Danuta Grygierczyk
Aleksander, L. Sieroń

DZIEŃ 1

(Poniedziałek)

  METODY BIOLOGII MOLEKULARNEJ

  1)   Klonowanie genów

W DNA pochodzącym z komórek ludzkich sekwencja poszczególnych genów występuje w niewielkiej liczbie kopii, mimo iż genom każdego organizmu jest duży i złożony. Do izolacji dużej ilości specyficznego regionu danego genomu nie można zastosować standardowych metod chemicznych czy biochemicznych. Poszukiwana bowiem sekwencja genomu jest chemicznie nieodróżnialna od całej sekwencji DNA. Pomocną techniką do wyodrębnienia szukanej sekwencji DNA i powielenia jej w ilościach wystarczających do szczegółowej analizy i manipulacji jest klonowanie (Ryc. 1).

Klonowanie składa się z następujących etapów:

1. izolacja fragmentu DNA zawierającego określony gen i wstawienie go do cząsteczki DNA zwanej wektorem

2. transformacja wektora do komórek gospodarza np. bakterii Esherichia coli (E. coli), drożdży, itp.

3. Powielanie się organizmu gospodarza wraz z egzogennym DNA, co prowadzi do powstania identycznych genetycznie organizmów, czyli klonów.

4. Izolacja DNA komórek gospodarza w celu dalszej jego analizy.

Gospodarzem do początkowej izolacji małych fragmentów DNA jest najczęściej komórka bakteryjna E. coli. Natomiast w przypadku dużych fragmentów genomu ludzkiego przydatne są komórki drożdży piekarskich Saccharomyces cervisiae.

Najczęściej stosowanymi wektorami do klonowania DNA są koliste cząsteczki DNA zwane plazmidami, które posiadają następujące cechy:

1. są zdolne do replikacji i izolacji niezależnie od genomu komórki gospodarza.

2. Posiadają gen selekcyjny, czyli gen pozwalający odróżnić komórki z wektorem od takich, które go nie mają (np. gen oporności na antybiotyki).

3. Mają małe rozmiary (około 3 kpz) co ułatwia ich izolację z hodowli bakteryjnych.

Pierwsze plazmidy były naturalnymi kolistymi cząsteczkami pozachromosowymi. Kolejne były ulepszonymi wektorami ułatwiającymi klonowanie. Ze znanych plazmidów należy wymienić: pBR322 (Ryc. 2), który zawiera 2 geny kodujące oporność na antybiotyki: ampicylinę i tetracyklinę, pUC - zawierający gen lac Z kodujący β- galaktozydazę działającą na substrat X-gal w wyniku czego powstaje barwny produkt- niebieski (plazmid pUC ze wstawką -obcym DNA); gdy gen lac Z jest nieczynny, powstają kolonie białe.

Niektóre plazmidy mogące transfekować komórki bakteryjne jak i komórki eukariotyczne, nazywane są wektorami wahadłowymi.

Oprócz plazmidów stosuje się inne wektory, takie jak:

Fag X - używany do klonowania większych fragmentów DNA.

Fag M13 - pozwala otrzymać klonowany fragment DNA w formie jednoniciowej

Kosmidy - powstałe z połączenia plazmidu i faga λ,

Sztuczne chromosomy drożdżowe YAC, w których klonowane są duże fragmenty genomu człowieka (100 do 200 tys. par zasad )

Wektory plazmidowe i fagowe są używane do ekspresji genów w licznych komórkach bakteryjnych, można je także włączać do genomu gospodarza (fag λ) (Ryc.3). Znane są także wektory plazmidowe dla drożdży - episomalne plazmidy drożdżowe, czy włączany do genomu roślinnego - plazmid bakteryjny Ti z Agrobacterium tumefaciens.

Znane są też inne wektory jak : SV40, bakulowirus , retrowirusy itp.

W klonowaniu plazmidowego wektora u E. coli obowiązuje następujący ogólny schemat:

1. izolacja plazmidowego DNA wraz z określoną sekwencją DNA (fragment)

2. trawienie czyli cięcie plazmidu na fragmenty za pomocą endonukleazy restrykcyjnej

3. rozdzielenie fragmentów elektroforetycznie w żelu agarozowym

4. oczyszczenie pożądanego docelowego fragmentu

5. ligacja fragmentu z nowym wektorem plazmidowym w celu powstania zrekombinowanej cząsteczki

6. przeniesienie plazmidu z docelowym fragmentem do E. coli transformacja

7. selekcja transformowanych bakterii zawierających badaną cząsteczkę DNA

8. analiza zrekombinowanych plazmidów.

-         Istnieją 2 główne źródła DNA w celu identyfikacji nieznanego genu: 1) całkowity genomowy DNA dowolnego gatunku - biblioteka genomowa lub 2) dla eukariontów całkowity mRNA (przepisany na sekwencję DNA) z tkanki, gdzie zachodzi ekspresja poszukiwanego genu - biblioteka komplementarnego DNA - cDNA.

