275 (2)

Pobiera się od badanych ptaków po 8—10 piór z wewnętrznej powierzchni skrzydła i używa bezpośrednio do badania lub przechowuje, trzymając nawet trzy dni w temperaturze pokojowej.

Sporządza się 0,7% roztwór agarozy (NBC Ohio) w 0,1 M PBS o pH 7,2 z 8% NaCl lub w niebuforowanym 8% NaCl. Agarozę rozpuszcza się

1    utrzymuje w temperaturze 56"C; można dodać do niej 0,01% mer-liolatu.

Do agarozy dodaje się odpowiednią ilość ogrzanej do 56’C surowicy dodatniej. To trzeba określić uprzednio, badając jej seryjne rozcieńczenia wobec znanego antygenu zwykle używa się jej w rozcieńczeniu 1: 10—1 :25 w żelu. Po dokładnym wymieszaniu składników, ogrzaną pipetą rozlewa sic agarozę z surowicą na płytki.

Po skrzepnięciu podłoża używa się je bezpośrednio do odczynu lub przechowuje najwyżej trzy dni w komorze wilgotnej w temperaturze pokojowej.

Odcina sic około 0,5 cm każdego distalnego końca pióra i przy użyciu gładkiej pęsety delikatnie zanurza je w agarozie. Zwykle bada się 8 piór od każdego ptaka, a najwyżej 16 (od dwu) na jednej płytce. Używa się takiego szablonu, aby odstępy między poszczególnymi dudkami wynosiły około 8 mm. W każdej płytce wycina się dodatkowo zagłębienie średnicy

2    mm i wypełnia je wyciągiem kontrolnego dodatniego antygenu sporządzonego z dudek piór ptaków zakażonych.

Płytki umieszcza się w komorze wilgotnej, w temperaturze pokojowej, i ogląda co godzinę — w przypadku pozytywnym stwierdza się pierścienie precypitacji już po 1— 2 godzinach, lecz ostateczny odczyt wykonuje się następnego dnia, a ułatwia go uprzednie usunięcie dudek piór.

Odczyn wiązania dopełniacza, przy użyciu znanej dodatniej surowicy królików, również umożliwia wykazanie antygenów wirusa w badanym materiale.

Z uwagi na charakter wirusa choroby Mareka (ścisłe jego związanie z komórką) inokulum używane zarówno do próby biologicznej, jak też do zakażania zarodków kurzych i hodowli komórek, stanowi najczęściej zawiesina komórek badanego narządu, guza lub pełna krew. Wyjątek stanowi pozakomórkowy wirus występujący w skórze i brodawkach piór.

Komórki guza lub narządu otrzymuje się przez trypsynowanie (0.25% trypsyna Difco) w 37^rC i płukanie w PBS. Po oznaczeniu liczby komórek sporządza się odpowiednią ich zawiesinę, co najmniej 10⁵ komórek na dawkę, w płynie 199 Parkera z 200—500 j.m. penicyliny i tyleż pg streptomycyny na 1 ml. Komórki takie można przechowywać z dodatkiem 7.5% DMSO w stanie zamrożonym w temperaturze płynnego azotu.

Krew pobiera się najlepiej przez punkcję serca strzykawką 4 części krwi na 1 część 3,8% roztworu cytrynianu sodu.

Próba biologiczna. Najbardziej wrażliwe na zakażenie są jednodniowe pisklęta, nic posiadające przeciwciał matczynych dla wirusa i pochodzące z linii o dużej genetycznej wrażliwości na wirus choroby Mareka, jak na przykład linie Corncll S. HPRS—RIR lub Athens-Canadian. Pisklęta inokuluje się dootrzewnowo lub podskórnie, używając zwykle 4—10 ptaków obojga płci. Czas oceny reakcji wynosi: dla wykazania antygenów w skórze i zmian mikroskopowych — 3 tygodnie; zmian makroskopowych — ó—8 tygodni; przeciwciał — 4—8 tygodni. Objawy chorobowe wyrażają się różnym stopniem nasilenia. Charakterystyczne objawy to niedowłady, porażenia nóg, skrzydeł, szyi, wola, zaburzenia funkcji przewodu pokarmowego, zmiany oczne i wychudzenie.

Antygeny w skórze wykrywa się odczynem precypitacji w żelu i IF, najlepiej w mrożonych skrawkach. Ta identyfikacja serologiczna jest konieczna, gdyż z jednej strony występujące w przyrodzie szczepy o niskiej patogenności mogą powodować zbyt słabe zmiany, a z drugiej antygenowo niespokrewnione wirusy białaczek drobiu i retykuloen-doteliozy (szczep T) mogą powodować zmiany bardzo podobne do stwierdzonych przy chorobie Maroka.

Zakażanie zarodków kurzych. Wprowadzona przez. von Btilowa metoda dożółtkowego zakażania znalazła powszechne zastosowanie jako prosty, tani i czuły sposób izolacji wirusa. Zarodki 4-dniowe zakaża się dożółtkowo, używając zwykle 12 jaj. tak aby mieć pewność, że przynajmniej 8 z nich można będzie ocenić po 12—14-dniowej obserwacji. Materiał badany wprowadza się igłą pionowo przez komorę powietrzną jaja na głębokość 24—30 mm, w zależności od jego wielkości. Jest to bardzo ważne dla uniknięcia przypadkowej inokulacji błony kosmów-kowo-omcczniowcj (BK O), co mogłoby spowodować reakcję „przeszczep przeciw biorcy” — GVH (graft versus host), gdyż przy tym zakażaniu wprowadza się przecież do jaja najczęściej żywe obce komórki.

Jaja inkubuje się w pozycji pionowej, bez ich obracania, przez 9—14 dni w temperaturze 38°C. Zarodki obumarłe przed 9 dniem odrzuca się. Zwykle bada się zarodki w 12 dniu po zakażeniu, mimo że pierwsze zmiany swoiste dla wirusa choroby Maroka można stwierdzić już po

275