związki wysokoenergetyczne	≠	związki bogate w energię
np. ATP		np. glukoza
		Energia w nich zawarta, żeby mogła być wykorzystana, musi zostać przekształcona w energię wiązań związków wysokoenergetycznych.

Najważniejszym związkiem wysokoenergetycznym jest ATP, który pełni centralną funkcję w metabolizmie związków wysokoenergetycznych. ATP i inne związki wysokoenergetyczne są powiązane metabolicznie, np.:

1)	kreatyna + ATP ⇔ fosfokreatyna + ADP

2)	3-fosfoglicerynian + ATP	glukoneogeneza →	1,3-bisfosfoglicerynian + ADP
					← glikoliza

UWAGA:

W pH fizjologicznym (pH=7) praktycznie wszystkie kwasy występują w postaci anionów, dlatego w biochemii mówimy np. o fosfoglicerynianie, a nie kwasie forsfoglicerynowym. Z kwasem mamy do czynienia tylko w butelce na stole laboratoryjnym.

Ładunek energetyczny komórki:

Z wzoru tego wynika, że wartość ładunku energetycznego komórki może wahać się od 0 (tylko AMP) do 1 (tylko ATP). Jednak w żywej komórce wartość ta nie może wynosić 0. W rzeczywistości wartość ładunku energetycznego komórki mieści się w granicach 0.80 - 0.95, co oznacza, że większość nukleotydofosforanów występuje w postaci ATP.

Źródła ATP w komórkach:

1. Fosforylacja substratowa: przeniesienie na ADP reszty fosforanowej z wysokoenergetycznego metabolitu komórkowego

Zachodzi praktycznie u wszystkich organizmów, u heterotrofów beztlenowych stanowi jedyne źródło ATP.

fosfocaolopirogonian + ADP ⇒ pirogronian + ATP 1,3-bisfosfoglicerynian + ADP ⇒ 3-fosfopirogronian + ATP

(reakcje glikolizy)

2. Fosforylacja oksydacyjna: synteza ATP z ADP i reszty fosforanowej związana z utlenianiem różnych zredukowanych metabolitów przy udziale tzw. łańcucha oddechowego i wykorzystaniem O₂ atmosferycznego jako końcowego akceptora elektronów.

U organizmów tlenowych stanowi główne źródło ATP.

3. Fotofosforylacja: synteza ATP z ADP i reszty fosforanowej zachodząca na koszt energii świetlnej przy udziale tzw. fotosyntetycznego łańcucha transportu elektronów

Charakterystyczna dla fotoautotrofów na świetle. (Rośliny wyższe na świetle uzyskują ATP na drodze fotofosforylacji, a w ciemności na drodze fosforylacji substratowej lub oksydacyjnej.)

4. Fosforylacja związana z utlenianiem prostych substancji nieorganicznych

Występuje u mikroorganizmów zaliczanych do chemoautotrofów.

Najważniejszym źródłem ATP dla organizmów tlenowych, w tym człowieka, jest fosforylacja oksydacyjna związana z oddychaniem komórkowym.

ODDYCHANIE KOMÓRKOWE

1.	AH2 + ½ O2 ⇒ A + H2O + energia swobodna	utlenianie
2.	ADP + Pi + energia swobodna ⇒ ATP + H2O	fosforylacja oksydacyjna

Zredukowany organiczny metabolit komórkowy (AH₂) jest utleniany O₂ atmosferycznym, w wyniku czego powstaje utleniona forma tego metabolitu (A) oraz H₂O (z redukcji tlenu). Procesowi temu towarzyszy wyzwolenie znacznych ilości energii swobodnej, która jest następnie wykorzystywana w procesie fosforylacji oksydacyjnej do syntezy wiązań wysokoenergetycznych ATP. Z ADP i fosforu nieorganicznego (P_i) powstaje ATP i jeszcze jedna cząsteczka H₂O. (W sumie powstają 2 cząsteczki H₂O.)

Utlenianie / TRANSPORT ELEKTRONÓW NA O₂

Faza I

Utlenienie zredukowanego związku organicznego z przeniesieniem elektronów na NADH lub FADH₂ katalizowane przez dehydrogenazy.