 

2)   Tworzenie bibliotek cDNA

  Biblioteki genomowego DNA są zestawami klonów DNA, z których każdy powstał poprzez włączenie do wektora innego fragmentu DNA i namnażanie go w komórkach gospodarza (bakteria lub drożdże). Biblioteki genomowe przygotowuje się z przypadkowych fragmentów DNA (mało skuteczne metody poszukiwania genu). W przypadku biblioteki cDNA, powstały cDNA był syntetyzowany na matrycy mRNA (w wyniku odwrotnej transkrypcji) i wprowadzony do wektora. Pozwalają one skutecznie klonować sekwencje genów, mimo iż uzyskuje się tylko region kodujący genu bez innych sekwencji genu i jego obszarów regulatorowych.

Przygotowując bibliotekę genową ważne jest oszacowanie materiału wyjściowego, tzn. czy zawiera wszystkie oryginalne sekwencje i czy jest biblioteką reprezentatywną. Może nią nie być, gdy niektóre sekwencje nie klonują się w całości (np. sekwencje powtarzające się bez miejsc restrykcyjnych). Biblioteki cDNA, które są wzbogacone w pewne sekwencje mogą być reprezentatywne w stosunku do wyjściowego wzbogaconego materiału mRNA. Wydajność klonowania oblicza się z liczby N, rekombinantów (kolonii), które powinny się znajdować w bibliotece genowej używając następującego wzoru:

Gdzie :

P - oczekiwane prawdopodobieństwo

f - stosunek wielkości genu do całego genomu

 

Jeśli klonujemy fragment DNA o wielkości około 20 kilo par zasad (kpz) genomu E. coli (4,6 x 10⁶ pz) lub człowieka (3 x 10⁹ pz) to prawdopodobieństwo otrzymania każdego fragmentu równe 0,99 w tworzonej bibliotece wchodzącej w skład tych genomów uzyskamy gdy biblioteki będą zawierały:

Powyższe wyliczenia wskazują na konieczność przygotowania kilku tys. rekombinantów zawierających insert o wielkości 5-10 kpz aby biblioteka była dobra.

Im większa jest wielkość klonowanych insertów, tym biblioteka może zawierać mniej rekombinantów. Do konstrukcji bibliotek genomowych często stosowany jako wektor jest fag λ (cechuje go dobra wydajność klonowania i pakowania) (Ryc. 4).

W celu przygotowania biblioteki genomowej, genomowy DNA musi być oczyszczony, a następnie porozcinany losowo na fragmenty o wielkości odpowiedniej do klonowania w danym wektorze. Oczyszczanie genomowego DNA eukariotów przeprowadza się poprzez przygotowanie jąder komórkowych (oddzielenie od DNA mitochondrialnego i chloroplastowego), usuwanie białka, lipidów i innych makrocząsteczek. Stosuje się tu trawienie proteazą i ekstrakcję fazową (fenol - chloroform). Tak przygotowany genomowy DNA składa się z fragmentów o długości kilkuset kpz pochodzących z chromosomów.

Fragmentowanie tego DNA można osiągnąć poprzez mechaniczne rozrywanie lub trawienie enzymem restrykcyjnym. W pierwszym przypadku podczas pipetowania uzyskuje się małe fragmenty DNA, które są rozrywane w poprzek obu nici DNA z licznymi tępymi końcami.

Zastosowanie enzymów restrykcyjnych do trawienia genomowego DNA prowadzi do uzyskania mniej przypadkowych fragmentów. Aby uzyskać fragmenty o wielkości 15-25 kpz stosuje się częściowe trawienie. Polega ono na ograniczeniu ilości enzymu restrykcyjnego, a DNA jest rozcinany nie w każdym miejscu restrykcyjnym. Otrzymuje się w ten sposób dłuższe fragmenty. Najczęściej stosowanym enzymem jest Sau 3A (sekwencja 5' - /GATC - 3' - oznacza miejsce rozszczepienia) w efekcie tworzą się lepkie końce kompatybilne z końcami wektora rozciętego enzymem Bam HI (5' - G/GATCC - 3'). Fragmenty o właściwych rozmiarach są dalej oczyszczane metodą elektroforezy w żelach agarozowych lub wirowania w gradiencie sacharozy.

