Strony 143-152

Hybrydyzacja Southerna w szczegółach

Rysunek raz jeszcze:

Pierwszym krokiem w Southern blotting jest obcięcie danego klonu przez restryktaze BamHI i rozdzielenie powstałych fragmentów przez elektroforezę na żelu agarozowym. Fragmenty z żelu agarozowego są następnie odciskane na membranę celulozową lub nylonową, i nakładana na nie jest sonda komplementarna do naszego genu. Proces czasami od razu robiony jest na żelu, ale jego działania jako tła może fałszować wyniki. Transfer pasków DNA po cieciu z żelu na membranę nazywany jest transferem Southerna, gdyż to profesor Southern jako pierwszy w 1975 dokonał tego procesu. Co ciekawe od odciśnięcia tych fragmentów na membranie nadal używa się często papierowych ręczników tak jak to robił prof. Southern w 1975 roku, choć czasami używa się specjalnych buforów. Analogicznie metody „northern” i „western” blottingu stosuje się do transferu odpowiednio RNA i białek.

Koniec końców na membranie mamy replikę fragmentów z żelem i sonda która jest oczywiście wyznakowana, hybrydyzuje z odpowiednim fragmentem, dzięki czemu wiemy które miejsca ciecia są położone najbliżej niego.

Metody identyfikacji wykrywające produkt translacji badanego genu

Sondy hybrydyzacyjne jak już wiemy pozwolą nam odróżnić klon od setki innych w bibliotece. Niestety zawodzą jeśli mamy bardzo ograniczoną wiedzie o genie który mamy badać oraz gdy nie jesteśmy w stanie wytworzyć odpowiedniej sondy. Wtedy z pomocą przychodzą nam techniki immunologiczne.

Obrazowanie immunologiczne zakłada ze nasz gen jest ekspresjonowany i istnieje produkt jego ekspresji, czyli białko na badanej płytce w bibliotece.

Przeciwciała są wymagane do przeprowadzenia detekcji:

Jeśli oczyszczoną próbkę białek wstrzykniemy do krwioobiegu królika, w jego organizmie natychmiast wytworzone zostaną przeciwciała, które rozpoznają obce białka i je zdegradują. Jest to naturalny mechanizm obrony immunologicznej obecny w każdym organizmie ssaczym. My sprytnie wykorzystujemy fakt ze nawet po zabiciu białek, przeciwciała utrzymują się w krwi królika jeszcze przez kilka dni, nie musimy nawet go zabijać, lecz pobrać próbkę około 10 ml jego krwi, aby wyizolować z niej przeciwciała. Od tej pory dysponujemy cząsteczkami, które będą się wiązać w każdych warunkach do tylko określonego typu białka - tak działają przeciwciała, które funkcjonują tez poza organizmem królika.

Otrzymywanie przeciwciał:

Zastosowanie przeciwciął do identyfikacji:

Istniej kilka wersji testów immunologicznych, lecz najpopularniejsza zostanie opisana ponizej. Kolnie z plytki są transferowane na matrycę, ktorą jest poliwinylową lub nitrocelulozowa membrana, komórki poddawane są lizie, a na matryce nastepnie nakladany est roztwór zaierajacy przeciwciała. Można powieidzec ze teraz przeciwciała przejmuja rolę sond hyvrydyzacyjnych. We wczesnych metodach, jako znacznika uzywano izotopow przylaczanych do kazdego przeciwciala, bądź matryce przemywano zaznakowanym białkiem A, do którego przylaczają się wszystkie przeciwciała. Obecnie robi się tak: po nalozeniu pierwszego przeciwciala specyficznego dla naszego białka, naklada się drugie przeciwcialo specyficzne dla pierwszego przeciwciała. Wiązań jest dzięki temu wiecej, są silniejsze, i sygnal jest bardziej klarowny. Za każdym razme znakowanie jest radioaktywne, po którym uzywa się autoradiografii lub fluorescencyjne.

Test immunologiczny:

Powodzenei tej metody zależy oczywiście od tego jak dobrze ekspresjonwany jest gen. Często jest jednak tak, ze gen jednego organizmu nie jest dobrze ekspresjonwany w innym, stad malym powodzeniem cieszy się ekpsresja np. genów ludzkich w E. Coli. Ten problem czasmai, lecz nie zawsze można roziwazac poslugujac się wektorem ekspresyjnym, który zawiera miejsca promotorowe i „wyrecza” komrke w ekspresji badanego genu. Rozszerza to znacznie pole działania technik immunolgicznym, dzięki ktroym można wykryc np. geny produkujace ludzkie hormony w koloniach E. Coli.

ROZDZIAŁ 9

PCR

9.1 Reakcja łańcuchowa polimerazy w zarysie

Aby skompletować naszą podstawową edukacje w zakresie analizy DNA, musimy powrócić do reakcji łańcuchowej polimeryzacji (PCR). PCR to wyjątkowo nieskomplikowana technika, w którym krótki region DNA jest powielany przez polimerazę, i z jednej kopii tworzą się w krótkim czasie miliony. Wygląda to na proste ćwiczenie dla studentów, lecz PCR jest wykorzystywany w wielu arenach działań genetyków.

Ten rozdział zaczniemy od dokładnego omówienia PCR, potem przejdziemy do warunków od których zależy czy PCR się powiedzie i zakończymy na dodatkowych zastosowaniach różnych odmian PCR.

PCR skutkuje selektywna amplifikacja regionu cząsteczki DNA. Może wybrać dowolny region DNA, byleby znać jego sekwencje oskrzydlające, ta wiedza jest konieczna do skonstruowania krótkich primerów, z których każdy przyłączy się do jednej z nici DNA i zapoczątkuje reakcje polimeryzacji. Premiery w ten sposób zakreślają pewien region który będzie amplifikowany.