U eukariotów w matriks mitochondrialnej oraz częściowo w cytoplazmie, u prokariotów w cytoplazmie. (Są to siedliska dehydrogenaz.)

a) Od zredukowanego związku organicznego (AH₂) zostają oderwane 2 e^- i 2 H⁺, w wyniku czego powstaje utleniona postać tego metabolitu oraz NADH, a jeden H⁺ zostaje uwolniony do środowiska. Reakcję tę katalizują dehydrogenazy zależne od NAD⁺.

	dehydrogenaza zależna od NAD+
AH2 + NAD^+	⇔	A + NADH + H^+

Mechaznizm:

Figure 14-9. Jak NADH oddaje elektrony. Na rysunku elektrony o wysokiej energii pokazano jako dwie czerwone kropki na atomie wodoru zaznaczonym kolorem żółtym. Jon wodorkowy (H:^-, atom wodoru i dodatkowy elektron) jest usuwany z NADH i zostaje przekształcony do protonu i dwóch elektronów o wysokiej energii: H:^-→H⁺ + 2e^-. Pokazano jedynie pierścień przenoszący elektrony w wiązaniu „wysokoenergetycznym”; całkowitą strukturę i przejście NADH można poznać patrząc na strukturę analogicznego NADPH. Elektrony są również w podobny sposób przenoszone przez FADH₂.

NADH jest potężnym reduktorem wykorzystywanym w biosyntezach. Przeprowadza reakcje typu:

Pochodną NADH obecną między innymi w szlaku pentozo-fosforanowym jest NADPH:

b) W reakcji katalizowanej przez dehydrogenazy zależne od FAD cząsteczka FAD przejmuje 2 e^- i 2 H⁺ ze zredukowanego związku organicznego, w wyniku czego powstaje zredukowana jego forma - FADH₂ oraz utleniona postać tego matabolitu.

	dehydrogenaza zależna od FAD
AH2 + FAD	⇔	A + FADH2

FAD = dinukleotyd flawinoadeninowy

FADH₂ w inny sposób niż NADH jest wykorzystywany do redukcji w biosyntezach:

Pochodną FAD występującą w układach z białkami (ze względu na możliwość pobierania od nich elektronów) jest FMN:

Faza II

Przeniesienie elektronów z NADH lub FADH₂ na O₂ przy udziale tzw. łańcucha oddechowego

U eukariotów w wewnętrzej błonie mitochondrialnej, u prokariotów w błonie komórkowej.

FUNKCJONOWANIE ŁAŃCUCHA ODDECHOWEGO

polega na szeregu kolejno następujących po sobie reakcji redoks (utleniania-redukcji).

BIOLOGICZNE REAKCJE REDOKS

A_utl + B_zred ⇔ A_zred + B_utl

Kiedy taka reakcja może zajść spontanicznie? Mówi o tym...

E⁰ = potencjał redoks - charakteryzuje zdolność danej substancji do ulegania utlenianiu/redukcji

E⁰ < 0 ⇒ substancja chętnie oddaje elektrony, utlenia się, jest reduktorem

E⁰ > 0 ⇒ substancja chętnie przyjmuje elektrony, redukuje się, jest utleniaczem

Reakcja może zajść spontanicznie, jeżeli reduktor ma niższy E⁰ niż utleniacz.

Funkcjonowanie łańcucha oddechowego polega na tym, że z cząsteczek NADH lub FADH₂ następuje przeniesienie elektronów na O₂ atmosferyczny. W tym przypadku utleniaczem jest O₂ (wysoki E⁰), a reduktorem NADH lub FADH₂ (ujemny E⁰).