Wektorami najczęściej stosowanymi do klonowania genów są wektory λ EMBL 3, DASH. Do rozciętego DNA faga λ (po trawieniu restryktazami) zostaje wbudowany fragment genomowego DNA. Końce DNA z oryginalnych wektorów oczyszcza się do centralnego (zbędnego) fragmentu na drodze wirowania w gradientach gęstości chlorku cezu. Następnie genomowy DNA jest łączony z wektorem za pomocą T4 DNA ligazy, a zrekombinowane cząsteczki są gotowe do pakowania, namnażania i utworzenia biblioteki. Aby wbudować fragmenty DNA do wektorów np. plazmidowych potrzebne są endonukleazy restrykcyjne odkryte i zastosowane w latach 60-tych. Restryktazy takie jak: EcoRI są dimerami i rozpoznają tylko palindromową sekwencję, czyli identyczną na obu niciach 5' 3', jest nią 6 par zasad, GAATTC. Po trawieniu powstają 2 dwuniciowe fragmenty z wolnymi końcami 5' z grupą fosforanową i 3' z grupą hydroksylową (oba końce są identyczne w obu fragmentach). Sekwencja 6 par zasad występuje średnio, co 4⁶ = 4096 pz w DNA o przypadkowej sekwencji. Ten długi odcinek DNA jest trawiony z częstością około ¼ kpz. Dostępne w handlu enzymy restrykcyjne rozpoznają na ogół sekwencje o długości od 4 - 8 par zasad. Końce powstające po trawieniu są często lepkimi, czyli kohezyjnymi i mogą hybrydyzować z końcami wystającymi w innych cząsteczkach DNA. Każdy, więc fragment uzyskany po trawieniu EcoRI może być kowalencyjnie przyłączony w reakcji ligacji do każdego innego fragmentu DNA. Wszystkie enzymy restrykcyjne wymagają do aktywności obecności Mg²⁺ (10 mM), temperatury 37˚C i buforu o określonym pH. Produkt trawienia (około mikrogram DNA) jest następnie analizowany elektroforetycznie w żelu agarozowym. Po inkubacji DNA z enzymem i buforem, do próby dodawany jest barwnik i próbka nanoszona jest na żel agarozowy. Żel umieszczony zostaje w polu prądu stałego w buforze przewodzącym. Fragmenty DNA migrują w żelu od elektrody ujemnej do dodatniej z szybkością zależną od ich wielkości i kształtu. Elektroforeza pozwala rozdzielić mieszaninę fragmentów DNA o różnej wielkości. Próbki DNA zmieszane z barwnikiem, bromkiem etydyny, są umieszczane w kieszonkach (studzienkach) formowanych z żelu. Bromek etydyny barwi DNA podczas migracji, co umożliwia śledzenie przebiegu elektroforezy w świetle UV.

Plazmidowy DNA, aby mógł być użyty do klonowania musi być oczyszczony z chromosomowego DNA. Najczęściej stosuje się metodę lizy alkalicznej. Po fazie wzrostu komórki bakteryjne wiruje się i osadza w buforze, który zawiera lizozym (niszczy ścianę komórkową). W celu zniszczenia błony komórkowej i białek dodaje się dodecylosiarczan sodu (SDS) w roztworze wodorotlenku sodu. W tych warunkach zachodzi także hydroliza RNA. Po zobojętnieniu roztworu stężonym roztworem octanu sodu (pH 5) wytrąca się chromosomowy DNA wraz ze zdenaturowanymi białkami. Aby uzyskać plazmidowy DNA, próbę należy ponownie odwirować. W supernatancie (lizacie) oprócz plazmidowego DNA znajdują się także RNA i resztki białek. Po tym etapie następuje właściwe oczyszczanie palzmidowego DNA z lizatu bakteryjnego. Najczęściej przeprowadza się ekstrakcję lizatu fenolem lub mieszaniną fenol-chloroform. Fenol powoduje denaturację białek, które tworzą osad na granicy faz fenolchloroform. DNA i RNA, które są w fazie wodnej zagęszczają się przez wytrącanie etanolem. Przy miniizolacji etanol dodaje się bezpośrednio do lizatu poddanego wcześniej ekstrakcji fenolowej, a osad rozpuszcza się w wodzie lub w roztworze Tris-EDTA, gdy DNA ma być przechowywany. Roztwór ten chelatuje jony Mg²⁺, chroniąc DNA przed nukleazami i autodegradacją. Można też dodać rybonukleazę A, która nie naryszając DNA, trawi resztki RNA. Plazmidowy DNA można również oczyścić wirowaniem w gradiencie gęstości chlorku cezu (CsCl).

  3)      Wektory

Jednym z pierwszych wektorów plazmidowych był pBR 322 (ryc. 2) z dwoma genami oporności na antybiotyki ampicylinę i tetracyklinę. Podczas klonowania obcy DNA zostaje wprowadzony w miejsce genu oporności na tetracyklinę powodując jego rozerwanie i brak wrażliwości na tetracyklinę. Bakterie zawierające plazmid bez obcego DNA, którego końce uległy ligacji można zidentyfikować, bo są oporne na 2 antybiotyki. Po wektorze pBR322 pojawiły się wektory z serii pUC. Obecny w plazmidzie gen lacZ, kodujący enzym β-galaktozydazę. Bakteria z niezmienialnym plazmidem syntetyzuje β-galaktozydazę kodowaną przez gen, zlokalizowany w miejscu, gdzie wprowadza się obcy DNA, która działa na syntetyczny substrat zwany X-gal przekształcając go w barwny produkt. Kolonie rosnące na szalkach z agarem zawierającym X-gal przybierają kolor niebieski. Natomiast po wprowadzeniu do plazmidu pUC obcego DNA gen lac Z zostaje uszkodzony i dlatego produkcja β-galaktozydazy jest niemożliwa. Kolonie zawierające zrekombinowany plazmid rosnące na pożywce z X-gal pozostają białe.

