325 (3)

miast fluoryzujących ciałek wewnętrznych. Odróżnienie jasnozielonej fluorescencji antygenu wściekłiznowego od innych nieswoistych barwnych efektów jest na ogół łatwe. Te ostatnie obserwuje się jako jasno świecące żółte, brązowe lub białe ogniska autofluorescencji kształtu nieregularnych cząstek. Stwierdza się jednak czasem również jasnozielone fluoresccncjc nieswoiste w następstwie barwienia się koniugatem bakterii kulistych i pałeczkowatych oraz innych nie określonych cząstek. Decydujące znaczenie dla oceny preparatu ma dokładna obserwacja kontroli (omówiono je szczegółowo w części ogólnej, na str. 42).

Próba biologiczna. Stanowi ona najpewniejszą (około 98% pewności) metodę diagnostyczną przy wściekliźnie, jednak dużą jej wadą jest długi okres wymagany dla uzyskania miarodajnych wyników. Otrzymuje się je zbyt późno, aby to miało jakiś wpływ na decyzję o rozpoczęciu, a nawet przerwaniu szczepienia osób pokąsanych. Natomiast znaczenie jej jest duże dla celów epizootiologicznych i dlatego w każdym przypadku ujemnego wyniku badania na obecność ciałek Negriego należy ją wykonać. Przy otrzymaniu * materiału w glicerolu ważne jest przed sporządzeniem zawiesiny dokładne opłukanie go w płynie fizjologicznym. Najczęściej używane do próby są białe myszy w wieku 3 4 tygodni, o masie 8    12 g. Wprowadza się im, w lekkiej narkozie eterowej, badaną

zawiesinę (w ilości 0,03 ml) domózgowo. Wskazane jest używanie większej liczby zwierząt, co najmniej 6 na każdy badany materiał, zwłaszcza jeżeli zamierza się część ich zabijać we wcześniejszym okresie obserwacji dla uzyskania szybszego rozpoznania.

Okres obserwacji wynosi na ogół 30 dni, jednak objawy chorobowe mogą wystąpić po okresie dłuższym jeszcze o kilka dni. Śmierć zwierząt w 1—3 dni po inokulacji uważana jest za wynik działania urazu lub zakażenia bakteryjnego. Okres inkubacji trwa zwykle 10—14 dni, ale czasem — tylko 5 dni. Pierwsze objawy są nietypowe dla zakażenia wirusem ncurotropowym (posmutnienie, nastroszenie sierści), później stwierdza się niedowłady tylnych kończyn i porażenia. Jednakże samo stwierdzenie nawet typowego obrazu klinicznego nie upoważnia do postawienia rozpoznania. Sam bowiem zabieg domózgowego wprowadzenia materiału może wywołać uczynnienie procesu utajonego zakażenia, na przykład wirusem mysiego zapalenia mózgu. To ostatnie występuje jednak zwykle wcześniej, w 2—3 dni po inokulacji. Wynik kliniczny badania biologicznego musi być poparty stwierdzeniem ciałek wtrętowych lub dodatnim odczynem TF u myszy padłych lub — lepiej -- zabitych w agonalnym okresie choroby, gdyż odszukanie rogu Ammona trudniejsze jest u myszy padłych, zwłaszcza jeżeli nic sekcjo-nowano ich tuż po śmierci. U myszy ciałka Ncgriego pojawiają się stosunkowo szybko w przebiegu zakażenia i dlatego, w przypadku pośpiechu i przy użyciu większej liczby zwierząt do inokulacji, można po 1 lub kilka z nich zabijać co parę dni (poczynając od 5 dnia) i badać materiał mikroskopowo.

Dodatni wynik próby biologicznej, poparty stwierdzeniem obecności ciałek Negriego, pozwala uzyskać absolutną pewność diagnostyczną. Również wykazanie ciałek Ncgriego bez stwierdzenia objawów chorobowych u inokulowanych myszy stanowi wynik dodatni. Natomiast ujemny wynik badania mikroskopowego nie wyklucza zakażenia z całą pewnością. Znane są przypadki uzyskiwania ujemnego wyniku próby biologicznej. mimo wykazania w nadesłanym do badania materiale ciałek Negriego. Tłumaczy się to procesami autosterylizacji wirusa, a także uszkadzającym działaniem czynników zewnętrznych, takich jak: wysoka temperatura, długi transport, gnicie i wysychanie. Może tu też odgrywać rolę zjawisko interferencji cząstek zakaźnych przez cząstki nieaktywne, przy użyciu do inokulacji niedostatecznie rozcieńczonego materiału badanego.

W mózgu i śliniankach lisów oraz skunksów padłych wskutek wścieklizny stwierdzono obecność substancji RIS (rabies inhibiting sub-stancc — substancja hamująca wściekliznę), która znosi zakaźność wirusa, a tym samym uniemożliwia uzyskanie pewnego rozpoznania u wymienionych zwierząt metodą domózgowego zakażenia myszy. Obecność tej substancji w badanym materiale nie przeszkadza w wykrywaniu antygenu wirusowego metodą immunofluorescencji i ten ostatni sposób jest u skunksów i lisów najczulszą metodą diagnostyczną.

Próbę biologiczną można też wykonać na królikach, z uwagi jednak na znacznie dłuższy okres obserwacji (3 miesiące), a także większy koszt, rzadko używa się tych zwierząt.

Identyfikację serologiczną uzyskuje się w odczynie zobojętnienia, najczęściej metodą rozcieńczeń badanego wirusa przy stałej dawce surowicy dodatniej lub swoistej gammaglobuliny. Mieszaniny składników' inkubuje się w 37'C przez 1 godzinę. Użycie przeciw-ciał mono-klonalnych umożliwia precyzyjną identyfikację izolowanego wirusa (m. in. różnicowanie szczepów dzikich i szczepionkowych).

Hodowle komórek wykazały w badaniach Webstera dużą przydatność do szybkiego wykrywania wirusa w próbkach mózgu. Sporządza

325