Dowody na teorię chemiosmotyczną:

1. Pomiary gradientu pH, który powstaje podczas transportu elektronów na O₂ (różnica potencjałów do 0.3V; energetyzacja błony)

2. Substancje protonoforowe - są truciznami; nie wpływając na funkcjonowanie łańcucha oddechowego, powodują tzw. rozprężenie fosforylacji oksydacyjnej: utlenianiu substratów organicznych, a następnie transportowi elektronów w łańcuchu oddechowym nie towarzyszy synteza ATP.

1. 2,4-dinitrofenol

• Fenole są kwasami, więc może występować w postaci anionu.

• Ze względu na elektrossący charakter tego układu pierścieniowego i grup nitrowych występuje delokalizacja ładunku elektrycznego: ładunek ujemny, który powinien występować na atomie O, jest rozproszony w całej cząsteczce.

• W pH fizjologicznym forma niezdysocjowana i zdysocjowana są w pewnej równowadze.

• (W obu formach) jest rozpuszczalny w tłuszczach, zatem bardzo łatwo wbudowuje się w dwuwarstwę lipidową błon biologicznych i może się w niej przemieszczać

• Z tej strony błony, gdzie jest nadmiar H⁺ istnieje tendencja do powstawania formy uprotonowanej, która może migrować w błonie i po stronie, gdzie istnieje niedobór H⁺, oddawać ten H+ ⇒ błona staje się przepuszczalna dla H⁺ ⇒ nie powstaje gradient protonowy ⇒ nie może następować synteza ATP.

2. niektóre antybiotyki, np. walinomycyna - powodują niedobór energii w komórce i jej śmierć

3. Eksperymenty z rekonstytucją F₀F₁-ATP-azy (syntazy ATP)

Białko to można izolować. Jednak in vitro enzym ten hydrolizuje ATP, a nie syntetyzuje je, jak to się dzieje in vivo!

1. 
   Sporządzamy mieszaninę np. fosfatydylocholiny z cholesterolem i wytrząsamy (np. ręcznie lub ultradźwiękami) ⇒ spontanicznie powstaje dwuwarstwa lipidowa w postaci zamkniętych pęcherzyków, czyli liposomów (struktur lipidowych naśladujących budową błonę biologicznej).

2. W trakcie ich powstawania dodajemy białka zdolne do wbudowywania się w błony (np. F₀F₁-ATP-azę) ⇒ tworzą się proteoliposomy (liposomy z wbudowanymi białkami).

3. Zamiast czystej wody używamy roztworu zawierającego ADP i P_i ⇒ część tych substancji zostaje zamknięta we wnętrzu pęcherzyka; łagodnym wirowaniem wydzielamy liposomy z roztworu (ponieważ pozostała w nim reszta ADP i P_i) i umieszczamy je w czystym roztworze.

4. Wytwarzamy gradient protonowy, np. dodając kilka kropli rozcieńczonego HCl → na zewnątrz powstaje wysokie stężenie H⁺ ⇒ jeżeli w błonę wbudowana jest F₀F₁-ATP-aza, to następuje synteza ATP. Struktura i działanie F₀F₁-ATP-azy (syntazy ATP)

Struktura F₀F₁-ATP-azy (syntazy ATP)

F₀

- jest wbudowana w błonę

- tworzy kanał protonowy

- zbudowana jest z 3 rodzajów peptydów: a, 2 x b, c

- kanał protonowy tworzy polipeptyd c, wielokrotnie penetrujący błonę wewnętrznej błony mitochondrialnej

- białka a i b pełnią funkcję pomocniczą, kotwiczą jednostkę w błonie, a jednocześnie wystają z błony, mając kontakt z F₁

F₁

- sterczy do matriks mitochondrialnej

- zbudowana z polipeptydów: α x 3, β x 3, γ, δ i ε

- szczególnie istotną funkcję pełni polipeptyd γ oraz polipeptydy α i β

- polipeptydy α i β tworzą 3 dimery, które stanowią właściwe miejsce katalizy syntezy ATP

Działanie F₀F₁-ATP-azy (syntazy ATP)

1997 r. prof. Paul D. Boyer, dr. John E. Walker - Nagroda Nobla w dziedzinie chemii za odkrycie mechanizmu enzymatycznego syntezy ATP