Wektory pUC posiadają także miejsce wielokrotnego klonowania MCS cechujące się serią miejsc restrykcyjnych utworzonych poprzez modyfikację sekwencji części genu lac Z. Umożliwia to wprowadzenie obcego DNA w różnych miejscach restrykcyjnych. Można także wprowadzić po każdej stronie MCS sekwencji promotorowych bakteriofagów. Pozwala to na transkrypcję wprowadzonego obcego DNA in vitro przez polimerazę RNA. Tę właściwość wykorzystuje się do produkcji sond RNA z klonowanych sekwencji DNA. Plazmidy, które poddano modyfikacji polegającej na translacji sklonowanych sekwencji nazywa się wektorami ekspresyjnymi.

Jeżeli wektorem użytym do klonowania jest plazmid, wtedy procedura klonowania jest następująca. Plazmid trawi się enzymem restrykcyjnym, który przecina go w jednym miejscu, co powoduje zamianę jego formy kolistej w liniową z lepkimi końcami. Obcy DNA, który będzie sklonowany, także poddaje się trawieniu takimi samymi enzymami restrykcyjnymi. Po połączeniu lepkich końców plazmidu i obcego DNA, powstają zrekombinowane koliste plazmidy. Ligaza DNA wiąże je kowalencyjnie. W procesie transformacji, zrekombinowany plazmid zostaje wprowadzany do komórki gospodarza np. bakterii. Transformowane bakterie wysiewa się na szalki z agarem w celu uzyskania kolonii bakteryjnych klonów, które mają ten sam genotyp. Klony przenosi się pojedynczo do płynnej pożywki i namnaża do fazy logarytmicznego wzrostu. Z otrzymanych hodowli izoluje się dość duże ilości plazmidu i klonowanego DNA do dalszych badań.

Dodatkowe modyfikacje plazmidów wprowadziły miejsca wielokrotnego klonowania, fagowe sekwencje promotorowe dla transkrypcji in vitro i ekspresji białek. Zrekombinowane plazmidy można łatwo odróżnić cząsteczek nie zrekombinowanych wektora, porównując po elektroforezie ich względne wielkości oraz długości produktów trawienia. Zrekombinowany plazmid jest większy od samego wektora. Metodą replik, potwierdzamy prawdopodobne rekombinaty uzyskane z hodowli. W drodze ich selekcji uzyskujemy klony, które zawierają plazmid z aktywnym genem oporności na antybiotyk (np. gen β-laktomazy - oporność na ampicylinę). Na pożywce z antybiotykiem wyrosną tylko te komórki bakteryjne, u których doszło do ekspresji tego genu. Możemy także określić wydajność transformacji jako liczbę kolonii powstałą na podłożu selekcyjnym na mikrogram wyjściowego DNA (wektor = plazmid) wynosi dla 10³ - 108 ug.

Inaczej postępujemy, gdy wektorem jest bakteriofag λ (Ryc.3). Środkowa część dwuniciowego, liniowego DNA o długości 20-23 kpz, wymieniana jest na obcy DNA. Zrekombinowany fagowy DNA jest dalej pakowany in vitro do białkowych kapsydów. Odtworzonymi cząstkami fagowymi infekuje się E. coli, które tworzą na płytkach agarowych tzw. łysinki na murawie czyli strefy braku wzrostu komórek spowodowane infekcją i cyklami lizy. Łysinki posiadające interesującą nas sekwencję można zidentyfikować przeszukując bibliotekę za pomocą sondy metodą „odcisku” tzn. do płytki przykłada się filtr nitrocelulozowy, do którego przyklejają się cząsteczki obecne na płytce. W ten sposób powstaje na filtrze replika łysinek. Przyczepiony DNA poddaje się alkalicznej denaturacji i hybrydyzuje ze znakowaną radioaktywnie lub fluorescencyjnie sondą DNA. Po przemyciu i usunięciu nie związanej sondy przykłada się do filtru kliszę fotograficzną. Po wywołaniu kliszy pojawiają się na niej czarne kropki wskazujące pozycję łysinek z poszukiwanymi sekwencjami DNA.

Lizogeniczną fazę wzrostu faga λ (integracja z genem gospodarza), można wykorzystać do wprowadzenia klonowanego fragmentu DNA do genomu E. coli w celu uzyskania jego długotrwałej ekspresji. Jako wektory w E. coli używane są też fagi pałeczkowate takie jak: M13 z jednoniciowym, kolistym DNA. Po infekcji bakterie syntetyzują komplementarną nić i fagowy DNA powiela się jako dwuniciowy kolisty DNA. Nie powoduje on lizy komórek, ale spowalnia ich wzrost. Jednoniciowy DNA ma zastosowanie do sekwencjonowania DNA i mutagenezy ukierunkowanej.

