Spektrometria masowa jest nowoczesną techniką analityczną pozwalającą na dokładny pomiar masy. Od czasu pierwszego doświadczenia, opisanego przez J.J.Thomsona w 1912 roku, MS otworzyła nowe możliwości w naukach biologicznych, stając się wygodnym narzędziem, dzięki któremu możemy uzyskać szereg istotnych informacji o badanych substancjach. Wysokorozdzielcze aparaty umożliwiają wyznaczenie masy cząsteczkowej z dokładnością do 4 miejsca po przecinku dla związków o masie do ok. 1000 Da, (w przypadku cyklotronowego rezonansu jądrowego z transformacją Fouriera (FTICR) rozdzielczość dla pików o m/z rzędu 1000 sięga nawet miliona) co umożliwia określenie składu elementarnego próbki z rozdzielczością na poziomie jednego elektronu. MS stała się konkurencyjna w stosunku do degradacji Edmana jako metoda sekwencjonowania białek i umożliwia identyfikację modyfikacji posttranslacyjnych, czy analizę związków endogennych występujących w bardzo niskich stężeniach. Technikami uzupełniającymi dla MS są elektroforeza kapilarna (CZE) oraz wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC). Stosowanie tych metod sprzężonych ze spektrometrem dostarcza dodatkowych informacji i umożliwia identyfikację związków na jeszcze niższym poziomie stężeń. 
MS znajduje również zastosowanie w dziedzinach takich jak ochrona środowiska, kontrola antydopingowa, farmakologia, diagnostyka medyczna, biotechnologii czy ostatnio dynamicznie się rozwijającej proteomice czyli badaniach nad identyfikacją proteomu. (PROTEin complement of the genOME - białkowa składowa kodowana przez genom).

Podstawowe definicje				Najczęściej stosowane skróty
Spektrometr masowy - instrument pozwalający na precyzyjny pomiar stosunku masy do ładunku (m/z) analizowanych substancji.				EI (Electron Impact) - jonizacja elektronami MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization) - jonizacja laserem wspomagana matrycą FTICR (Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance) - cyklotronowy rezonans jonowy z transformacją  Fouriera ESI (Electrospray Ionization) - jonizacja przez rozpylanie w polu elektrycznym HPLC (High Performance Liquid Chromatography) - wysokosprawna chromatografia cieczowa) MS/MS (Tandem Mass Spectrometry) - tandemowa spektrometria masowa TOF  (Time of Flight Analyser) - analizator czasu przelotu PSD (Post Source Decay) - rozpad poza źródłem jonów m/z - stosunek wartości masy do liczby ładunków DIOS (Desorption/Ionization on Porous Silicon) - desorpcja/jonizacja na porowatym krzemie ICP  (Inductively Coupled Plasma) - jonizacja plazmą wzbudzoną indukcyjnie
Rozdzielczość spektrometru - wartość liczbowa informująca o możliwości rozróżnienia na widmie masowym pików o zbliżonych masach. W przypadku pojedynczego piku wartość określająca dokładność oznaczenia masy cząsteczkowej (atomowej) substancji analizowanej. Jeśli spektrometr masowy w danym momencie analizy posiada rozdzielczość R=1000 istnieje możliwość rozróżnienia pików o m/z=1000 oraz m/z=1001. Dla izolowanego piku rozdzielczość definiuje jego szerokość połówkową, tzn. dla R=1000 i piku o m/z=1000 stosunek jego wysokości do szerokości w 0,5 wysokości wynosi co najmniej 10 (H/L0,5h>=10)
Jon molekularny - jon obdarzony ładunkiem (ładunkami) powstający w wyniku fragmentacji próbki w źródle jonów
Jon fragmentacyjny - jon powstały w wyniku spontanicznej fragmentacji substancji (np. podczas jonizacji metodą EI) lub uzyskany techniką tandemowej spektrometrii masowej. Dostarcza informacji o strukturze substancji analizowanej.
Addukt - jon powstały poprzez przyłączenie do analizowanej substancji np. jonu sodowego
Proteom - PROTEin complement of the genOME (ogół białek kodowanych przez genom)
Genom - całość informacji genetycznej komórki
Pułapka jonowa - typ analizatora stosowany w spektrometrii masowej, często umożliwiający sekwencyjną fragmentację MSn
Mapa peptydowa - zbiór peptydów powstały w wyniku proteolizy białka z zastosowaniem enzymów o ściśle zdefiniowanej swoistości. Jest jego „odciskiem palca” (fingerprint) i służy do identyfikacji białek.
Dalton - jednostka masy, dokładnie odpowiada 1,0000 na skali mas atomowych
Dekonwolucja - uzyskanie rzeczywistej masy substancji z widma pików wielokrotnie zjonizowanych
Matryca - niskocząsteczkowe związki organiczne absorbujące promieniowanie lasera.
Derywatyzacja - przeprowadzenie trudno lotnych związków w ich lotne i trwałe pochodne (dla celów GC i GC/MS)