Figure 2
Boyer's "Binding Change Mechanism"
The picture shows the cylinder with alternating alpha and beta subunits at four different stages of ATP synthesis. The asymmetrical gamma subunit that causes changes in the structure of the beta subunits can be seen in the centre. The structures are termed open beta_O (light grey sector), loose beta_L (grey sector) and tight beta_T (black sector). At stage A we see an already-fully-formed ATP molecule bound to beta_T. In the step to stage B beta_L binds ADP and inorganic phosphate (P_i ). At the next stage, C, we see how the gamma subunit has twisted due to the flow of hydrogen ions (see Figure 1). This brings about changes in the structure of the three beta subunits. The tight beta subunit now becomes open and the bound ATP molecule is released. The loose beta subunit becomes tight and the open becomes loose. In the last stage the chemical reaction takes place in which phosphate ions react with the ADP molecule to form a new ATP molecule. We are back at the first stage.

Figure 18.32. Binding-Change Mechanism for ATP Synthase. The rotation of the γ subunit interconverts the three β subunits. The subunit in the T (tight) form, which contains newly synthesized ATP that cannot be released, is converted into the O (open) form. In this form, it can release ATP and then bind ADP and P_i to begin a new cycle.

O, L, i T są to dimery zbudowane z polipeptydów α i β części F₀. Każdy z nich może występować w różnych stanach konformacyjnych: otwartym (open), rozluźnionym (loose) i ścisłym/zwięzłym (tight). W danym momencie każda z tych jednostek ma inną konformację. H⁺ płynąc przez kanał wywołują cykliczne zmiany konformacyjne jednostki γ, które powodują kolejne przejścia poszczególnych dimerów poprzez ten cykl zmian konformacji. W konformacji otwartej miejsce przyłączania ADP i P_i jest otwarte i substraty te mogą łatwo przyłączyć się do centrum aktywnego. Potem następuje przejście w konformację luźną, w której ADP i P_i są zbliżane do siebie, a w fazie ścisłej poprzez jeszcze większe ich zbliżenie wymuszona zostaje synteza ATP, a powstała cząsteczka H₂O i ATP zostaje wypchnięta na zewnątrz. Następuje natychmiastowe przejście do konformacji otwartej i cykl rozpoczyna się od nowa.

Transport do i z mitochondriów

U eukariotów powstające w mitochondriach ATP musi być transportowane do cytoplazmy. Wewnętrzna błona mitochondrialna jest nieprzepuszczalna dla ATP. Znajduje się w niej specjalny przenośnik, który transportuje ATP na zewnątrz, a ADP do środka (symport). Transport ten nie wymaga nakładu energii.

P_i potrzebny do syntezy ATP są transportowane razem z H⁺. Jest to wtórny transport aktywny: cząsteczki P_i wciągane są na koszt gradientu H⁺.

Zewnętrzna błona mitochondrialna nie stanowi przeszkody dla związków drobnocząsteczkowych (do ok. 1000Da), ponieważ znajdują się w niej poryny.

Procesy kataboliczne (por. wykład 1.)

Białka

Aminokwasy

Złożone cukrowce

Cukry proste
(lub 1-fosforany cukrów prostych)

pirogronian

acetylo CoA

Lipidy
(triacyloglicerole)

Glicerol, kwasy tłuszczowe

NH₄⁺

O₂ H₂O

Wyróżnić tu możemy 3 fazy (na rysunku oddzielone liniami poziomymi). Faza I (lityczna) nie dostarcza energii użytecznej biologicznie, a jedynie ciepło. Faza II i III dostarczają już znacznych ilości energii (3 cz. NADH i 1 cz. FADH₂).

Degradacja złożonych cukrowców

1. Hydroliza wiązań glikozydowych (przeprowadzana przez glikozydazy):

maltoza 2 x glukoza

α-glikozydaza ΔG₀^'=-21 kJ/mol

Ilość energii uzyskiwana w tej reakcji jest zbyt mała, aby jej kosztem mogło powstać wiązanie wysokoenergetyczne. Energia ta jest rozpraszana w postaci ciepła.

Reakcja nieodwracalna, ponieważ:

1. ΔG₀^' jest silnie ujemna;

2. Jednym z substratów jest H₂O, więc aby odwrócić reakcję należałoby - zgodnie z regułą przekory - wyeliminować wodę, co w warunkach fizjologicznych (in vivo) jest niemożliwe! W procesach biotechnologicznych stosuje się glikozydazy z mikroorganizmów do syntezy wiązań glikozydowych in vitro w warunkach bezwodnych (w środowisku rozpuszczalnika organicznego).