Kosmidy łączą cechy wektorów plazmidowego i fagowego (geny oporności na antybiotyki, sekwencje cos.) (Ryc. 4 b i 5). Znajdują się one na każdym końcu cząsteczki DNA i są odpowiedzialne za wprowadzenie jej do fagowego kapsydu. Sekwencja cos w kosmidach umożliwia pakowanie ich w kapsydach fagowych. Do klonowania przy użyciu kosmidów stosuje się te metody, które były już omówione dla plazmidu i faga λ. Kosmidy DNA również trawi się enzymem restrykcyjnym i liguje z obcym DNA (Ryc. 5). Zrekombinowane kosmidy pakuje się w kapsydy λ, którymi infekuje się E. coli. Kosmidy nie zawierają genów λ, nie tworzą wiec łysinek. Na pożywce agarowej z antybiotykiem będą, więc rosły kolonie ze zrekombinowanymi kosmidami. Zaletą kosmidów jest zdolność do przyjmowania dużych insertów. Kapsydy λ mogą przyjąć do 52 kpz., natomiast w kosmidach można klonować wstawki wielkości do 44 kpz.

Nowym typem wektora, w którym wykorzystuje się eukariotyczne komórki gospodarza, jest wektor YAC (sztuczny chromosom drożdżowy) (Ryc. 6). Zawiera on te cechy chromosomu, które są potrzebne do jego powielania w komórkach drożdży (początek replikacji, centromer, telomery). Mogą one przyjąć bardzo duże cząsteczki DNA o dł. kilkuset kpz. Indywidualne klony mogą nawet zawrzeć cały gen ssaka. Wektory te mają zastosowanie w konstruowaniu map części genomu ludzkiego poprzez identyfikację klonów zawierających sąsiadujące ze sobą regiony genomu. Podobne zastosowanie mają wektory BAC (sztuczny chromosom bakteryjny) i P1 (sztuczny chromosom).

Jeśli gospodarzem przyjmującym DNA są rośliny, wtedy wektorem jest plazmid Ti występujący w bakterii glebowej Agrobacterium tumefacieus (Ryc. 7). Bakterie po zaatakowaniu nim rośliny powodują pojawienie się guzowatej narośli. Podczas infekcji dochodzi do integracji plazmidu Ti z chromosomem DNA rośliny. Wektory oparte na plazmidzie Ti wykorzystuje się do wprowadzenia pożądanych genów do genomu roślinnego (np. geny oporności na choroby).

Biblioteki cDNA na ogół nie buduje się z prokariotycznego mRNA ze względu na jego niestabilność. Natomiast mRNA ekuariotyczny pozbawiony sekwencji niekodujących jest bardziej przydatny. cDNA reprezentują tylko transkrybowane części genomu. Preparaty mRNA z poszczególnych tkanek zwykle zawierają specyficzne sekwencje w większym stężeniu (mRNA globiny w erytrocytach). Wybór właściwej tkanki jako materiału wyjściowego decyduje o powodzeniu klonowania cDNA. U eukariota odcinek 3' jest na ogół poli A i może być związany z oligo (dT) i wykorzystany do uzyskania mRNA. Preparat RNA po ekstrakcji mieszaniną fenol-chloroform z poddanych lizie komórek przepuszcza się przez kolumnę z oligo (dT) - celulozą. Można też w innej metodzie izolować RNA, dodać oligo (dT) związanego z magnetycznymi kuleczkami bezpośrednio do lizatów komórkowych, mRNA jest wyciągu z mieszaniny silnym magnesem. Przed zastosowaniem mRNA do klonowania należy sprawdzić czy nie uległ on degradacji poprzez przeprowadzenie translacji mRNA in vitro lub stosując metodę elektorforezy żelowej. Do translacji mRNA in vitro używa się lizatów retikulocytów króliczych.W celu uzyskania DNA komplementarnego do badanego RNA do syntezy pierwszej nici DNA stosuje się odwrotną transkryptazę, która wydłuża starter oligo (dT) przez dodawanie deoksyrybonukleotydów do końca 3'. Wydajność etapu syntezy cDNA można na żelu określić poprzez częściowe znakowanie produktu reakcji np. dodanie jednego radioaktywnego dNTP.

Wydłużanie końca 3' pierwszej nici za pomocą terminalnej transferazy przyczynia się do syntezy nici cDNA o niemal pełnej długości. Homopolimerowy ogon reszt np. C na końcu 3' dwuniciowego hybrydu mRNA-cDNA powstanie, gdy do mieszaniny reakcyjnej doda się tylko jeden DTP, a mianowicie dCTP. Po zniszczeniu nici mRNA (hydroliza alkaliczna), do syntezy drugiej nici cDNA starterem będzie oligonukleotyd (OIG). Produktem tej reakcji jest 2 niciowy cDNA z końcem 3' pierwszej nici wystającym poza koniec 5' drugiej nici. Powstają, więc tępe końce, które stają na przeszkodzie we wprowadzeniu do wektora. Należy wtedy do cDNA dodać sekwencje tzw. Łącznikowe, linkery (w nadmiarze). By przyłączyć linkery, wystające końce 3' usuwamy nukleazą S1 lub nukleaza z fasoli mung by następnie zadziałać enzymem. Klenowa polimerazy DNA I z E. coli, która uzupełnia każdy brak nukleotydu w obecności dNTP.