W jaki sposób wyznaczyć E⁰? Zbudować ogniwo:

półogniwo badane	półogniwo wzorcowe
[Xzred] = [Xutl] = 1M	[H^+] = 1M (zrównoważone gazowym H2 pod ciśnieniem 1 atm.)
jeśli Xzred + H^+ ⇒ Xutl + ½ H2, to:
Xzred ⇒ Xutl + e^-	H^+ + e^- ⇒ ½ H2

E⁰ dla pary X_zred/X_utl = napięcie pomiędzy elektrodą badaną a elektrodą wzorcową (E⁰ = 0V)

E^0' = biologiczny potencjał redox (pH 7, 25°C)

E^0' dla elektrody wodorowej = -0.413V

E^0' dla NADH+H⁺/NAD⁺ = -0.32V

E^0' dla H₂O/½O₂+2H⁺ = +0.82V

Związek pomiędzy różnicą potencjałów redoks reagentów a zmianą wzorcowej energii swobodnej:

ΔG^0' = - n F ΔE^0'

F = stała Faradaya = 96.5 kJ x V^-1 x mol^-1

n = liczba moli elektronów na mol reagującej substancji

Np.: NADH + H^+ + ½ O2 ⇒ H2O + NAD^+
Jeśli oraz to więc	E^0' dla NADH+H^+/NAD^+ = -0.32V E^0' dla H2O/½O2+2H^+ = +0.82V ΔE^0= +0.82V - (-0.32V) = +1.14V ΔG^0' = -2 mol x mol^-1 x 96.5 kJ x V^-1x mol^-1 x 1.44 V = -220 kJ/mol

Utlenienie 1 mola NADH tlenem atmosferycznym prowadzi do uwolnienia energii -220 kJ/mol.

Gdybyśmy porównali to z ΔG^0' dla ATP, wyszłoby, że 1 NADH = 7 ATP, ale w rzeczywistości wydajność jest dużo mniejsza (wynosi ok. 40%) i NADH = 2.5 ATP.

STRUKTURA MITOCHONDRIALNEGO ŁAŃCUCHA ODDECHOWEGO

W łańcuchu oddechowym, zlokalizowanym u eukariotów w wewnętrznej błonie mitochondrialnej, występują 4 kompleksy enzymatyczno-białkowe, określane kolejnymi numerami (kompleks 1, 2, 3 i 4), które działają w określonej kolejności.

1. Reduktaza NADH/UQ

	H^+				2 H^+
	↓				↓
NADH	→	[FMN-B]	→	2 [FeS-B]	→	UQH2
			↓
			2 H^+

B = białko, FeS = żelazosiarczki, UQ = ubichinon = CoQ

NADH oddaje e-y na FMN-B, w wyniku czego powstaje FMNH₂-B. Ponieważ NADH dostarcza 1 H⁺, a do powstania FMNH₂ potrzebne są 2, 1 musi zostać pobrany ze środowiska. Z FMF e-y przekazywane są na FeS-B. Białko to przyjmuje tylko elektrony, dlatego 2 H⁺ są uwalniane do środowiska. Elektrony z tego białka przekazywane są na ubichinon, inaczej koenzym Q. Redukcja ubichinonu do ubihydrochinonu, czyli ubichinolu, wymaga oprócz 2 elektronów także przyłączenia 2 H⁺ pochodzących ze środowiska.

Ubichinon

2. Reduktaza FADH₂/UQ

			2 H^+
			↓
FADH2	→	[FeS-B]	→	UQH2
	↓
	2 H^+

3. Reduktaza cytochromowa

UQH2

→ ↓ 2 H^+

2 cyt b → 2 cyt c1 → 2 cyt c

Cytochromy - dosłownie: barwniki komórkowe; drobnocząsteczkowe białka, zawierające jako grupę prostetyczną układ hemowy z Fe, które może zmieniać wartościowość z 2+ na 3+ i odwrotnie.

Ponieważ układy hemowe mają charakter chromoforowy, białka te są barwne, pomarańczowo-czerwone, a że różne cytochromy mają nieco inne układy hemowe oraz część białkową, maja różne widma absorbcyjne i na tym opiera się ich podział.

Struktura hemowa (cyt c)

4. Oksydaza cytochromowa

2 cyt c → 2 cyt a → 2 cyt a3 → 2 [Cu-B]

2 H^+ ↓ →

½ O2

Cu może zmieniać stopień utlenienia z +1 na +2 i odwrotnie.

Aby powstała cząsteczka H₂O oprócz elektronów potrzebne są 2 H⁺ ze środowiska.