2. Fosforyliza wiązań glikozydowych (fosforylazy):

maltoza 2 x glukozo-1-fosforan

fosforylaza ΔG₀^'=+3,6 kJ/mol

ΔG₀^' jest dodatnia i niewielka ⇒ Reakcja łatwo odwracalna.

Różnica w ΔG₀^' obu reakcji (A i B) wynika z tego, że w fosforylizie (B) powstaje wysokoenergetyczne wiązanie fosfodiestrowe.

Hydrolityczna degradacja glikogenu / amylopektyny

Glikozydazy - enzymy katalizujące hydrolizę wiązań glikozydowych; dzieli się je na endo- i egzoglikozydazy

• α-amylaza (endoglikozydaza) - hydrolizuje losowo wiązania wewnętrzne α(1→4)

• β-amylaza (egzoglikozydaza) - odszczepia reszty maltozy (disacharydowe) od końców nieredukujących

• α(1→6)glukozydaza (endoglikozydaza) - znosi rozgałęzienia

• maltaza - rozszczepia maltozę na dwie cząsteczki glukozy
  

Glikoliza

glukoza + 2 NAD⁺ + 2 P_i + 2 ADP → 2 pirogronian + 2 NADH + 2 H ⁺ + 2 ATP + H₂O

(trójwęglowy α-ketokwas)

kinazy = enzymy przenoszące reszty fosforanowe z ATP na inne związki

izomerazy = enzymy zmieniające izomerię cząsteczek

AKTYWACJA GLUKOZY

Uwaga: tautomeria keto-enolowa (odnosi się do przemiany fruktozo-1,6-bisfosforanu w fosfodihydroksyaceton i aldehyd fosfodiestrowy)

....

Bilans energetyczny glikolizy (na 1 cz. glukozy)

-2 ATP + 2 ∗ 2 ATP = +2 ATP

a jeżeli z fosforano-1-glukozy: +3 ATP

Dalsze losy pirogronianiu

1. Przemiana w etanol

(np. drożdże w warunkach beztlenowych)

2. Przemiana w mleczan

(niektóre mikroorganizmy beztlenowe, mięsnie w warunkach niedoboru tlenu)

Dlaczego? W glikolizie na pewnym etapie powstaje NADG, które musi być utleniane, aby odzyskać NAD⁺.

3. Oksydacyjna dekarboksylacja (organizmy tlenowe)

U eukariotów proces ten ma miejsce w matriks mitochondrialnej. Pirogronian jest transportowany z cytoplazmy kosztem części gradientu protonowego na zasadzie symportu: zarówno pirogronian jak i H⁺ są transportowane w tym samym kierunku - do środka.

Bibliografia:

Prof. dr. hab. Wojciechowski Z. Biochemia. Wykład dla studentów II roku Wydziału Biologii UW. 19.10.2004

„The 1997 Nobel Prize in Chemistry”. The Royal Swedish Academy of Sciences. 15 Oct 1997. Nobelprize.org <http://nobelprize.org/chemistry/laureates/1997/press.html>

Berg J. M., Tymoczko J. L. and Stryer L. Biochemistry. New York: W. H. Freeman and Co. 2002. NCBI <http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?call=bv.View..ShowTOC&rid=stryer.TOC&depth=2>

BIOCHEMIA - wykład 3.

Strona 6 z 12

Strona 9 z 12

łańcuch oddechowy

CO₂

NADH, FADH₂

GTP

Cykl
Krebsa

NADH, FADH₂

CO₂

CoA

Oksydacyjna
dekarboksylacja

NADH

β-oksydacja KT

Glikoliza

ATP, NADH

a

w

o

l

o

h

o

k

l

a

a

z

a

n

e

g

o

r

d

y

h

e

D

a

w

o

n

a

i

n

o

r

g

o

r

i

p

a

z

a

n

y

s

k

o

b

r

a

k

e

D

H

H

H

O

C

3

H

C

+

D

A

N

+

H

/

H

D

A

N

H

O

C

3

H

C

2

O

C

+

H

O

O

C

O

C

3

H

C

a

w

o

n

a

z

c

e

l

m

a

z

a

n

y

s

k

o

b

r

a

k

e

D

O

O

C

H

H

O

C

3

H

C

+

D

A

N

+

H

/

H

D

A

N

O

O

C

O

C

3

H

C

W układzie pokarmowym

Fosforoliza daje większy zysk netto niż hydroliza - energia wiązania od razu jest wykorzystywana do utworzenia ATP.

Fosfoglukomutaza

Wewnątrz komórek

Glukozo-1-fosforan

---