Jeśli linkery zawierają miejsce restrykcyjne dla enzymu, to cDNA powinien być metylowany z użyciem EcoRT metylazy. Można już wówczas połączyć linkery z tępo zakończonym dwuniciowym cDNA przy pomocy ligazy T4 DNA. Do końca 5' ufosforylowanego cDNA dołącza się 1 linker, jeśli jego koniec nie jest ufosforylowany. Po uzyskaniu lepkich końców (np. trawieniem enzymem EcoRI) końce cDNA są gotowe do ligacji z wektorem. Aby uniknąć metylacji cDNA można użyć cząsteczek adaptorowych, które mają już przygotowane lepkie końce.

Do klonowania cDNA odpowiedni jest każdy wektor z miejscem Eco RI. Najczęściej są to wektory plazmidowe. Jednak aby uzyskać większą liczbę klonów lub konstruować biblioteki cDNA stosuje się wektory faga λ. Wektor fagowy λ gt11 służy do konstrukcji bibliotek wykorzystywanych do ekspresji genów.

Identyfikacja określonego klonu z interesującym nas genem w bibliotece genowej polega na przeszukiwaniu. Do tego celu można wykorzystać fragment cDNA lub sondę kwasu nukleinowego (o podobnej sekwencji) pod warunkiem znajomości genu lub jego produktu. Znając sens kodonów, można przygotować mieszaninę wszystkich możliwych sekwencji DNA, które mogły kodować część sekwencji znanego produktu białkowego. Sondę stanowi odpowiednio zaprojektowany i zsyntetyzowany metodą automatycznej chemicznej syntezy oligonukleotyd, który ujawnia obecność komplementarnej sekwencji przez hybrydyzację. Klon zawierający szukany gen wykrywa się także przeciwciałami specyficznymi w stosunku do białka powstałego w wyniku jego ekspresji. Biblioteki cDNA są odbiciem najczęściej ekspresji białek funkcjonalnych. Po hybrydyzacji i przemyciu określa się lokalizację sondy znakowanej autoradiograficznie. Procedurę należy powtórzyć aż do otrzymania pojedynczych klonów. Klony cDNA można hybrydyzować z preparatami mRNA, aby zapobiec translacji niektórych rodzajów RNA. Jeżeli pożądany gen leży w pobliżu uprzednio, sklonowanego genu umożliwia to klonowanie poprzez wielokrotnie powtarzaną izolację z biblioteki przyległych genomowych klonów o pokrywających się częściowo sekwencjach. Jest to tak zwana wędrówka po chromosomie. Izolując genomowe klony o częściowo pokrywającej się sekwencji przygotowuje się sondę zawierającą sekwencje 2 wstawek. W tym celu sklonowany DNA rozcina się enzymami restrykcyjnymi. Uzyskane fragmenty rozdziela się elektroforetycznie w żelu agarozowym i po przeniesieniu na nitrocelulozę wykonuje się hybrydyzację z odpowiednią sondą. Charakterystyka badanego klonu polega na określeniu takich właściwości zrekombinowanej cząsteczki DNA jak: jej wielkości, mapa miejsc restrykcyjnych (miejsca rozcinania obecność genów oraz sekwencji nukleotydów. Wielkość liniowych cząsteczek określa się elektroforetycznie w żelu agarozowym z tzw. markerem długości (fragment DNA o znanej liczbie par zasad). W celu określenia wielkości klonowanej wstawki w klonie plazmidowym lub fagowym, trawi się DNA enzymem restrykcyjnym, który oddziela insert od sekwencji wektora. Dane o orientacji insertu w stosunku do wektora można uzyskać poprzez trawienie różnymi kombinacjami enzymów restrykcyjnych. Fragmenty DNA znakowane na końcach i poddane częściowemu trawieniu enzymami restrykcyjnymi można uszeregować według wielkości powstałych fragmentów. W dwuniciowym DNA znakowaniu można poddać tylko jedną nić. Znakuje się ją izotopem radioaktywnym lub za pomocą biotynylowanego dUTP (wykrywa się używając przeciwciał). Cząsteczki DNA i RNA można znakować na końcach 5' używając kinazy polinukleotydowej lub terminalnej transferazy. Natomiast do równomiernego znakowania całej nici stosuje się polimerazę DNA i znakowane nukleotydy.

Kwasy rozdzielone w żelach przenosi się na filtry nitrocelulozowe, wiąże z nimi i hybrydyzuje ze znakowaną sondą. Sondę, która nie uległa hybrydyzacji, usuwa się za pomocą przemywania a filtr po obróbce uwidacznia na filmie rentgenowskim powstałe prążki. W metodzie zwanej Northen wykrywa się określone rodzaje RNA i ich wielkości, a w metodzie zwanej Southern, wykrywa się DNA komplementarny do użytej sondy.. Metoda ta dostarcza informacji o wielkości fragmentu oraz o liczbie kopii badanych sekwencji zawartych w genomie.