Zasada działania spektrometru masowego   Podstawą działania każdego spektrometru, bez względu na konstrukcję, jest jonizacja cząsteczek badanej substancji, co umożliwia przyspieszenie jej w polu elektrycznym w próżni. Jonizację próbki można przeprowadzić za pomocą jednej z metod wymienionych w dalszej części opracowania. Heterogeniczny strumień jonów (dodatnich lub ujemnych) zostaje rozdzielony na szereg składowych, zależnie od stosunku masy do ładunku (m/z). W przypadku jonów naładowanych dodatnio, masa próbki mierzona w spektrometrze jest powiększona o masę protonu lub protonów przyłączonych do cząsteczki analizowanej substancji. Dla jonów naładowanych ujemnie masa próbki pomniejszona jest o masę protonu lub protonów oderwanych od cząsteczki analizowanej substancji. Jonizacja elektronami (EI) jest tu wyjątkiem i metoda ta powoduje jedynie wybicie elektronu bez przyłączania protonu. Istnieje możliwość oznaczenia m/z substancji nie jonizujących się poprzez dołączenie (reakcja chemiczna lub oddziaływanie fizyczne) podstawnika obdarzonego ładunkiem lub podlegającego jonizacji (tzw. derywatyzacja) lub poprzez utworzenie adduktów np. z sodem lub potasem.

Budowa spektrometru masowego   Każdy spektrometr masowy składa się z pewnych niezbędnych podzespołów, niezależnych od typu instrumentu czy sposobu jego wykorzystania. Konstrukcję spektrometru przedstawiono za pomocą ogólnego schematu blokowego.

układ wprowadzania próbki

źródło jonów

analizator jonów

detektor jonów

analiza danych

Układ wprowadzania próbki Poszczególne układy różnią się zależnie od stanu skupienia analizowanej próbki jak również metody jonizacji zastosowanej do analizy:  stan stały - sondy z probówką, płytki (jonizacja typu EI, MALDI) stan ciekły - zawory wstrzykowe, pompy strzykawkowe, systemy HPLC, FPLC, systemy elektroforezy kapilarnej (jonizacja typu ESI, MALDI) stan gazowy - układy chromatografii GC, komory próżniowe, systemy strzykawek gazoszczelnych (jonizacja typu EI, CI, ICP)