FOSFORYLACJA OKSYDACYJNA

W jaki sposób reakcje te są sprzężone? W jaki sposób energia swobodna uzyskana z utleniania zredukowanych związków organicznych może być wykorzystana do syntezy ATP?

Hipoteza sprzężenia chemicznego Hipoteza sprzężenia konformacyjnego

hipotezy historyczne

Figure 14-14. Ogólny mechanizm fosforylacji oksydacyjnej. (A) Gdy elektron o wysokiej energii przechodzi wzdłuż łańcucha transportu elektronów, część uwalnianej energii zostaje użyta do pompowania H⁺ z matriks przez trzy kompleksy enzymów oddechowych. Powstały w poprzek wewnętrznej błony elektrochemiczny gradient protonowy kieruje H⁺ z powrotem poprzez syntazę ATP, transbłonowy kompleks białkowy, który energię przepływu H⁺ użyta w matriks do syntezy ATP z ADP i P_i (B) Mikrofotografia elektronowa.

1961, Peter Mitchel (brytyjski biochemik):

TEORIA SPRZĘŻENIA CHEMICZNO-OSMOTYCZNEGO

= TEORIA CHEMIOSMOTYCZNA

(1961, Nagroda Nobla w 1978)

1. W wyniku szczególnego przestrzennego uorganizowania przenośników elektronów w błonie mitochondrialnej następuje „pompowanie” protonów z matriks mitochondrialnej do przestrzeni międzybłonowej ⇒ następuje względna alkalizacja matriks mitochondrialnej i względne zakwaszenie przestrzeni miedzybłonowej.

2. Wewnętrzna błona mitochondrialna jest zasadniczo nieprzepuszczalna dla protonów. Powstająca różnica stężenia H⁺ między matriks a przestrzenią międzybłonową powoduje powstanie tzw. potencjału błonowego, który jest formą energetycznie bogatą.

Figure 14-13. Dwa składniki elektrochemicznego gradientu protonowego wytworzonego w poprzek wewnętrznej błony mitochondrialnej. Całkowity gradient elektrochemiczny H⁺ istniejący w poprzek wewnętrznej błony mitochondrialnej składa się z dużej siły wynikającej z potencjału błonowego i mniejszej siły wynikającej z gradientu stężeń H⁺. Obie siły razem tworzą całkowitą siłę protonomotoryczną, która wywiera presję na powrót H⁺ do matriks.

3. ATP powstaje z ADP i P_i na koszt tego potencjału.

4. Za syntezę ATP odpowiada specyficzny enzym występujący w błonie mitochondrialnej, tzw. F₀F₁-ATP-aza (syntaza ATP)*.

Część F₀ tego białka (zbudowana z 3 rodzajów łańcuchów polipeptydowych, wbudowana w wewnętrzną błone mitochondrialną) stanowi kanał protonowy, a część F₁ (zwrócona do matriks mitochondrialnej) katalizuje syntezę ATP na koszt wyrównania potencjału międzybłonowego.

*Po wyizolowaniu enzym ten jest zdolny do hydrolizy ATP do ADP i P_i, dlatego dawniej nazywano go F₀F₁-ATP-azą. Jednak w warunkach biologicznych jest on zdolny do syntezy ATP z ADP i P_i, dlatego dzisiaj nazywa się do syntazą ATP. Nazwa ATP-aza może być w tym przypadku myląca.

Figure 14-10. Krótki przegląd metabolizmu generującego energię w mitochondriach. Pirogronian I kwasy tłuszczowe wchodzą do mitochondriów (dół), są rozkładane do acetylo-CoA, następnie metabolizowane w cyklu kwasu cytrynowego, którego redukuje NAD⁺ do NADH (i FAD⁺ do FADH₂ nie pokazano). Z kolei w procesie fosforylacji oksydacyjnej elektrony o wysokiej energii z NADH (i FADH₂) są przenoszone w wewnętrznej błonie mitochondrialnej wzdłuż łańcucha oddechowego do tlenu (O₂). Ten transport elektronów generuje w poprzek wewnętrznej błony gradient protonowy, który syntaza ATP wykorzystuje do wytwarzania ATP.

13

Prof. dr hab. Zdzisław Wojciechowski

BIOCHEMIA

2004/05

Wykład 2.

---