  4)   Sekwencjonowanie DNA

Metodą wyjściową dla większości analiz molekularnych jest opracowana pod koniec lat 80-tych metoda PCR - reakcja łańcuchowej polimeryzacji (Mullis w 1993 r. nagroda Nobla). Metoda PCR umożliwia amplifikację in vitro wybranych odcinków DNA i RNA przepisanych na cDNA. Polega ona na wykonaniu 25 do 30 cykli obejmujących termiczną denaturację , wiązanie starterów i syntezę nowej nici DNA z zastosowaniem termostabilnej polimerazy (Ryc. 9). Mieszanina reakcyjna zawiera matrycę DNA lub RNA, 2 startery komplementarne do obu nici matrycy, (są nimi krótkie jednoniciowe ok. 20 nukleotydowe DNA), 4 dNTP będące substratmi reakcji, polimerazę termostabilną, kationy Mg²⁺ w odpowiednim buforze. Metoda ta odzwierciedla naturalny proces replikacji DNA, bo dochodzi w niej do syntezy komplementarnych nici DNA. W każdym cyklu podwaja się liczba matryc z poprzedniego cyklu. np. po 30 cyklach liczba matryc wyniesie 2³⁰ = 107374824 (Ryc. 9). Ten wykładniczy przyrost ilości produktu stanowi najważniejszą zaletę metody PCR.

Materiałem wyjściowym do namnażania jest izolowany DNA komórek, np.: krwi, plemników, włosów, a także może on pochodzić z wykopalisk. Reakcja przebiega w urządzeniach zwanych termocyklery. Kolejne etapy reakcji przedstawia rycina 9. Denaturacja odbywa się w temperaturze 90-95^oC przez 30-60 sek. (następuje rozdzielenie nici helisy). Następnie w temperaturze 40-60^oC przez 60-120 sek dochodzi do przyłączenia starterów do jednoniciowej matrycy DNA, poczym następuje wydłużanie nici w temperaturze 72^oC, w której polimeraza DNA wykazuje największą aktywność. Każda skopiowana cząsteczka DNA staje się matrycą do syntezy nowej nici w następnym cyklu.

Metoda PCR znajduje szerokie zastosowanie w badaniach diagnostycznych, takich jak:

1. wykrywanie patogenów infekcyjnych (bakterie, wirusy, pasożyty)

2. wykrywanie zmian w genomowym DNA w chorobach dziedzicznych, predyspozycji do chorób nowotworowych, monitorowania i wykrywania nowotworów

3. wykrywanie polimorficznych sekwencji DNA

4. genotypowanie zgodności tkankowej pomiędzy dawcą i biorcą przy przeszczepach, w antropologii, medycynie sądowej

5. zastosowanie w biotechnologii - w produkcji rekombinowanych białek (insulina, STH), szczepionek (WZW typ B)

Produkt PCR nadaje się już do sekwencjonowania. Opracowano dwie metody sekwencjonowania; chemiczną i enzymatyczną (Ryc. 10). Założeniem obydwóch metod jest otrzymanie cząsteczek o różnej długości z jednym typowym końcem. Cząsteczki takie są rozdzielane elektroforetycznie w żelu poliakrylamidowym (PAGE) w celu odczytania sekwencji badanego DNA, przez identyfikację nukleotydu na końcu nieznanym.

W metodzie chemicznej z 1977 roku (Maxona - Gilberta) fragment DNA poddawany sekwencjonowaniu znakuje się na jednym końcu albo poprzez przyłączenie radioaktywnego fosforanu do końca 5' lub 3' albo dodanie radioaktywnego nukleotydu do końca 3'. W dwóch etapach zrywa się DNA w miejscach występowania określonych zasad. Do modyfikacji puryn stosuje się piperdynę, siarczan dimetylu i kwas mrówkowy, a przy zasadach pirymidynowych stosuje się hydrazynę. W efekcie wytwarza się „drabinka” coraz to dłuższych cząsteczek. Metodę tę stosuje się do jedno- i dwuniciowego DNA, a także zaadaptowano ją do sekwencjonowania genomowego DNA bez klonowania.

Metoda ta została w 1997 r. wyparta przez metodę terminacji łańcucha zwaną metodą dideoksy Sangera (Ryc. 10). Metoda dideoksy Sangera lub enzymatycznej syntezy polega na enzymatycznej replikacji zdenaturowanej, jednoniciowej matrycy, rozpoczynającej się od 1 startera a kończącej się wbudowaniem dideoksynukleotydu do nowopowstałego łańcucha DNA. Reakcję prowadzi się w czterech oddzielnych probówkach A, C, G, T. Każda z nich zawiera tę samą matrycę, starter, mieszaninę 4 trójfosforanów deoksynukleozydów, odpowiedni bufor, polimerazę DNA oraz jeden z ddNTP. Zdenaturowane produkty rozdziela się elektroforetycznie w 4 oddzielnych ścieżkach 6-8% żelu poliakrylamidowego, zawierającego 7 M mocznik w temp. 55-70ႰC. Do mieszaniny reakcyjnej dodawany jest nukleotyd znakowany w pozycji ၡ radioizotopem lub wyznakowany starter na końcu 5'. Terminacja syntezy zachodzi po wbudowaniu do nici ddNTP. Produkty terminacji rozdzielone w żelu pojawiają się jako prążki o różnych długościach („drabinka”) Można je uwidocznić na kliszy rentgenowskiej po autoradiografii żelu. Prążek, który przesunął się najdalej odpowiada najmniejszemu fragmentowi DNA otrzymanemu przez wbudowanie ddNTP naprzeciwko pierwszej zasady matrycy. Prążki są odczytywane aż do obszaru, gdzie nie uległy one rozdzieleniu według zasady od najmniejszego do największego i przypisanie każdemu z nich odpowiedniej zasady zgodnie ze ścieżką, do której należy dany prążek.