Źródła jonów - metody jonizacji próbki Electron impact (EI) Historycznie pierwsze i dotychczas najbardziej rozpowszechnione źródło jonów. Jego integralnym elementem jest katoda (filament). Po przyłożeniu napięcia emituje elektrony o ściśle określonej energii, które zderzając się z cząsteczkami próbki wybijają elektron lub elektrony z ich orbit walencyjnych.  Najczęściej stosowany zakres analizy: 10-1000 Da. Cząsteczki o wyższych masach ulegają łatwo dekompozycji przy stosowaniu jonizacji typu EI. W takich przypadkach należy rozważyć użycie innej techniki jonizacji.  Najczęściej analizowane próbki: niskocząsteczkowe, nieorganiczne, organiczne w postaci stałej. Zastosowania: potwierdzanie masy cząsteczkowej substancji po syntezie, ochrona środowiska (analiza niskocząsteczkowych zanieczyszczeń), nadzór prawidłowości procesów technologicznych, kontrola antydopingowa. Postać wyników: piki obserwowane na widmie masowym posiadają zazwyczaj ładunek +1. W przypadku niskorozdzielczej analizy typu EI masa cząsteczkowa próbki jest zazwyczaj równa m/z. Jonizacja chemiczna (CI) Metoda jonizacji “łagodniejsza” w porównaniu do EI, tzn. daje możliwość uzyskania jonu molekularnego o większej intensywności w porównaniu do jonów fragmentacyjnych niż w metodzie EI. Jonizacja substancji następuje na skutek zderzeń z tzw. jonami pierwotnymi występującymi w źródle jonów (najczęściej są to jony gazów obojętnych, metanu, izobutanu, amoniaku). Aby zderzenia pomiędzy analitem i jonami pierwotnymi zachodziły wystarczająco często, w źródle jonów typu CI należy wytworzyć ciśnienie około 60 Pa.  Najczęściej stosowany zakres analizy: 10 - 3000 Da. Najczęściej analizowane próbki: niskocząsteczkowe nieorganiczne i organiczne w postaci stałej. Zastosowania: detekcja w chromatografii gazowej, farmakologia, kontrola antydopingowa, ochrona środowiska (np. analiza TCDD, PCB). Postać wyników: jonizacja następuje zazwyczaj poprzez przyłączenie protonu (-ów) do analizowanych cząsteczek co należy uwzględnić podczas obliczania rzeczywistej masy analitu (dla z=+1 m/z = M-1).

Electrospray (ESI) Electrospray to jedna z nowszych metod jonizacji próbki w spektrometrii masowej. Próbka ulega jonizacji pod ciśnieniem atmosferycznym przy użyciu napięcia rzędu 2000-5000V.  Podstawowe zalety metody to:  minimalna fragmentacja próbki podczas jonizacji, wysoka czułość oznaczeń, kompatybilność z technikami chromatograficznymi (HPLC) oraz elektroforetycznymi (CE), możliwość analizy dużych cząsteczek  (do ok. 80 000 Da).

Cechą charakterystyczną widm masowych ESI są serie pików odpowiadających kolejnym, wielokrotnie naładowanym, protonowanym jonom [M+zH]^z+, [M+(z+1)H]^(z+1)+, itd. Powyższe zjawisko umożliwia analizowanie mas znacznie większych niż nominalny zakres pomiarowy analizatora przy zachowaniu stosunkowo wysokiej rozdzielczości, np. związek o masie 5000 Da po przyłączeniu 5 protonów będzie obserwowany przy m/z=1001 ([5000 + 5]/5=1001). W celu transformacji widma jonów wielokrotnie zjonizowanych do masy rzeczywistej (dekonwolucja) stosuje się oddzielny program komputerowy. Najczęściej stosowany zakres analizy: 50 - 80 000 Da. Najczęściej analizowane próbki: średnio- i wysokocząsteczowe substancje organiczne, peptydy, białka, polimery, kwasy nukleinowe w postaci ciekłej. Zastosowania: biochemia, biotechnologia, farmakologia, neurochemia, medycyna sądowa, detekcja w chromatografii cieczowej. Postać wyników: serie pików o różnej ilości przyłączonych/oderwanych protonów. M = (m-nz)/nz dla z+.   MALDI (desorpcja/jonizacja laserowa w matrycy) W metodzie MALDI analizowaną substancję jonizuje się po jej uprzednim zmieszaniu z roztworem matrycy (małe cząsteczki organiczne silnie absorbujące promieniowanie przy stosowanej długości fali lasera). Po odparowaniu rozpuszczalnika próbkę naświetla się impulsami lasera, co powoduje wzbudzenie elektronów w matrycy. Jony, utworzone przez przeniesienie protonu między wzbudzoną matrycą a analizowaną substancją, ulegają następnie desorpcji. Jedną z zalet metody jest możliwość analizowania substancji o masach nawet do 1 000 000 Da.  Zakres analizy: 500-1 000 000 Da Najczęściej analizowane próbki: średnio- i wysokocząsteczowe substancje organiczne, peptydy, białka, polimery, kwasy nukleinowe Zastosowania: biochemia, biotechnologia, farmakologia, neurochemia, immunologia Postać wyników: zazwyczaj jonizacja +1, rzadziej +2, możliwość obserwacji niekowalencyjnych kompleksów

