach sekwencje TEL i miejsce ciecia SnaBI. DNA który jest insertem, musi mieć tępę końce(ponieważ restyktaza SnaBI, tnie pozostawiajac tępę końce) jest ligowany z koncowkami tego fragmentu, łącząc je w jedną całość, dajac tym samym sztuczny chromosom.Transformacja protoplastowa jest uzywana do wprowadzenia tego wektora do S. cerevisiae. Komórki drodzowe biorace w tym udział są mutantmai auksotroficznymi z genotypem trp1^- i ura3^-, które po transformacji mją genotyp trp1⁺ i ura3⁺ dzięki temu że geny TRP1 i URA3 znajdują się w wektorze YAC. Selekcja tranformantów jest dzięki temu bardzo prosta, gdyż odbywa się poprzez wysianie komórek drożdży na podłoże minimalne nie zawierające tryptofanu i uracylu. Żadne inne poza transformowanymi komórkami nie wyrosną na tym medium. Rekombinanty od autoligowanych cząsteczek odroznią się natomiast dzięki genowi markerowemu SUP4; kolonie zrekombniowane rosną na biało, a zwykłe - na czerwono.

Strategia użycia wektorów YAC:

Zastosowanie wektorów YAC

Tym co stymulowało genetyków do odkrycia czegos takeigo jak YAC była cheć pzonania głebiej struktury i zachowania chromosomów.

---