Matryca czyli DNA musi być otrzymany w czystej postaci i musi być homogenny. Obecnie jednoniciowy DNA jest wytwarzany bez klonowania w E. coli. Do sekwencjonowania używa się kilku różnych polimeraz DNA. Są to: fragment DNA polimerazy I z E. coli znany jako fragment Klenowa, modyfikowana genetycznie polimeraza z faga T7 - sekwenaza i polimeraza DNA Tag. Wszystkie polimerazy wymagają krótkiego fragmentu dwuniciowego DNA by rozpocząć syntezę DNA na jednoniciowej matrycy. Fragment taki w reakcji sekwencjonowania powstaje przez przyłączenie startera z komplementarnym odcinkiem jednoniciowych cząsteczek matrycy.

Opracowano także technikę automatycznego sekwencjonowania DNA, w której wykrywanie i analiza produktów reakcji sekwencjonowania są kontrolowane przez program komputerowy. Cztery ddNTP są znakowane kowalencyjnie przyłączonymi barwnikami o emisji światła wzbudzonego (fluorescencji) różnej długości fal. Reakcję przeprowadza się, więc w jednej mieszaninie. Uzyskane produkty tworzą serię cząsteczek DNA, które różnią się od siebie długością o jeden nukleotyd i znakowane są różnymi fluoresceinami. Produkty są rozdzielane elektroforetycznie i wykrywane po wzbudzeniu fluorescencji przez laser. Na podstawie długości fali emitowanej fluorescencji detektor identyfikuje barwnik, a przez to wyznakowaną nim zasadę, wbudowaną na końcu każdej cząsteczki DNA. Można, więc zapisać kolejność zasad przechodzących przez detektor. Metoda ta przewyższa pozostałe krótszym czasem sekwencjonowania i mniejszą liczbą błędów.

Ostatnio stosowane są częściej wydajniejsze metody sekwencjonowania - pirosekwencjonowanie oraz metoda mikromacierzy DNA (mikro-chipów DNA).

Poznane sekwencje są zwykle analizowane za pomocą komputerów i pakietów oprogramowań np. pakiet GCG Univ. Wisconsin lub programów PC jak DNA Star (Lasergene). Programy umożliwiają szybką identyfikację ważnych cech sekwencji takich jak: miejsca restrykcyjne, otwarte ramki odczytu, kodony start i stop, miejsca promotorowe, połączenia intron-egzon. W ostatnich latach liczba danych sekwencji DNA wzrosła gwałtownie. Zorganizowano, więc bazy danych, w Europie EMBL, a w USA GENBANK. Bazy te zawierają zbiory sekwencji genów człowieka i innych gatunków oznaczone przez naukowców w pracowniach genetycznych na całym świecie. Informacje te są dostępne poprzez internet i mogą być wykorzystywane do prowadzenia analiz genetycznych. Można dzięki nim porównać otrzymane sekwencje z istniejącymi w danej bazie danych celem określenia podobieństwa. Opracowaniem i zastosowaniem komputerowych programów do analizy danych biologicznych zajmuje się bioinformatyka.

Od 1990 r. realizowany jest projekt rządowy USA HUGO mapowania ludzkiego genomu (3x10⁹pz), którego celem jest identyfikacja i określenie rozmieszczenia ludzkich genów poprzez sekwencjonowanie. Jest on koordynowany przez Departament Energii i Narodowy Instytut Zdrowia. Współpracuje z nimi także Centrum Sangera w Cambridge i inne instytuty naukowe na całym świecie. W 2000 r. łączna długość zdeponowanych danych w GenBank sekwencji o wysokiej jakości i „surowych sekwencji” ludzkiego genomu wynosiła 563606 kpz + 2104257 kpz. Najlepiej bo w 96% poznana jest sekwencja nukleotydowa chromosomu 22 (1,6 - 1,8 % genomowego DNA). Około 35 chorób kojarzy się z mutacjami genów zlokalizowanych w tym chromosomie.

W 2001 roku dwie organizacje - publiczny projekt HUGO i prywatna korporacja CELERA - ogłosiły kompletną sekwencję ludzkiego genomu i wyniki sekwencjonowania opublikowano w czasopismach naukowych Science i Nature oraz zdeponowano w bazach danych GENBANK i EMBL.

9

---