Połączenie wysokosprawnej chromatografii cieczowej ze spektrometrią masową Połączenie wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC) ze spektrometrią masową łączy zalety obu technik. Podstawowe zalety: zwiększona czułość analizy (próbka zagęszczona na kolumnie chromatograficznej, unikanie strat związanych z przenoszeniem próbki), duża oszczędność analizowanego materiału, bezpośrednia analiza skomplikowanych mieszanin, niewielkie zużycie eluentów ze względu na specyfikę stosowanych kolumn chromatograficznych.

Tandemowa spektrometria masowa (MS/MS) Tandemowa spektrometria masowa to technika analityczna pozwalająca na określanie struktury badanego związku. Strukturę identyfikuje się na podstawie jonów fragmentacyjnych, które są charakterystyczne dla danego związku lub grupy związków. Fragmentacyjne widma masowe mogą dostarczyć wielu informacji o budowie badanego związku a także o sekwencji białka. W praktyce metoda MS/MS polega na tym, iż z widma masowego selekcjonuje się wybrany jon (najczęściej jon molekularny). Jon ten poddawany jest kolizjom (następuje jego zderzenie z wprowadzonym gazem obojętnym). Na skutek zderzeń jon macierzysty (parent ion) rozpada się na jony fragmentacyjne (daughter ions). Do przeprowadzania eksperymentów MS/MS znakomicie nadają się spektrometry wyposażone w pułapkę jonów pełniącą rolę analizatora i detektora. Za pomocą tego typu instrumentów można przeprowadzać analizy MSn (gdzie n = 2,3 ....ok. 9), co wydatnie zwiększa możliwość identyfikacji próbek.

Wyposażenie laboratorium

MALDI TOF MS Spektrometr masowy Bruker-Saxonia Reflex IV  (Leipzig, Niemcy) z analizatorem czasu przelotu jonów (TOF) wyposażony w laser azotowy (337 nm) ( fot. u góry strony) EI MS/ESI MS Wysokorozdzielczy, dwusektorowy spektrometr masowy Finnigan MAT 95S (Brema, Niemcy) z analizatorami: magnetycznym i elektrostatycznym w odwróconej geometrii. Źródła jonów: EI, ESI liniowe. Możliwość przyłączenia chromatografu gazowego z jonizacją EI lub chromatografu cieczowego z jonizacją ESI. Spektrometr masowy Bruker Esquire 3000 (Leipzig, Niemcy) z pułapką jonów. Możliwość prowadzenia analiz MS10, oraz połączenia z kapilarnym chromatografem cieczowym (fot. obok).

Przykładowe analizy Widmo ESI nieznanego białka (po lewej). Białko strawiono trypsyną a masy cząsteczkowe powstających w wyniku proteolizy peptydów zostały oznaczone przy pomocy spektrometru masowego Bruker Esquire 3000 (widmo po prawej). Po analizie widma mapy peptydów z wykorzystaniem internetowych baz danych, zidentyfikowano nieznane białko jako wołową rybonukleazę A.   Widmo MALDI TOF peptydu o sekwencji YPFPGPI. Pik o m/z 790.41 odpowiada jonowi molekularnemu peptydu, natomiast piki przy m/z 812.42 i 828.41 to kolejno jego addukty: sodowy i potasowy.    Widmo MALDI TOF mioglobiny końskiej (po lewej) i jej mapy peptydowej powstałej w wyniku trawienia trypsyną (po prawej).   Widmo ESI serotransferyny ludzkiej. Na widmie po lewej widoczna grupa wielokrotnie zjonizowanych pików pochodzących od białka, po prawej widmo dekonwolucyjne, określające rzeczywistą masę cząsteczkową transferyny (79 550 Da).   Typowe widmo EI cząsteczki organicznej. Widoczny jon molekularny o m/z 219,0 oraz jony fragmentacyjne o niższych m/z.

---