Rola primerów:

Poliemryzacja jest katalizowana przez enzym polimeraza Taq, pochodzacy z zyjacej w goracych źródłach bakterii thermus aquaticus, która jest termostabilna i której optimum działania przypada na 74 C. Zatem do PCR, potrzebujemy wyjsciowego DNA, primerów, substratów) jakimi będą dNTPy i polimerazy. Konieczne jest scisle przestrzeganie warunków jakie musza być w każdym etpaie PCR, co dotyczy zwlaszcza temperatury.

Materialem wyjsciowym może być nawet jedna cząsteczka DNA. Reakcje zaczynamy od podgrzania mieszaniny do 94 C, wówczas nici ulegaja rozdzieleniu. Wiązania wodorowe ulegaja przerwaniu i dysponujemy pojedynczymi nićmi DNA. Nastpenie ochladzamy miksturę do 50-60 C, aby premiery zhybrydyzowały z nićmi. Synteza DNA zaczyna się po podgrzaniu do 74C, która ot jest optymalna dla polimerazy Taq. Po pierwszym cyklu mamy dwa długie produkty, które maja jednakowy koniec 5', ale inny koniec 3' o losowej dlugosci, w zależności od miejsca na którym zatrzymala się polimeraza.

Cały, trzyetpaowy cykl denaturacja-hybrydyzacja-polimeryzacja jest powtarzany, a po jego zkaonczeniu otrzymujemy cztery nowe dupleksy DNA, z których dwa są tak smao dlugie jak w poprzednim cyklu, a dwa pozostałe inne, nieco tylko krotsze. Po 3 cyklu otrzymujemy dopiero krotkie framgenty DNA, których pozycje 5' i 3' są jednakowe i ustalone na podstawie miejsc przyłączenia primerów. Są to nasze docelowe kopie. W kolejnych cyklach ilosc krótkich produktow rośnie eksponencjalnie (czyli się podwaja podczas kazdego cyklu), aż zabraknie jednego z substratów rekacji, bądź wyczerpie się procesywnośc polimerazy. Po 30 cyklach otrzymujemy około 130 milionów kopii, co jest równe kilku mikrogramom DNA z materiału wyjsciowego ważącego mniej niż 1 ng.

Opis pierwszego cyklu PCR:

Drugi i 3 cykl PCR:

Po zakonczeniu PCR, powstale fragmenty są poodawane elektofoerezie w żelu agarozowym i sekwencjonowaniu.

9.2 Wieksze szczegóły dot. PCR

Chociaz PCR to prosta procedura, musi być ostroznie prowadozny , kluczowe tu są sekwencja primera oraz temperatura podczas procesu.

Konstruowanie primerów PCR:

Dobre primery to klucz do sukcesu w PCR. Każdy primer oczywsicie musi być komplemnetarny do sowjej nici, konstrukcja jego sekwencji nie stanowi problemu jeśli znamy sekwencje oskrzydlajacego regionu, jeśli zrobimy go odbrze ekepseryment się poweidize, jeśli zle replikacja w ogole nie zajdzie lub powielony zostanie zły region.

Przykladowe pary primerów:

Rezultaty PCR dla dobrych i złych primerów:

(tylko sciezka 1 obrazuje dobre wyniki, sciezki 2,3, i 4 pokazuja ze z primerami było cos nie tak)

Zanczenie długości primerów:

Fragment amlifikowany inep owinen mieć wiecej niż 3 kb, a idelany rozmiar to 1 kb. Amplifikacja iwekszych fragmentów jest możliwa lecz wymaga specjalnych metod.

Najwazniejszą sprawą jest długosc primerów:

Jeśli są za krotkie to mogą hybrydyować w różnych innych miejscach. Żeby to zilustrowac podjamy za przykład genom człowieka, do którego amplifikacji użyjemy primera 8 nukleotydowego. Sekwencja jaka posiada primer powtorzy się co 4⁸=65,536 bp. Jeśli cały genom człowieka liczy 3 mln kb, oznacza to ze miejsc hybrydyzacji w takim genomie jest 49,000. Jest to zbyt duzal iczba która grozi nam ze zamplifikujemy zueplnie inny fragment niż nasz pożądany. Jak wygladaja te obliczenia jeśli użyjemy 17-nukleotydowego primera?

Sekwencja primera powtorzy się co 4¹⁷=17 mld bp. Jest to piec razy wiecej niż wynosi caly genom człowieka, wiec ten primer zhybrydyzuje się tylko w jednym unikalnym miejscu, czyli zamplifikowany zostanie nasz właściwy fragment. Dalczego wiec istniej górny limit dlugosci primera? Ponieważ replikacja zostalaby znacznie spowolniona, gdyż dlugie premiery spowalniają procesywność polimerazy. W praktyce nie używa się primerów dluzyszch niż 30 elementów.

Temperatury w PCR:

Podczas całego PCR ograniczmay się do 3 podstawowych temperatur:

-denaturacja w 94 C

-hybrydyzacja primerów w 50-60 C

-replikacja w 74 C

Temperatura hybrydyzacji jest niezwykle istotna, ponieważ powstawanie hybryd DNA-DNA jest dosc wrazliwe. Jeśli jest za wysoka to nie zachodzi hybrydyzacja, zamiast tego nici pozostają rozdzielone. Jednak jeśli jest za mała to nie powstaja prawidlowe pary zasad, lub są one niestabilne. Jeśli znaiedbamy temperature nasze wysilki odtyczace konstrukcji primerów będą bezsensowne.

Profil temperatur w PCR:

---